DE1959064B2 - Verfahren zur herstellung von durch deuterium oder tritium substituierten cardenoliden und cardenolidglykosiden - Google Patents

Description

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In neuerer Zeit werden zur pharmakologischen und chemischen Prüfung von Arzneimitteln in zunehmendem Maße radioaktiv markierte Verbindungen verwendet. Dies gilt besonders für Untersuchungen an bereits bekannten wie auch neu entwickelten Herzglykosiden. Diese Glykoside entfalten ihre Wirkung schon bei so geringer Dosierung, daß die Verfolgung ihres Schicksals im menschlichen und tierischen Organismus mit den üblichen analytischen Methoden sehr unsicher oder völlig unmöglich ist. Für derartige Untersuchungen werden heute fast ausschließlich mit Tritium markierte Herzglykoside verwendet.

Organische Stoffe und insbesondere die empfindlichen Herzglykoside können bisher durch folgende Verfahren mit Tritium markiert werden:

1. Die Einwirkung von Tritiumgas auf scharf trockene Substanzen. Dieses Verfahren erfordert eine lang dauernde Einwirkung von Tritiumgas und führt daher zu vielfältigen Neben- und Abbaureaktionen, die eine Reindarstellung der erwünschten Produkte sehr erschweren;

2. Reduktion natürlicher Glykoside, die Carbonylgruppen enthalten, mit tritiumhaltigem Natriumborhydrid. Diese Reaktion verändert die natürlichen Glykoside und führt so zu klinisch nicht verwendeten Stoffen;

3. Reduktion von vorher auf halbsynthetischem Wege eingeführten CO-Gruppen durch tritiumhaltiges Natriumborhydrid, die das Ausgangsglykosid tritiert zurückliefern kann. Dieses Verfahren erfordert wegen der Umwandlung der natürlichen Glykoside in durch Natriumborhydrid reduzierbare Substanzen erhebliche Vorarbeiten und ist auf solche Glykoside beschränkgt, die sekundäre OH-Gruppen im Steroidteil des Moleküls enthalten.

Um genaue Aufschlüsse über das Verhalten und vor allem den Abbau und den Verbleib der entstehenden Bruchstücke von Cardenolidglykosiden im Organismus zu erhalten, war es von Interesse, ein Verfahren zu finden, das es ermöglicht, auf einfache Weise diese Verbindungen an bekannter Stelle im Aglykon zu markieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von durch Deuterium oder Tritium substituierten Cardenoliden und Cardenolidglykosiden ist dadurch gekennzeichnet, daß im ungesättigten Lactonring die Wasserstoff atome an den Kohlenstoffatomen 21 und 22 mittels O-deuterierten oder O-tritierten Hydroxylverbindungen unter dem katalytischen Einfluß von Basen in einem möglichst protonenfreien Lösungsmittel durch Deuterium oder Tritium ersetzt werden.

Bei der praktischen Ausführung des Verfahrens wird der Isotopenaustausch in möglichst protonenfreien organischen Lösungsmitteln, z. B. Pyridin oder Dimethylformamid, bei Temperaturen zwischen 20 und 100" C durchgeführt. Als deuterierte oder tritierte Hydroxylverbindungen haben sich Wasser und niedere Alkohole bewährt.

Für den Austausch von Wasserstoffatomen in Nachbarschaft zu einer Carbonylgruppe wird die Enolisierung als geschwindigkeitsbestimmender Faktor angesehen. Enolisierung und Austausch können durch Säuren und Basen katalysiert werden. Cardenolide und Cardenolidglykoside werden jedoch von Säuren und Basen leicht angegriffen. Dabei können irreversible Veränderungen eintreten wie öffnung und Isomerisierung der Lactongruppierung, hydrolytische Spaltung von Glykosidbindungen oder Eliminierung der Hydroxylgruppe an C-14. Es war daher nicht vorauszusehen, ob ein definierter Isotopenaustausch ohne weitgehende Zerstörung des Moleküls erzielt werden könnte.

Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft jedoch unter den angegebenen Bedingungen überraschend glatt und führt in einem Reaktionsschritt und mit guten Ausbeuten zu den substituierten Produkten.

Die neuen Verbindungen unterscheiden sich in ihrem chemischen Verhalten nicht von den Ausgangssubstanzen, auch im Dünnschicht- und Papierchromatogramm sowie im UV-Spektrum sind sie mit diesen identisch. Dagegen ist im IR-Spektrum der deuterierten Verbindungen die Aufspaltung der Carbonylbande des Lactonringes (Vorbande bei ca. 1790 cm-¹) verschwunden und die Bande der C = C-Doppelbindung um ca. 20 cm-¹ langwellig verschoben. Im Kernresonanz-Spektrum sind die Signale für die drei Protonen an den Kohlenstoffatomen 21 und 22 verschwunden. Pharmakologisch unterscheidet sich z. B. deuteriertes Digitoxin in der Hatcher Dosis (i. v. tödliche Dosis pro kg Katze) nicht von natürlichem Digitoxin..

Auch bei den in entsprechender Weise hergestellten tritierten Verbindungen ist der Austausch auf die Position 21 und 22 beschränkt, da das nach vorliegendem Verfahren hergestellte j3-Acetyldigoxin durch saure Verseifung ein kristallisiertes Digoxigenin liefert, in dem noch 97% der Ausgangsaktivität gemessen wurde.

