DE19512368A1 - System zur Freisetzung und Isolierung von Nukleinsäuren - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung sind ein System zur Freisetzung und Isolierung von Nuklein­ säuren und ein Verfahren zur Benutzung dieses Systems.

Nachweisverfahren, die auf der Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe beruhen, sind in jüngerer Zeit verstärkt mit Interesse bedacht worden. Dies liegt unter anderem in der er­ reichbaren hohen Spezifität des Nachweises. Hierin sind Nukleinsäurenachweise den Anti­ gennachweisen prinzipiell überlegen. Während Antigene jedoch oft in einer Probe schon relativ zugänglich vorliegen, müssen Nukleinsäuren, insbesondere bei Nachweisen von Organismen, meist in mehreren Schritten zugänglich gemacht werden. Darüber hinaus sind Nukleinsäuren in der Regel in sehr geringen Konzentrationen vorhanden. Insbesondere bei der Isolierung von Nukleinsäuren aus zellhaltigen Proben sind bisher aufwendige Aufreini­ gungsverfahren bekannt.

Die auf dem Markt derzeit angebotenen Probenanreicherungs- und Probenvorbereitungs­ systeme für Nukleinsäuren ermöglichen keine gezielte Anreicherung von Zellen mit magne­ tischen Partikeln. Die Sensitivität bei diesen Verfahren ist oft nicht ausreichend hoch. Die zur Zeit erhältlichen automatisch arbeitenden Probenvorbereitungssysteme benötigen orga­ nische Lösungsmittel (Phenol- und/oder Chloroform-Alkoholgemische) zur Gewinnung der Nukleinsäure.

Die derzeit eingesetzten Verfahren unter Verwendung einer Immobilisierung der Nuklein­ säuren benutzen im wesentlichen zwei Prinzipien zur Isolierung der Nukleinsäuen. In einer ersten Möglichkeit werden nukleinsäurehaltige flüssige Proben durch eine Festphasenmatrix gesaugt, wobei die Nukleinsäuren in der Festphasenmatrix festgehalten werden. Dies setzt einen vorherigen Lyseschritt voraus, der in einem getrennten Gefäß durchgeführt wurde. Anschließend werden die Nukleinsäuren durch Durchsaugen einer Elutionsflüssigkeit von der Festphasenmatrix gelöst. Die nukleinsäurehaltigen Elutionslösung wird in ein Gefäß zur Weiterbearbeitung abgesaugt. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß die derzeit verwendeten Vorrichtungen im Hinblick auf die für die Durchführung einer späteren Amplifikations­ reaktion, z. B. PCR, erforderlichen Reinheit nicht ausreichend ist.

Bei einem zweiten Prinzip werden die Nukleinsäuren ausgefällt und mittels einer Zentrifuge separiert. Bei diesem Verfahren ist jedoch ein sogenannter Batch-Betrieb unumgänglich. Bei einem solchen Verfahren wird beispielsweise eine zellhaltige Lösung in einem ersten Reak­ tionsgefäß mit lysierenden Agenzien behandelt. Anschließend wird die Reaktionsmischung aus dem Gefäß in ein Zentrifugationsröhrchen umpipettiert. Dieses Röhrchen hat einen Ein­ satz, an welchem die freigesetzten Nukleinsäuren adsorbieren können, während die restliche Flüssigkeit während der Zentrifugation in den unteren Bereich des Röhrchens fließen kann. Zum Waschen der absorbierten Nukleinsäuren wird der Einsatz ein- oder mehrmals mit einer Waschflüssigkeit behandelt. Hierzu muß der Einsatz in ein weiteres Zentrifugations­ röhrchen überführt werden, damit nicht Reste der Probenflüssigkeit wieder zurück in den Einsatz gelangen. Im letzten Schritt wird der Einsatz in ein weiteres neues Gefäß eingesetzt. Die Nukleinsäuren wären durch Zentrifugation einer Elutionslösung durch den Einsatz in ein weiteres Gefäß hinein in eine weiterverarbeitungsfähige Lösung überführt. Dieses Verfahren ist jedoch einerseits mit einem hohen Kontaminationsrisiko behaftet und andererseits sind eine Vielzahl von Wechseln der Reaktionsgefäße erforderlich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein System bereitzustellen, bei dem die Nach­ teile des Standes der Technik vollständig oder zumindest teilweise beseitigt werden. Insbe­ sondere können mit diesem System Nukleinsäuren an einer Festphasenmatrix absorbiert und desorbiert werden, ohne daß für diese Schritte eine Zentrifuge erforderlich wäre.

