DE19956686A1 - Neue für die Gene sucC und sucD codierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für die Gene sucC und sucD codierende NukleotidsequenzenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft für die Gene sucC und sucD codierende Polynukleotide, die Polynukleotidsequenzen enthalten, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält, DOLLAR A c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, DOLLAR A d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3, DOLLAR A e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d), und DOLLAR A e) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d) oder e), DOLLAR A ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen die Gene abgeschwächt vorliegen und die Verwendung der Polynukleotidsequenzen als Hybridisierungssonden.
Description
Gegenstand der Erfindung sind für die Gene sucC und sucD
kodierenden Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien
und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, durch Abschwächung des
sucC- und/oder sucD-Gens.
L-Aminosäuren, insbesondere Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der
großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensbesserungen können
fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rührung und
Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der
Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der
Fermentation oder die Aufarbeitung zur Produktform durch
z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph
für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die
Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von
L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium
eingesetzt.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
L-Aminosäuren, insbesondere Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung Anwendung. Es besteht daher ein allgemeines
Interesse daran, neue verbesserte Verfahren zur Herstellung
von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid,
enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der
Gruppe
- - Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- - Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
- - Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- - Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
- - Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d), und
- - Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d) oder e).
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das Polynukleotid
gemäß Anspruch 1, wobei es sich bevorzugt um eine
replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
Weitere Gegenstände sind
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 4, enthaltend die Nukleo tidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt,
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, in denen das sucC und/oder sucD-Gen abgeschwächt wird.
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 4, enthaltend die Nukleo tidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt,
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, in denen das sucC und/oder sucD-Gen abgeschwächt wird.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank, die das vollständige sucC-
und/oder sucD-Gen mit der Polynukleotidsequenz entsprechend
SEQ ID No. 1 enthalten mit einer Sonde, die die Sequenz des
genannten Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein
Fragment davon enthält und Isolierung der genannten DNA-
Sequenz.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind geeignet
als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA, um cDNA
in voller Länge zu isolieren, die für Succinyl-CoA
Synthetase codieren und solche cDNA oder Gene zu isolieren,
die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der der
Succinyl-CoA Synthetase Gene aufweisen.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind weiterhin
als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase
Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann,
die für Succinyl-CoA Synthetase codieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide
enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz
besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit
einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen die Polypeptide
gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3, insbesondere solche
mit der biologischen Aktivität der Succinyl-CoA Synthetase
und auch solche ein, die zu wenigstens 70% identisch sind
mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3,
bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90%
bis 95% Identität mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2
oder SEQ ID No. 3 und die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere
Lysin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die
insbesondere bereits die Aminosäuren insbesondere L-Lysin
produzieren und in denen die für das sucC- und/oder
sucD-Gen codierenden Nukleotidsequenzen abgeschwächt,
insbesondere auf niedrigem Niveau exprimiert werden.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder
Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können Aminosäuren, insbesondere Lysin, aus
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse,
Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen.
Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien
insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der
Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt
für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme,
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5714.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme,
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5714.
Den Erfindern gelang es, die beiden neuen, für das Enzym
Succinyl-CoA Synthetase (EC 6.2.1.5) kodierenden Gene sucC
und sucD von C. glutamicum zu isolieren.
Zur Isolierung des sucC- und/oder des sucD-Gens oder auch
anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank
dieses Mikroorganismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von
Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das
Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in
die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland,
1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die
des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell
50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe
et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996)
beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). O'Donohue (The Cloning
and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid
Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph. D.
Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997)
beschreibt die Klonierung von C. glutamicum Genen unter
Verwendung des von Short et al. (Nucleic Acids Research,
16: 7583) beschriebenen λ Zap Expressionssystems.
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli
können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences.,
25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene,
19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich
besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm
DH5α (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial
Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbour Laboratory
Press, 1992).
Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren
klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend
wiederum in gängige, für die DNA-Sequenzierung geeignete
Vektoren subkloniert werden.
Methoden zur DNA-Sequenzierung sind unter anderem bei
Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467,
1977) beschrieben.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten
Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von
Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem GCG-
Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39,
74-97 (1998)) dem FASTA-Algorithmus von Pearson und Lipman
(Proceedings of the National Academy of Sciences USA
85, 2444-2448 (1988)) oder dem BLAST-Algorithmus von
Altschul et al. (Nature Genetics 6, 119-129 (1994))
untersucht und mit den in öffentlich zugänglichen
Datenbanken vorhandenen Sequenzeinträgen verglichen werden.
Öffentlich zugängliche Datenbanken für Nukleotidsequenzen
sind beispielsweise die der European Molecular Biologies
Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland) oder die des
National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, USA).
Auf diese Weise wurde die neue für das sucC- und sucD-Gen
kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als
SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist.
Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den
oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz der
entsprechenden Proteine abgeleitet. In SEQ ID No. 2 und SEQ
ID No. 3 sind die sich ergebenden Aminosäuresequenzen des
sucC- und des sucD Genproduktes dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung.
Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung,
die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter
Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ
ID No. 1 ergeben.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-
Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait:
Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press,
Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Die Erfinder fanden heraus, daß coryneforme Bakterien nach
Abschwächung des sucC- und/oder sucD-Gens in verbesserter
Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, produzieren.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die
Expression des sucC- und/oder sucD-Gens oder die
katalytischen Eigenschaften der Enzymproteine herabgesetzt
oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide
Maßnahmen kombiniert werden.
