DE1958016C3 - Inosin-3' zu 5'-monophosphat-2'-O-ester - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Fnosin-3': 5'-monophosphat-2'-O-ester der allgemeinen Formel I

HN

Formel und üblichen Hilfsstoffen bestehen.

Die neuen Verbindungen gemäß der Erfindung besitzen interessante pharmakologische Eigenschaften und unterscheiden sich in ihrer physiologischen Wirkung überraschend und vorteilhaft von Inosin-3': 5'-monophosphat (1-3': 5'-MP) und anderen nahestehenden Verbindungen. Insbesondere zeichnen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine ausgeprägte Stimulierung der Nebennieren-Glucocorticoidausschüttung ohne gleichzeitige Steigerung des Blutzuckers und ohne Phosphorylaseaktivierung aus. Derartige Eigenschaften konnten bisher bei chemisch nahestehenden Verbindungen nicht festgestellt werden. Zwar führt auch das bekannte N⁶-2'-O-Dibutyroyl-adenosin-3': 5'-monophosphat zu einer Erhöhung der Blut-Corticoid-Werte. Diese Substanz, die nicht als Arzneimittel im Handel ist, bewirkt jedoch gleichzeitig einen sehr starken Anstieg des Blutzuckerspiegels. Das Fehlen einer Wirkung auf den Blutzuckerspiegel ist wichtig, da durch eine Blutzuckererhöhung die gewünschte Wirkung einer Corticoidspiegelerhöhung in ihrem Effekt wieder aufgehoben wird. Bei Diabetikern muß sogar befürchtet werden, daß der Schockzustand nicht verbessert, sondern durch die Blutzuckererhöhung sogar verschlechtert wird.

Gegenüber der direkten Verabreichung von Corticoid-Horrnonen haben die erfindungsgemäßen Substanzen den Vorteil, daß sie nicht wie erstere die körpereigene Hormonproduktion hemmen. Darüber hinaus weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine sehr geringe Toxizität auf. Beispielsweise liegt die LD₅₀ für das 2'-O-ButyroyI-I-3': 5'-MP, an NMRI-Mäusen weiblichen und männlichen Geschlechts durch intravenöse Verabreichung in isotonischer Kochsalzlöji sung bestimmt, über 10 000 mg/kg.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher als Arzneimittel, insbesondere bei Streß- und Schockzuständen, verwendet werden. Diese Indikation wird noch dadurch unterstützt, daß die neuen Verbindungen auch tu eine Herabsetzung der Herzrate zeigen. So konnte beispielsweise im Mäuseschwimmtest die Schwimmzeit bei Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen bis zum Dreifachen gesteigert werden.

Um die überraschenden Eigenschaften der erfin-

■r, dungsgemäßen Verbindungen im Vergleich zu den chemisch nahestehenden Verbindungen zu zeigen, wurde die obiger allgemeiner Formel entsprechende Verbindung, in der R Propyl bedeutet, hinsichtlich der Aktivierung der Phosphorylase in vitro, der Erhöhung

«) des Blutzuckers in vivo sowie der Erhöhung der Blut-Corticoide mit den bekannten Verbindungen

Adenosin-3': 5'-monophosphat (A-3': 5'-MP),

1-3': 5'-MP, N<\2'-O-Dibutyryl-A-3' : 5'-MP und N⁶-Monobutyryl-A-3' :5'-MP verglichen. Die Ergebnisse wa-

v> ren wie folgt:

1. Aktivierung der Phosphorylase in vitro (nach E. G. Krebs et al.. Biochemistry 3, 1022 (1964)

RC

OH

Substanz

in der R eine Alkylgruppe mit I bis 6 Kohlcnstoffalo men, eine Aryl- oder Aralkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe bedeutet, sowie deren physiologisch verträgliche Salze, ihre Herstellung und Arzneimittel, die aus einer Verbindung obiger Beginn der
Aktivierung

(M)

Maximale

Aktivierung

bei

(M)

A-3' : 5'-MP
N⁶,2'-O-nibiityryl-A-3' : 5'-MP

IO ⁷M IO ⁶M

5 · IO ⁶M IO ⁴M

Substanz

Beginn der
Aktivierung

(M)

Maximale

Aktivierung

bei

(M)

N⁶-Monobutyryl-A-3': 5'-MP
1-3' : 5'-MP

2'-O-Monobutyryl-1-3': 5'-MP

10'⁷M

1(T⁷M
5· HT⁵M

10 "M

5: KT⁶M
10"²M

IO

Die erfindungsgemäße Verbindung weist also eine um Zehnerpotenzen schwächere Aktivierung der Phosphorylase als die bekannten Vergleichssubstanzen auf.