Ein Kern der Erfindung ist die Benutzung einfacher, üblicherweise in Analysenautomaten vorkommender Module zur Betreibung des Systems.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Freisetzung und Isolierung oder zum Nachweis von Nukleinsäuren aus biologischen Kompartimenten einer Probe, enthaltend die Schritte:

• - Inkubation der Probe in einem Probenbearbeitungsgefäß zusammen mit magnetischen Partikeln, welche die biologischen Kompartimente binden können, unter Schütteln des Probenbearbeitungsgefäßes,
• - Positionieren eines Magneten in der Nähe des Probenbearbeitungsgefäßes, so daß die Magnetpartikel an der Gefäßwand festgehalten werden,
• - Entfernen der resultierenden Flüssigkeit aus dem Probenbearbeitungsgefäß,
• - Resuspension der Magnetpartikel in einer zweiten Flüssigkeit durch
  • a) Entfernen des Magneten aus der Nähe des Probenbearbeitungsgefäßes, so daß die Magnetpartikel nicht mehr durch den Magneten an der Wand festgehalten werden und gleichzeitig
  • b) Schütteln des Probenbearbeitungsgefäßes,
• - Aufschluß der biologischen Kompartimente unter Erwärmung,
• - Abkühlen der Aufschlußmischung unter Bedingungen, die eine Immobilisierung oder Hy­ bridisierung der zu isolierenden oder nachzuweisenden Nukleinsäure ermöglichen.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein System zur Freisetzung und Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Suspension von biologischen Kompartimenten mit Magnet­ partikeln.

Nukleinsäuren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuren, die in biologischen Kompartimenten vorliegen. Unter biologischen Kompartimenten werden insbesondere Zellen, z. B. viralen oder bakteriellen Ursprungs verstanden. Besonders bevorzugt liegen die Zellen in wesentlichem vereinzelten Zustand vor. Prinzipiell können auch mehrzellige Kompartimente im Sinne der Erfindung bearbeitet werden. Diese Kompartimente mit ihren Nukleinsäuren liegen zu Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Probe vor. Be­ vorzugt ist diese Probe eine Suspension der biologischen Kompartimente in einer Flüssig­ keit. Solche Proben können beispielsweise erhalten werden aus Körperflüssigkeiten, z. B. Blut, Speichel oder Urin.

Unter Freisetzung der Nukleinsäuren wird im Sinne der Erfindung der Austritt der Nuklein­ säuren aus den biologischen Kompartimenten verstanden. Dieser Austritt kann auf beliebige Weise geschehen. Bevorzugt findet der Austritt durch Zerstörung der die biologischen Kompartimente gegen die Flüssigkeit abgrenzenden Wand statt. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch Behandlung der Kompartimente mit zellwandzerstörenden Mitteln, z. B. Proteinase K.

Unter der Isolierung von Nukleinsäuren wird die Abtrennung der Nukleinsäurne von anderen Bestandteilen der Probe verstanden. Solche anderen Bestandteile sind beispielsweise die Wände der biologischen Kompartimente, deren Abbauprodukte, weitere Inhaltsstoffe der biologischen Kompartimente sowie Inhaltsstoffe der Flüssigkeit, welche die biologischen Kompartimente in der Probe umgibt. Hierzu gehören beispielsweise Proteine, Inhibitoren für Enzyme, insbesondere Nukleinsäure-abbauende Enzyme, wie DNase. In diesem Sinne kann Isolierung auch als eine Art Reinigung der Nukleinsäuren verstanden werden. Diese Isolierung kann sowohl spezifisch als auch unspezifisch im Hinblick auf weitere in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren sein.