Die Erniedrigung der Genexpression kann durch geeignete
Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation)
der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise
Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und
Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in
der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und
Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), bei Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996))
und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene
und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al.
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762
(1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus
Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen
Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des
Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen (missense
mutations) oder Nichtsinnmutationen (nonsense mutations)
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen (frame shift mutations), in
deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die
Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung
derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu
mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung
(gene disruption) und des Gen-Austauschs (gene
replacement).
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler
Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen
Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als
Vektoren kommen bespielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob
(Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder
pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174:
5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI;
USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al.,
Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder
pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das
zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird
anschließend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode
der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))
beschrieben. Methoden zur Transformation sind
beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses
wird die Kodierregion des betreffenden Gens
durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei
unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das
5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von
Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C.
glutamicum verwendet. Das sucC- und/oder sucD-Gen können
auf diese Weise ausgeschaltet werden.
Bei der Methode des Genaustausches (gene replacement) wird
eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder
Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro
hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen
für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und
dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation
in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration
bewirkenden "cross over"-Ereignisses und eines geeigneten
zweiten, eine Excision bewirkenden "cross over"-Ereignisses
im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau
der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde
beispielsweise von Peters-Wendisch (Microbiology 144,
915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum
durch eine Deletion auszuschalten. In das sucC- und/oder
sucD-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder
ein Basenaustausch eingebaut werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur
Abschwächung des sucC- und/oder sucD-Gens eines oder
mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der
Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus oder
des Aminosäure-Exports zu verstärken, insbesondere zu
überexprimieren.
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin
- - gleichzeitig das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen (EP-B 0 I97 335), oder
- - gleichzeitig das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - gleichzeitig das für die Pyruvat Carboxylase codierende pyc-Gen(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - gleichzeitig das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), oder
- - gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen (DE-A-195 48 222)
überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der
Abschwächung des sucC- und/oder sucD-Gens unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino
Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.),
Academic Press, London, UK, 1982).
Die das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 enthaltenden
Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und
können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch
(Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, kultiviert werden.
Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden
sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und
Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und
Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und
Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und
organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet
werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff
haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser,
Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen
wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die
Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung
verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten
wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des
gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird
normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden
erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem
Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei
Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit
anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie
kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)
beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell
gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem
Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04)
gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA
wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der
Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.
27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend
mit Hilfe des Cigapack II XL Packing Extracts (Stratagene,
La Jolla, USA, Produktbeschreibung Cigapack II XL Packing
Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion
des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Res. 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO4
aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension
vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie
bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory
Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei
die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit
100 µg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation
über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone
selektioniert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No.
27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach
gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung
der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp
mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021,
Qiagen, Hilden, Germany). Die DNA des Sequenziervektors
pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen,
Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning
Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04)
gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den
Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit
T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über
Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde
anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A.,
87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox,
1955, Virology, 1: 190) mit 50 µg/ml Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit
dem Biorobot 9600, (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,
Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-
Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings
of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467)
mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic
Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin
Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied
Biosystems(Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland)
verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und
Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem
"Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29: 1) (Product
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism
377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wurden mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.
Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search programs"
(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-
3402), gegen die non-redundant Datenbank des "National
Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD,
USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein
offenes Leseraster von 1206 Basenpaaren, welches als
sucC-Gen bezeichnet wurde, sowie ein offenes Leseraster von 882
Basenpaaren, welches als sucD bezeichnet wurde. Das sucC-Gen
kodiert für ein Polypeptid von 402 Aminosäuren, welches in
SEQ ID No. 2 dargestellt ist. Das sucD-Gen kodiert für ein
Polypeptid von 294 Aminosäuren, welches in SEQ ID No. 3
dargestellt ist.
Claims (14)
1. Isoliertes Polynukleotid, enthaltend eine
Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
- c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
- e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d), und
- f) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenzen von a), b), c), d) oder e).
2. Polynukleotide gemäß Anspruch 1,
wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien
replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotide gemäß Anspruch 1,
wobei das Polynukleotid eine RNA ist.
4. Polynukleotide gemäß Anspruch 2,
enthaltend die Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1
dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2 enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die den Sequenzen (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
6. Coryneforme Bakterien, in denen das sucC- und/oder
sucD-Gen abgeschwächt wird.
7. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin,
dadurch gekennzeichnet,
daß man folgende Schritte durchführt,
- a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Bakterien, in denen man das sucC- und/oder sucD-Gen abschwächt,
- b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolieren der L-Aminosäure.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich
weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten
L-Aminosäure verstärkt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen die
Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet
sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure
verringern.
10. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Expression des (der) Polynukleotids(e),
das(die) für das sucC- bzw. sucD-Gen codiert,
verringert.
11. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die katalytischen Eigenschaften des
Polypeptids (Enzymproteins) herabsetzt, für das die
Polynukleotide sucC und sucD codieren.
12. Verfahren gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man für die Herstellung von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, Bakterien fermentiert, in denen
man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene,
ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 12.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen,
- 2. 12.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen,
- 3. 12.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen,
- 4. 12.4 das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen,
- 5. 12.5 das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen, gleichzeitig überexprimiert oder amplifiziert.
13. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium
glutamicum einsetzt.
14. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um cDNA
zu isolieren, die für Succinyl-CoA Synthase codiert
oder eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz aufweisen,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Polynukleotidsequenzen gemäß Anspruch 1 als
Hybridisierungssonden einsetzt.
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