2. Erhöhung des Blutzuckers (mg/ml) in vivo, Sprague-Dawly-Ratten, Injektion i. p., Messung der Glucose nachNikk na undHyvarinen.Clin. Chim. Acta 7, 140 (1962)

Substanz

Dosis (mg/kg) Anstieg bei

0 20 80 80 mg/kg

A-3' : 5'-MP 1,12 1,32 1,90 0,78

N^^-O-Dibutyryl- 1,05 1,84 1,93 0,88
A-3' : 5'-MP

1-3' : 5'-MP 1,10 1,16 1,35 0,25

2'-O-Monobutyryl- 1,13 1,04 ',14 0,01

1-3': 5'-MP

In-vivo- und In-vitro-Werte für das N^fc-.*1onobutyryl-A-3':5'-MP und das 2'O-Monobutyry]-A-3': 5'-MP sind aus der Veröffentlichung von H e η i ο η, Sutherland und Posternak (Biochem. Biophys. Acta 148, 106 [1967J bekannt. Beide Verbindungen zeigen eine deutlich dem A-3':5'-MP überlegene Blutzuckersteigerung. Es ist sehr überraschend, daß die analoge erfindungsgemäße Verbindung dagegen eine viel schwächere Wirkung als 1-3': 5'-MP hat.

3. Erhöhung der Blut-Corticoide (μ%/τη\), Verabreichung wie bei 2. beschrieben, Messung mit der Methode von G u ill em in u. a., J. Lab. Clin. Med. 53, 830(1957)

Substanz	Dosis	(mg/kg)	80	Anstieg bei
	0 .	20	0,39 0,51 0,27	80 mg/kg
A-J : 5'-MP l^-O-Dibutyryl- A-3' : 5'-MP 1-3' : 5'-MP	0,33 0,19 0,20	0,29 0,20 0,22	0,44	0,06 0,32 0,07
2'-O-Monobutyryl- 1-3' : 5'-MP	0,20	0,29	0,24

1/1000 der Abbaurate mit Phosphordiesterase wie A-3': 5'-M P).

Die obigen Befunde zeigen, daß durch die erfindungsgemäßen Verbindungen die Glucocorticoidbildung ohne die unerwünschte Steigerung des Blutzuckers angeregt wird. Diese vorteilhafte Wirkung wird noch unterstützt durch die praktisch fehlende Phosphorylaseaktivierung.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen können hergestellt werden, indem in an sich bekannter Weise 1-3': 5'-M P mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II

R-CO-X,

in der X ein CI-Atom oder die Gruppe R—CO—O sein kann und R die oben angegebene Bedeutung zukommt, in einem alkalischen organischen Lösungsmittel umgesetzt wird. Vorzugsweise wird bei Raumtemperatur gearbeitet. Die Verbindung der allgemeinen Formel II wird zweckmäßig im Überschuß zugesetzt.

Als alkalische organische Lösungsmittel eignen sidh besonders die tertiären Amine, beispielsweise die Trialkylamine oder heterocyclische gesättigte oder ungesättigte Verbindungen, wie z. B. Pyridin.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen.

30

40

Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt eine starke Steigerung d-r Blut-Corticoid-Werte. Dies ist um so überraschendi r, weil die Verbindung nicht, wie etwa N^.2'O-Dibiityryl-A-3' : 5'-MP besonders resistent ge- «,-, gen das abbauende Enzym Phosphordiesterase ist, sondern überraschend wie 1-3': 5'-MP abgebaut wird (Dibutyryl-A-3': 5'-MP hat größenordnungsmäßig nur Beispiel !
2'-O-Butyr>i-1-3': 5'-MP-Na <

= 10 g I-3':5'-MP-freieSäure
= 18 g Triäthylamin
= 30 g Buttersäureanhydrid
250 ml Pvridin

Ansatz

I 30 mMol

Il 18OmMoI

111 195 mMol

Lösungsmittel:

Verfahren

In einem 500-ml-K.olben wird I iu Pyridh suspendiert und die restlichen Komponenten werden dann nacheinander zugegeben. Anschließend schüttelt man bis zur Lösung des Cyclophosphates (ca. 1 Stunde) und läßt das Reaktionsgemisch 3 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur stehen. Danach zeigt das Chromatogramm (Papier; Laufmittel: Äthanol/1 -m-Ammoniumacetat = 50:20) quantitativen Umsatz. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung im Vakuum eingedampft, bis ein öliger Rückstand verbleibt. Dieser wird 2mal mit Eis/Wasser versetzt und erneut konzentriert. Das viskose öl löst man in 150 ml Wasser, extrahiert 5mal mit je 50 ml Äther und engt die wäßrige Phase anschließend im Vakuum ein. Der Rückstand wird in 30 ml Methanol aufgenommen und unter Rühren langsam mit 60 ml einer !molaren Lösung von Na) in Aceton versetzt Die Fällung des Natriumsalzes wird durch Zufügen von trockenem Aceton vervollständigt, das abgeschiedene Produkt zentrifugiert und bis zur Jodidfreiheit mit Aceton gewaschen. Dann wird im Vakuum über P₂O₅ getrocknet.