Unter einem Nachweis von Nukleinsäuren wird erfindungsgemäß ein Verfahren verstanden, bei welchem die Anwesenheit oder Menge von Nukleinsäuren bestimmt wird. Diese Verfah­ ren können sowohl quantitativ als auch qualitativ vorgenommen werden. Für die Durchfüh­ rung quantitativer Nachweise wird in der Regel ein Vergleichsversuch mit einer Probe durchgeführt, die eine bekannte Menge der nachzuweisenden Nukleinsäuren enthält. Der Nachweis kann sowohl sequenzspezifisch als auch sequenzunspezifisch sein. Um die Nachweise spezifisch zu machen, verwendet man in der Regel sogenannte Sonden, die dadurch gekenn­ zeichnet sind, daß sie eine Nukleobasensequenz aufweisen, die mehr oder weniger charak­ teristisch für die Nukleinsäuren in der Probe ist. Sofern ein spezifischer Nachweis von Nukleinsäuren gewünscht wird, wird eine Sonde eingesetzt, die eine Basensequenz enthält, welche komplementär zu der Basensequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure, nicht je­ doch zu anderen Nukleinsäuren in der Probe, ist. Sonden können Moleküle sein, die eine direkt oder indirekt nachweisbare Gruppe enthalten. Direkt nachweisbare Gruppen sind bei­ spielsweise radioaktive (³²P) farbige oder fluoreszierende Gruppen oder Metallatome. Indirekt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise immunologisch oder enzymatisch wirk­ same Verbindungen, wie Antikörper, Antigene, Haptene, Enzyme oder enzymatisch aktive Teilenzyme. Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionssequenz detek­ tiert. Besonders bevorzugt sind Haptene, z. B. Digoxygenin oder Biotin. Solche hapten­ markierten Sonden können in einer anschließenden Reaktion mit einem markierten Anti­ körper gegen das Hapten leicht nachgewiesen werden.

In einem ersten Schritt wird die Probe in einem Probenbearbeitungsgefäß zusammen mit magnetischen Partikeln (Beads), welche die biologischen Kompartimente binden können, unter Schütteln des Probenbearbeitungsgefäßes inkubiert. Unter Magnetpartikeln werden Partikel verstanden, welche durch einen Magneten in eine bestimmte Richtung transportiert werden können. Hierzu gehören beispielsweise ferromagnetische oder superparamagne­ tische Materialien. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung sind ferromagnetische Materialien. Partikel sind feste Materialien mit einem geringen Durchmesser. Im Sinne der Erfindung sind besonders Partikel geeignet, die eine durchschnittliche Korngröße von mehr als 2,8 µm, jedoch weniger als 200 µm haben. Besonders bevorzugt weisen sie eine durch­ schnittliche Korngröße zwischen 10 und 15 µm auf. Bevorzugt ist die Korngrößenvertei­ lung homogen. Diese Partikel sind an ihrer Oberfläche so modifiziert, daß sie die biolo­ gischen Kompartimente binden können. Hierfür geeignete Magnetpartikel sind die bekannten und käuflichen Latexmagnetpartikel, an welche z. B. Antikörper gebunden sein können. Zur Bindung der biologischen Kompartimente an die Magnetpartikel werden insbesondere Antikörper verwendet, welche gegen Oberflächenantigene der biologischen Kompartimente gerichtet sind. Derartige Magnetpartikel sind ebenfalls kommerziell erhältlich.

