DE1967020B2

DE1967020B2 - Alpha-amino-(1,4-cyclohexadienyl)- methylpenicillin

Info

Publication number: DE1967020B2
Application number: DE19691967020
Authority: DE
Inventors: Frank L. Titusville N.J.; Dolfini Joseph E. Cincinnati Ohio; Weisenborn (V.StA.); Bach, Georges G., Kaiseraugst (Schweiz)
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1968-07-02
Filing date: 1969-06-23
Publication date: 1977-01-13
Also published as: DE1931722B2; CH518977A; IE32888B1; ES369005A1; AT301020B; FI52093B; MY7300279A; IT1052126B; FR2012156B1; CS157672B2; PL80099B1; BG17331A3; BE735536A; IE32888L; NO134913B; FI52093C; SE397532B; YU124379A; YU34901B; IL32411A0

Description

CH,

und seine Salze mit Säuren oder Basen.

COOH

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise 6-Aminopenicillansäure oder deren reaktionsfähiges Derivat mit 2-Amino-2-(l,4-cyclohexadienyl)-essigsäure oder deren reaktionsfähigem Derivat umsetzt und gegebenenfalls die erhaltene Verbindung mit einer Säure oder Base in ein Salz überführt

3. Arzneimittel mit antibiotischer Wirkung, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1.

Die Erfindung betrifft den in den ^sprächen gekennzeichneten Gegenstand.

Spezielle Beispiele für die Salze mit Basen sind die Alkali- und Erdalkalimetallsalze, wie das Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalz, und die Salze organischer Basen, wie Dibenzylamin, Alkylamine und N,N - Dibenzy läthylendiamin.

Die Salze mit Säuren können sich von anorganischen oder organischen Säuren ableiten. Zu diesen Salzen gehören z. B. Hydrohalogenide, wie das Hydrochlorid, Hydrobromid oder Hydrojodid, das Sulfat, Nitrat, Phosphat oder Borat, und organische Salze, wie das Acetat, Oxalat, Tartrat, Malat, Citrat, Succinat, Benzoat, Ascorbat, oder Methansulfonat. Oft ist es günstig, das Produkt als lösliches oder unlösliches Salz zu isolieren und zu reinigen und dann die freie Verbindung, z. B. durch Neutralisieren, herzustellen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die Aminogruppe der 2-Amino-2-(l,4-cyclohexadieny'.)-essigsäure vor der Umsetzung mit 6-Aminopenici'lansäure (6-APS) vorzugsweise geschützt. Als Schutzgruppen kommen z. B. die Triphenylmethyl-, tert.-Butoxyearbonyl-, ß, ß, /J-Trichlor-äthoxycarbonyl-, 4-Oxo-2-pentenyl-2- oder l-Carbomethoxy-l-propenyI-2-Gruppe in Frage. Dazu wird die 2-Amino-2-(l,4-cyclohexadienyl)-essigsäure beispielsweise mit Triphenylmethylchlorid, tert.-Butylazidoformiat. Chlorameisensäure-ft/JjS-trichloräthylester. Acetylaceton oder Acetessigsäuremethylester umgesetzt. Nach der Umsetzung der geschützten Verbindung mit b-APS wird die Schutzgruppe z. B. durch Behandlung mit wäßriger Essigsäure, Trifluoressigsäure. Zink/Essigsäure oder einer wäßrigen Mineralsäure abgespalten. Die Aminogruppe der 2-Amino-2-(l,4-cyclohexadienyl)-essigsäure kann auch durch Protonierung in die Salzform übergeführt und dadurch vor und während der nachfolgenden Kupplungsreaktion geschützt werden. Die Kupplung wird vorzugsweise so durchgeführt, daß man die 2-Amino-2-(l,4-cyclohexadienyl)-essigsäure in eine aktivierte Form, z. B. in das Chlorid, Bromid, Azid, den p-Nitrophenylester, das Anhydrid, ein gemischtes Anhydrid oder das Leuchssche Anhydrid, überführt oder indem man in Gegenwart eines Carbodiimids, wie Dicyclohexyl-carbodiimid, kondensiert.

Die 2-Aminö-2-(l,4-cyclohexadienyl)-essigsäure wird durch Hydrierung von α-Phenylglycin nach Birch hergestellt.

(X-Amino-(1 ^-cyclohexadienyO-methylpenicillin kann in verschiedenen Solvatationsformen sowie in verschiedenen optisch aktiven Formen vorkommen. Die verschiedenen Formen sowie deren Gemische fallen in den Bereich der Erfindung.

Die Verbindung der Erfindung ist ein Breitspektrum-Antibiotikum mit Wirkung gegen grampositive und gramnegative Keime, wie Staphylococcus aureus. Salmonella schottmuelleri, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Escherichia coli und Streptococcus pyogenes.