Ausbeute 10,7 g = 85% der Theorie.

Kigenschaften des Produktes

MG: 422,2 entsprechend CnHIt₁OsN₄PNa (reinweißes, amorphes Pulver).

Dünnschichtchromatographie

Cieselgel-Fertigschicht
^aufmitte|:n-ButanoI/Eisessig/H2O = 50 :15 :25

VWert

)34 (1-3': 5'-MP: 0,20)

Elektrophorese

Mobilität relativ zu A-3': 5'-MP : 1,35 (Whatman-Papier Nr. 3MM, 13crn breit; 1000 V; in 0,05 M rriäthylammoniumbicarbonatpuffer pH 7,5; 45 Minuten Laufzeit)

UV-Quol ienten:
In 0,05-mPhosphatpuffer:
250 . ₁₇₄ 280 .

0,26

290
260

0,04

on,

260 ' ' 260

In 0,1 n-HCl:

250 . , _sq _280_ . _n _290^ .
260" ' """ 260 "^" 260

Maxima

in 0,1 N-HCl: 248 nm; in 0,05 M PHOSPHAT, pH = 7-.247,5 η m

Minima

in 0,1 N-HCI : 219 nm; in 0,05 M PHOSPHAT, pH = 7:219nm

Beispiel 2
2-O-Benzoyl-l-3': 5'-MP-Na ⁺

Ansatz

I 15mMol = 5g 1-3' : 5'-MP-freie Säure
Il 12OmMoI = 17 g Benzoylchlorid
Lösungsmittel: 150 ml Pyridin

Verfahren

I wird im Pyridin suspendiert, II zugefügt und die Mischung bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Nucleotid geht rasch in Lösung, wobei sich gleichzeitig Pyridin-HCI- abscheidet Nach ca. 2'/2 Stunden ist im Chromatogramm kein Ausgangsmaterial mehr feststellbar; neben dem gewünschten P-odukt ist nur Benzoesäure sowie ein stärker lipophiles Nebenprodukt zu beobachten.

Zur Aufbereitung wird die Reaktionslösung mit ca. 50 g Eis versetzt und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende öl nimmt man in 150 ml H2O auf und extrahiert 3mal mit je 50 ml Äther die Benzoesäure. Nach Konzentrieren der wäßrigen Phase auf ca. 15 ml wird auf 6 Kieselgel-Dickschichtplatten aufgetragen

^r> und im System n-Butanol/Eisessig/Wasser (50 :15 :25) entwickelt. Die Hauptbanden werden anschließend isoliert, das Nucleotidmaterial mit H2O von SiOj eluieri und die vereinigten Extrakte zur Entfernung gelöster Kieselsäure über eine Kohlesäule passiert.

Hi Das eluierte Material wird an einem Na⁴-I<.ationenaustauscher in das Na-SaIz überführt und gefriergetrocknet.

Ausbeute
i) 3,8 g= 55% der Theorie (weißes, amorphes Pulver)

Eigenschaften des Produktes
MG: 456,3 entsprechend Ci₇HnO₈N₄PNa
2« Dünnschichtchromatographie

Kieselge! Fertigschicht,

Laufmittel: n-Butanol/Eisessig/HjO = 50 :15 : 25

Rf-Wch

0,37(1-3': 5'-MP: 0,20)
Elektrophorese

Mobilität relativ zu A-3' : 5'-MP : 1,13 (Whatman-Papier Nr. 3MM, 13 cm breit; ¹OOOV; in 0,05 M Triäthylammoniumbicarbonatpuffer pH 7,5; 45 Minuten Laufzeit)

UV-Quotienten
_}. In 0,05-mPhosphatpuffer:

²⁵± ·
T60 ·

InO₁In-HCl:

2?°_ ■ 034 ²⁹° - 007
260 · °'^j4 Τω ■ °'°⁷

250 280

W · ^l>9°

»0 .

260 °'²⁹ 260

■ °'⁰⁵

Maxima

in 0,1 N-HCI :239nm; in 0,05 M PHOSPHAT, pH = 7 : 239 nm

Minima

in 0,1 N-HCI : 215 nm; in 0,05 M PHOSPHAT, pH = 7:215 nm.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Inosin-3': 5'-monophosphat-2'-0-ester der allgemeinen Formel I

R—C

OH

in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Aralkylgruppe mit bis zu 4 C-Atomen in der Alkylgruppe bedeutet, sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise Inosin-3' : 5'-monophosphat mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II

R-CO-X,

in der X ein Cl-Atom oder die Gruppe R—CO—O sein kann und R die obige Bedeutung zukommt, in einem alkalischen organischen Lösungsmittel umgesetzt wird.

3. Arzneimittel bestehend aus einer Verbindung nach Anspruch 1 und üblichen Hilfsstoffen.