Das Probenbearbeitungsgefäß befindet sich bevorzugt in einer Baueinheit 10 des Systems, die zur festen Aufnahme des Probenbearbeitungsgefäßes geeignet ist. Die Baueinheit kann auch mehrere Gefäße aufnehmen. Besonders bevorzugt besteht diese Baueinheit in einer Platte, in welcher sich so viele Löcher befinden, wie Gefäße aufgenommen werden sollen. Die Löcher sind in ihrer Geometrie auf die Gefäße aufgepaßt. Die Befesti­ gung der Gefäße in der Baueinheit ist bevorzugt so gestaltet, daß die Gefäße nach Durch­ führung der Probenbearbeitung auf einfache Weise wieder entnommen werden können. Be­ vorzugt ist an der Baueinheit ein Schlauch befestigt, der Unterdruck von einer Absaugeein­ heit, z. B. einer Vakuumpumpe, bis zu dem Loch in der Baueinheit 10 und somit, bei auf­ gesetztem Probenbearbeitungsgefäß, bis an dessen Auslaßöffnung leitet. Im Fall des An­ legens eines Unterdrucks wird daher Flüssigkeit bzw. Luft aus dem Probenbearbeitungsge­ fäß durch den Schlauch zur Pumpe gefördert. Geeignete Ventile sind bevorzugt so ge­ steuert, daß der Unterdruck nur dann an dem Probenbearbeitungsgefäß anliegt, wenn eine Förderung erfolgen soll.

Die Inkubation der Proben mit den Magnetpartikeln kann auf beliebige Weise gestaltet wer­ den. Erforderlich ist, daß sowohl die Probe als auch die magnetischen Partikel in das Probenbearbeitungsgefäß eingebracht werden. Sowohl die Art der Einbringung als auch deren Reihenfolge ist prinzipiell ohne größere Bedeutung für das erfindungsgemäße Verfah­ ren. Bevorzugt jedoch werden die magnetischen Partikel in Form einer Suspension mit einem bekannten Gehalt magnetischer Partikel in das Probenbearbeitungsgefäß pipettiert. Entweder anschließend oder vorher wird die Probe in das Probenbearbeitungsgefäß ein­ pipettiert.

Die Inkubation wird solange unter geeigneten Bedingungen vorgenommen, bis eine aus­ reichende Menge an biologischen Kompartimenten an die Magnetpartikel gebunden ist. Es wird sich hierbei im Regelfall um einen Zeitraum zwischen 1 min und 10 min handeln. Das Probenbearbeitungsgefäß ist hierbei bevorzugt auf geeignete Weise, z. B. mittels eines Deckels oder/und eines Ventils verschlossen.

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist, daß das in dem Probenbearbeitungsgefäß be­ findliche Gemisch während der Inkubation geschüttelt wird. Es kann sich hierbei um ein Intervallschütteln handeln. Das Schütteln kann jedoch auch während der gesamten Inkuba­ tionszeit oder nur Teilen davon durchgeführt werden. Das Schütteln dient dazu, eine aus­ reichende Mischung der biologischen Kompartimente und der Magnetpartikel in der Flüssigkeit zu erreichen, insbesondere die Suspension bzw. Resuspension der Beads und die Beschleunigung der Diffusion. Hierdurch wird die für die Bindung der biologischen Kompartimente an die Magnetpartikel erforderliche Zeit der Inkubation reduziert.

Das Schütteln wird durch Bewegung des Probenbearbeitungsgefäßes, bevorzugt in horizon­ taler Richtung, erreicht. Besonders bevorzugt wird eine Einheit 10, welche Aufnahmen (Löcher) mit einem oder mehreren Probengefäßen enthält, bewegt, so daß alle darin befind­ lichen Probengefäße mitgeschüttelt werden. Im Sinne der Erfindung bevorzugt ist die Ver­ wendung einer Einheit 30, welche die Bewegung der Probenbearbeitungsgefäße (A) nicht manuell durchführt. Diese Einheit kann jede prinzipiell zum Mischen von Flüssigkeiten in einem Gefäß geeignete mechanische Einrichtung sein. Ein bevorzugtes Beispiel einer solchen Einheit ist im folgenden beschrieben.