Das antibakterielle Wirkungsspektrum der Verbin dung der Erfindung und seine Wirkungsintensität in vitro entsprechen der des «-Aminobenzylpenicillins (Ampicillin), doch zeigt sie bei Pseudomonas aeruginosa eine etwas höhere in vitro-Aktivität als Ampicillin. Nach Internist, Bd. 16 (1975), S. 408, zeichnet sich die Verbindung durch eine niedrigere Allergisierungsrate als Ampicillin aus.

In den nachstehend geschilderten Versuchen wurde die antibiotische Wirkung von D-a-Amino-(l,4-cyclohexadienylj-methylpenicillin (Epicillin; Verbindung A) und D-«-Aminobenzylpenicillin (Ampicillin; Verbindung B) gegenüber verschiedenen Keimen untersucht.

1) Reihenverdünnungstest

Zur Bestimmung der MHK wurden die Verbindungen A und B gegenüber 20 klinisch isolierten Stämmen von Pseudomonas aeruginosa untersucht; vgl. Kavanaugh. Analytical Microbiology, Academic Press, New York (1963), Kapitel 1,3,4 und 6.

Proben der zu untersuchenden Verbindungen werden in sterilem destilliertem Wasser gelöst. Ferner wird eine 18 Stunden alte Kultur des Keims mit BBL als hochwertiger Nährflüssigkeit auf einen Keimgehalt von etwa 10³ Keime pro ml verdünnt. Jeweils 2 ml der beimpften Nährflüssigkeit werden in 13 χ 100 mm große sterile Reagenzgläser abgefüllt. Unterschiedliche Mengen der verdünnten Verbindung werden in 2facher Abstufung jeweils 9 Röhrchen zugesetzt, so daß der Bereich der Arzneistoffverdünnung 1 :20 bis 1 :5 120 beträgt. Das zehnte Röhrchen dient als Wachstumskontrolle. Die Röhrchen werden 16 bis 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben die bei einem wiederholten Versuch erhaltenen Ergebnisse wieder.

Tabelle 1

Keim

Nr.

MHK. y/mi B (Ampicillin)

A (Epicillir:)

Keitr.

Nr.

MHK, j>/ml B (Ampicillin)

A (EpicUlin)

Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeniginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa

3840
8170
8204
8206
8327
8329
8451
8452
8453
8460
8461
8321
8322
8323
8328
8450
8462

_>50

^100 > 100 5100

6,3

_ 25 5100 5100

75

_ 5,5 5100

75 >100

18,7

50

_ 50 5100

(100) (100) (300) (12,5) (12,5) (100) (75) (50) (18,7)

(100) (150)

(50) (JOO)

(50)

Ps. aeruginosa 8463 ,'8.7 (50) 6,3 (25)

Ps. aeruginosa 8464 5100 (100) 50 (25) Ps. aeruginosa 8723 >50

(50) 2) Plattenverdünnungstest

(50) Die MHK der Verbindungen A und B wird gegenüber

37,5 (50) 10 klinisch isolierten Stämmen von Pseudomonas aerugi- 6,3 (18,7) nosa nach Kavanaugh, a.a.0, bestimmt Es werden

(63) Agarplatten hergestellt die in 2facher Abstufung die zu (50) untersuchenden Verbindungen in einer Konzentration 37,5(50) von 4 bis 200 y/ml enthalten. 18 Stunden alte Kulturen (25) 15 der zu untersuchenden Keime werden 1 :10 mit

6.3 (9,4) Agarflüssigkeit für einen Test und 1 :1000 mit Agarflüssigkeit für einen anderen Test verdünnt Nach

(50) dem Erstarren der Agarplatten werden die Keime mit (75) einem 6 ösen enthaltenden Rechen überimpft Platten

(25) 20 ohne Arzneistoff werden zur Wachstumskontrolle (25) verwendet. Die Inkubation erfolgt 16 bis 18 Stunden bei (25) 37°G Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammenge-(25) faßt.

Tabelle II

Keim

Nr.