Folgende Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutern:

Beispiel 1

21,21,22-Trideuterodigitoxigenin

186 mg (0,5mMol) Digitoxigenin und 112 mg (1 mMol) Triäthylendiamin wurden in 2,5 ml Deuteroäthanol gelöst und in einem verschlossenen Gefäß 12 Stunden auf 80°C erhitzt. Nach Abkühlen wurde die Lösung mit verdünnter Essigsäure neutralisiert und eingedampft. Der Rückstand, aus Alkohol/Wasser kristallisiert, ergab 172 mg farblose Kristalle, welche sich im Schmelzpunkt, Dünnschicht- und Papierchromatogramm nicht vom Ausgangsmaterial unterschieden.

Charakteristische Unterschiede zwischen
Deutero-digitoxigenin und Digitoxigenin

im IR-Spektrum (KBr):
- C - O-Bande 1740 cm -' 1792 cm -' schwach

1738 cm- stark
-C-C-Bande 1611cm-¹ 1632cm-'

im NMR-Spektrum

(δ- Werte in Dimethylsulfoxid-d₆):

Protonen an

4,93 und 5,92 ppm

Analog wurde aus Digitoxin 21,21,22~Trideuterodigitoxin erhalten.

Beispiel 2
21,21,22-Trideuterogitoxigenin '

195 mg (0,5 mMol) Gitoxigenin und 112 mg (1 mMol) Triäthylendiamin wurden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,2 ml Deuteriumoxid versetzt. Die Lösung wurde im geschlossenen Gefäß 6 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt. Danach wurde durch Zusatz von Wasser gefällt und die erhaltene Substanz aus Alkohol/Wasser kristallisiert. Es wurden 155 mg farblose Kristalle erhalten, welche sich im Schmelzpunkt, Dünnschicht- und Papierchromatogramm nicht vom Ausgangsmaterial unterschieden.

Charakteristische Unterschiede zwischen

Deutero-gitoxigenin und
im IR-Spektrum (KBr):
-C = O-Bereich
1770 cm-¹ stark
1735-1715Cm-¹
(Schulter)

-C = C-Bande
1610cm-¹

Gitoxigenin

1815 cm-¹ (schwach)

1790 cm-'(mittel)
1765 cm-¹ (stark)
1720 cm-'(schwach)

1630 cm-¹

im NMR-Spektrum -_s5

(ό-Werte in Dimethylsulfoxid-d₆):

Protonen an

C21 und C22 5,06 und 5,93 ppm

In entsprechender Weise, jedoch durch 15-stündiges Erhitzen auf 70", wurde aus Oleandrin 21,21,22-Trideuterooleandrin erhalten.

Beispiel 3
j3-Acetyldigoxin-³H

206 mg 0-Acetyldigoxin wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst, mit 0,2 ml tritiertem Wasser und 0,3 ml Triäthylamin versetzt und im verschlossenen Gefäß 6 Stunden auf 70⁰C erhitzt. Nach dem Erkalten

45 wurde mit Wasser gefällt, abgesaugt und gründlich mit Wasser gewaschen. Die Kristallisation aus 75%igem Alkohol ergab 156 mg /?-Acetyldigoxin-³H, das sich im Schmelzpunkt, UV-Spektrum sowie Dünnschicht- und Papierchromatogramm nicht vom Ausgangsmaterial unterschied. !Es war also auch kein Stellungswechsel der Acetylgruppe erfolgt. Die spezifische Aktivität der Verbindung betrug bei einem Einsatz von 1 mCi ca. 62 · 10 - 9 Ci/mg, bei einem Einsatz von 2 Ci ca. 125 · 10 -⁶ Ci/mg. Analog wurde aus Digitoxin Digitoxin-³H erhalten.

In entsprechender Weise wurden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Markierungsversuche an Digoxin durchgeführt:

Es wurden jeweils 50 mg Digoxin in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit den angegebenen genau gemessenen Radioaktivitäten von 19,0 bis 29,6 μο Tritiumwasser und mit 20 μ 1 Amin versetzt. Das Gemisch wurde anschließend in einer Ampulle eingeschmolzen und 6 Stunden auf 6O⁰C erwärmt. Nach Fällen mit Wasser und Reinigen durch 2maliges Umkristallisieren wurde die Radioaktivität des Digoxins bestimmt.

Der Versuch mit NH3 wurde in gleicher Weise ausgeführt, indem die den Aminen äquivalente Menge NH₃ (trocken, in DMF) und 44,1 μα HTO eingesetzt wurden.

Bei der NaOH-katalysierten Markierung wurden ebenso 50 mg Digoxin in 2 ml DMF-Lösung, die mit festem, trockenem NaOH gesättigt war, mit 28,0 μο HTO umgesetzt.

Das isolierte Digoxin unterschied sich jeweils im Schmelzpunkt, UV-Spektrum sowie Dünnschichtchromatogramm nicht vom Ausgangsmaterial.

Eingesetzte Base

Eingesetzte Spez. Aktivität

HTO-Aktivität des isolierten
Digoxins

(μα/mg)

Butylamin	23,5
Dibutylamin	23,4
N-Methylpiperazin	19,0
Benzylamin	29,6
Anilin	23,5
N-Methylanilin	29,0
N,N-Dimethylanilin	25,6
NH3	44,1
NaOH	28,0

0,0102
0,0099
0,0079
0,0052
0,0072
0,0029
0,0060
0,0036
0,02

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von durch Deuterium oder Tritium substituierten Cardenoliden und Cardenolidglykosiden, dadurch gekennzeichnet, daß im ungesättigten Lactonring die Wasserstoffatome 21 und 22 mittels O-deuterierten oder O-tritierten Hydroxylverbindungen unter dem katalytischer! Einfluß von Basen in einem möglichst protonenfreien Lösungsmittel durch Deuterium oder Tritium ersetzt werden.