Ein Schrittmotor mit einem Excenter und einer Ausgleichsmasse treiben von einem festen Rahmen 1 das über Schwingungsdämpfer auf diesen Rahmen aufgesetzte komplette DNA- Modul (Einheit 10) in eine kreisförmige exzentrische Bahn fester Amplitude und variabler Frequenz. Die bevorzugte Amplitude ist A 1,5 mm, die bevorzugte Frequenz 1 f 50 Hz. Die Misch- bzw. Resuspensionsdauer beträgt je nach physikalischen Eigenschaften des Probenmaterials zwischen 5 und 30 s. Durch Austausch des Excenters ist es aber auch in wenigen Minuten für den Service möglich, die Amplitude manuell zu variieren.

Die Kombination des erfindungsgemäßen Systems mit einem Pipettierautomaten ist als solche nicht naheliegend, da hierfür das Vorsehen einer definierten Positionierung der Probengefäße vor und während der Pipettierschritte erforderlich ist. Das Schütteln der Ge­ fäße führt sonst dazu, daß nach jedem Schüttelvorgang die Gefäße sich an einer anderen Position befinden. Sofern die Auslenkung der Bewegungsbahn der Gefäße dazu führen würde, daß der Pipettierautomat eine in das Gefäß zu pipettierende Flüssigkeit neben das Gefäß pipettiert, wäre ein ordnungsgemäßes Durchführen eines automatisierten Verfahrens praktisch schlecht möglich. Deshalb wird dafür gesorgt, daß sich das Gefäß nach dem Schütteln in einer definierten sogenannten Home-Position befindet, in welcher eine Pipettie­ rung oder andere Vorgänge stattfinden können.

Vorteilhaft ist der Einsatz eines Schrittmotors gegenüber dem Einsatz eines DC-Motors für die definierte Home-Position und dem Einsatz mit dem Pipettiervollautomaten. Die Home- Position wird mit einer Lichtschranke detektiert.

In bezug auf die konstruktive Ausführung bestehen noch die folgenden non-invasiven alter­ nativen Möglichkeiten, die aber alle in der Konstruktion (1. und 2.) aufwendiger oder in den Mischschritten (3.) länger dauern:

• 1. Eine Kombination von ein, zwei oder drei linearen Antrieben in der Ebene bzw. im Raum (X-, Y-, Z-Achse) zur Erzeugung von z. B. Lissajous-Figuren.
• 2. Taumeln, Schwenken oder Klopfen des DNA-Moduls.
• 3. Magnetrührer.

Das Probenbearbeitungsgefäß (A) kann prinzipiell jede beliebige Form aufweisen. Solche Probenbearbeitungsgefäße können z. B. die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, z. B. im 96 Wellformat, sein. Bevorzugt handelt es sich jedoch um ein im wesentlichen hohlzylindri­ sches Gefäß, welches eine obere Einlaßöffnung und, besonders bevorzugt, eine untere Aus­ laßöffnung enthält. Ein solches Probenbearbeitungsgefäß kann zur kontaminationsreduzier­ ten Bearbeitung von nukleinsäurehaltigen Proben verwendet werden. Diese Gefäße bestehen bevorzugt aus Kunststoff, z. B. Polypropylen.