MHK. y/ml

Keimverdünnung

1 :10

A B

1:1000 A

Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa

3840 8170 8174 8204 8206 8321 8322 8323 8327 8328 8329 8450 8451 8452 8453 8460 8461 8462 8463 8464 8723

150 50 50

5200

150

100

>200

25

>200 8

50

100

>200

100

25

>200

5200

50

100

100 5200

150

100

>200

5200

>200

50

20

>200

15

100

5200

>200

5200

50

>200 >200 100 5200 5200

100 (100)

25 (25)

100 (100)

50 (50)

50 (100)

100 (100)

<4 (8)

8 (4)

50 (5200)

<4 (4)

25 (50)

50 (25)

100 (100)

25 (25)

10
50
50
25
50
25

(4) (50) (50) (25) (50) (25)

5 200(5200)

50 (50)

200(5 200)

100 (100)

100(>200)

5 200(>200)

4 (25)

8 (10)

J 00 (5 200)

4 (10)

25 (100)

100 (50)

5200 (200)

50 (SO)

20 (10)

100 (50)

100 (100)

50 (50)

50 (100)

50 (50)

3) Zur Bestimmung des statistischen Werts der vorstehenden Ergebnisse wurden 2 Pseudomonas Isolate (Nr. 8323 und 8329) willkürlich aus der ursprünglichen Gruppe der 20 untersuchten Stämme ausgewählt und zusammen mit einem Indol-positiven Proteus-Stamm (Nr. 8217) dem 10 Röhrchen-Verdünnungstest unterworfen. Insgesamt wurden 25 gesonderte Versuche für jeden Arzneistoff und jeden Keim durchgeführt Nach 16- bis 18stündiger Inkubation bei 37° C wird die Trübung jedes Röhrchens in einem Nephelometer als Punktion der prozentualen Durchlässigkeit bestimmt. Die Ergebnisse wurden der statistischen Analyse nach der Methode von Wilcoxon-Rank-Sum unterworfen. In jedem Fall sind die Ergebnisse statistisch signifikant mit einer Vertrauensgrenze von 95%. In Tabelle III sind die Ergebnisse zusammengefaßt.

Tabelle III	Nr.	Mittlere prozentuale Durchlässigkeit bei MHK B A	79,5 77,0 95.0
Keim	8217 8323 8329	52,5 6LO 63,0
Proteus sp. Pseudomonas sp. Pseudomonas sp.

4) Agardiffusionstest nach Kavanaugh,a.a.O.

Der Agardiffusionstest ist ein Standardverfahren für die klinische Resistenzbestimmung. Die Methode erlaubt eine qualitative Aussage über die Empfindlichkeit der geprüften Keime, die Mr übliche Fragestellungen eine durchaus zufriedenstellende. Genauigkeit

Tabelle IV

aufweist. Die Antibiotika wurden in wäßriger Lösung in der Tabelle IV angegebenen Menge auf die Blättchen aufgebracht Sämtliche Versuche wurden 18 Stunden bei 37° C durchgeführt Die Hemmhofdurchmesser wurden mittels Zirkel bestimmt Die Ergebnisse sii.d in Tabelle IV zusammengefaßt.

Keim

Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp.

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp.

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa *) Hemmhof undeutlich zur Messung.

Die Zahl der Pluszeichen zeig' die relative Größe der trüben

	y/Blättchen	Hemmhofdurchmesser, mm A B	18,5 14,0 O₁O
Nr. 8323 Nr. 8323 Nr. 8323	400 200 100	23,4 18,0 14.0	14,6 12,3 0,0
Nr. 8460 Nr. 8460 Nr. 8460	NJ Ul O Ul O O	17,0 14,9 *+ )**	17,9 15,0
Nr. 8327 Nr. 8327 Nr. 8327	100 50 25	19.6 17,0 12,8	0,0 0,0
Nr. 8329 Nr. 8329 Nr. 8329	100 50 25	16,2 0,0	0,0 0.0
Nr. 8450 Nr. 8450 Nr. 8450	400 200 100	0.0

Zone.

Erfindung kann in üblichen oder parenteral verabfolgt

Die Verbindung der
Arzneipräparaten oral
werden.

Beispiel

D-oc-Amino-^-cyclohexadienylJ-methylpenicillin a) D-2-Amino-2-( 1,4-cyclohexadienyl)-essigsäure

Eine Lösung von 11,0 g (27,7 mMol) D-Phenylglycin in 900 ml destilliertem Ammoniak, der nach der Destillation zur Beseitigung von ^Feuchtigkeitsspuren mit 45 mg Lithium behandelt wurde, wird langsam mit 370 ml wasserfreiem tert.-Butanol verdünnt.

Innerhalb von 2 Stunden werden 1,65 g Lithium (3,27 Äquivalente) in kleinen Portionen zugegeben, bis eine beständige blaue Farbe erhalten wird. Das blaugefärbte Reakticnsgemisch wird dann mit 38 g Triäthylamin-hydrochlorid behandelt. Man läßt den Ammoniak bei Raumtemperatur über Nacht abdampfen und destilliert das übrige Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab. Der weiße Rückstand wird in einer kleinen Menge Methanol/Wasser aufgenommen und zur Fällung des Rohproduktes mit 4 Liter kaltem 1 :1-Chloroform/ Aceton-Gemisch versetzt. Nach 20minütigem Rühren wird die Suspension filtriert und der weiße Filterkuchen im Exsikkator getrocknet. Der Filterkuchen wird dann pulverisiert und noch einmal dem Fällungsverfahren mit 1 :1-Chloroform/Aceton unterzogen.

Man erhält in quantitativer Ausbeute 11,8g weißes, kristallines Produkt vom F.297°C (Zersetzung); [«]d-89,7° (2 η NaOH). Das Produkt ist leicht mit Lithiumchlorid verunreinigt; bei der Analyse werden 0,5% Chlorid gefunden.

Analyse (für Lithiumchloridgehalt korrigiert): Berechnet: C 62,72, H 7,24, N 9,14; gefunden: C 62,80, H 7,16, N 9,18. Das NMR-Spektrum zeigt Absorptionsbanden τ 4,17 (Vinyl), 6,21

-C-H

40 7,30 (Allyl) im Verhältnis von 3 :1 :4.

b) Acetessigsäuremethylester-enamin

des Natriumsalzes von N -2- Amino-2-( 1,4-cyclohexadienyl)-essigsäure

306 mg D-2-Amino-2-(l,4-cyclohexadienyl)-essigsäure (2,00 Millimol) werden unter Erwärmen in einer Lösung von 108 mg NaOCH₃ (2,00 Millimol) in 4,3 ml reinem Methanol gelöst 255 mg (0,24 ml, 2,20 Millimol) Acetessigsäuremthylester werden zugegeben, und das Gemisch wird 45 Minuten unter Rückfluß gekocht. Das Methanol wird fast ganz unter vermindertem Druck abdestilliert. 5 ml Benzol werden zugegeben und bis auf ein kleines Restvolumen abdestilliert. Das Zugeben und Abdestillieren des Benzols wird wiederholt, um das Methanol und das Wasser möglichst vollständig abzutrennen. Das Produkt kristallisiert über Nacht aus einem kleinen Restvolumen Benzol aus. Es wird abfiltriert, mit Benzol gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Ausbeute 463 mg.

6c c)D-aAmino-(l,4-cyclohexadienyl)-methylpenicillin

358 mg (1,66 mMol) 6-Aminopenicillansäure (6-APS) werden in 2,5 ml Wasser unter allmählicher Zugabe von 0,23 ml Triäthylamin gut gerührt, wobei der pH-Wert unter 8,0 gehalten wird. Der endgültige pH-Wert ist 7,4. 0,85 ml Aceton werden zugegeben, und die Lösung wird bei -10° C gehalten.

469 mg Acetessigsäuremethylester-enamin des Natriumsalzes von D-2-Amino-2-(1,4-cyclohexadienyl)- Essigsäure (1,715 Millimol) werden in 4,25 ml Aceton bei -20⁰C gerührt. Nach Zusetzen eines Mikrotropfens N-Methylmorpholins werden langsam 198 mg eiskalter Chlorameisensäureäthylester zugegeben. Durch Zugabe von 0,43 ml Wasser entsteht eine trübe Lösung. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei -20° C gerührt.

Die trübe Lösung des gemischten Anydrids wird dann zur 6-APS-Lösung gegeben. Die vollkommen klar werdende Lösung wird 30 Minuten bei — 10⁰C gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und mit verdünnter Salzsäure auf den pH-Wert 2,0 angesäuert. Unter gutem Rühren wird dieser pH-Wert 10 Minuten gehalten.

Die Lösung wird dann mit 5 ml Xylol extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit 5 ml Methylisobutylketon versetzt, der pH-Wert wird mit 1 n-NaOH auf 5,0 eingestellt und das Gemisch über Nacht kühl gestellt Die entstandenen Kristalle werden abfiltriert, mii Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet Ausbeute 272 mg (44% d. Th.) der Titelverbindung mii einem Zersetzungspunkt von 202° C.

C16H21N3O4SV2H2O:

Berechnet: C 53,31, H 6,15, N 11,66, S 8,89;
gefunden: C 53,50, H 6,32, N 11,35, S 8,87.

Jodometrische Penicillintitration = 97,4% (Titratior der wasserfreien Verbindung = 99,2%). NMR: τ4,ϋ (Vinyl), 7,3 (Allyl), 8,41,848 (geminale Dimethylgruppe) Verhältnis:3:4:6.

1 Millimol von D-«-Amino-(l,4-cyclohexadienyl) methylpenicillin wird in 10 ml einer 0,01 n-wäßriget Natriumhydroxidlösung gelöst. Die Lösung wird ge friergetrocknet. Man erhält das Natriumsalz.

«09582/41

V

Claims

Patentansprüche:

1. a-Amino-fl/l-cyclohexadienylJ-methylpenicillin der Formel

CH-CO —NH

NH₂

CH₃