Im Anschluß an die Inkubation und Bindung der Kompartimente an die Magnetpartikel werden die biologischen Kompartimente von der sie umgebenden Flüssigkeit der Probe entfernt. Hierzu hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die Magnetpartikel mit den daran gebundenen biologischen Kompartimenten durch Positionierung eines Magneten in der Nähe des Probenbearbeitungsgefäßes zu sammeln. Hierdurch werden bevorzugt die Magnetpartikel mit den biologischen Kompartimenten an der Gefäßwand festgehalten. Im Sinne der Erfindung, als besonders bevorzugt, wird für die Positionierung der Magneten eine Einheit (40) mit einem oder mehreren Permanentmagneten oder Elektromagneten an das Probenbearbeitungsgefäß herangefahren. Die resultierende Entfernung des Magneten vom Probenbearbeitungsgefäß hängt stark von der Größe des durch den Magneten erzielbaren Magnetfeldes und der Größe und Magnetisierbarkeit der Magnetpartikel ab. Außerdem hat die Art der später folgenden Bearbeitungsschritte (z. B. mechanische Belastung der Magneten) einen Einfluß auf die zu verwendende Magnetfeldstärke. Sofern es sich um einen Permanentmagneten handelt, wird dieser aus einer Position, die nicht für eine Abscheidung der Magnetpartikel während des Inkubationsschrittes ausreicht, in die Nähe des Gefäßes gebracht, so daß die Magnetpartikel an der Gefäßwand festgehalten werden. Für den Fall der Verwendung eines Elektromagneten wird dieser eingeschaltet und solange im eingeschalteten Zustand belassen, bis eine Bearbeitung der festgehaltenen biologischen Kompartimente abgeschlossen ist.

Unter der Positionierung eines Magneten in der Nähe des Gefäßes soll auch der Fall verstanden werden, daß das Gefäß in die Nähe des Magneten gebracht wird. Letztendlich kommt es also nur auf die Relativbewegung des Magneten zum Gefäß an.

Die Einheit (40) weist bevorzugt einen Magneten auf, welcher auf einer vorbestimmten Bahn, z. B. über Schienen oder, bevorzugt durch Bewegung des Magneten auf einer Kreisbahn, z. B. um eine neben dem Probengefäß liegende Achse, auf das Probenbearbeitungsgefäß hin beweglich ist. Hierzu zählt außerdem ein Motor, welcher sowohl die Bewegung des Magneten auf das Probenbearbeitungsgefäß zu als auch dessen Wegbewegung realisieren kann. Bevorzugt weist die Einheit (40) einen Zahnriemen auf, der auf einer Seite des DNA- Moduls mit jeweils vier Wellen zur Aufnahme von je 4 Magneten und Zahnrad an den Stirnseiten die Drehbewegung des DC-Motors in die Kreisbewegung der Magneten wandelt. Die beiden Endpositionen werden mit jeweils einer Lichtschranke detektiert. Auf der gegenüberliegenden Seite des DNA-Moduls befindet sich genau die gleiche Anordnung, so daß die Magneten jeder Seite sich synchron entgegengesetzt aufeinander zu bewegen. In diesem Fall werden doppelt so viele Magneten wie Gefäße verwendet. Im Beispielsfall ist der Radius der Kreisbahn ca. 8 mm und der weiteste Abstand des Magneten vom Probengefäß ca. 12 mm.

In einer alternativen Anordnung werden für n Gefäße n+1 Magneten verwendet. Hier werden ein und derselbe Magnet zwischen zwei benachbarte Tubes geführt, man spart also n-1[=2n-(n+1)] Magnete. In der Stellung "ON" übt der Magnet maximale Wirkung auf die Magnetbeads aus. In der Stellung "OFF" ist der Magnet so weit vom Tube entfernt, daß er keine Wirkung auf die Magnetbeads ausübt. Die Fahrzeit (t) zwischen den Endstellungen "ON" bzw. "OFF" beträgt bevorzugt weniger als 1,5 s.

Eine weitere Alternative ist die relativ fixe Positionierung zwischen Magnet und Gefäß, aber die Bewegung eines abschirmenden µ-Metalls zwischen Magnet und Gefäß.

Der Magnet weist eine Masse bevorzugt zwischen 0,5 und 5 g, besonders bevorzugt zwischen 1 und 4 g auf, im speziellen Fall 2,3 g. Die äußeren Abmessungen betragen 10 mm × 10 mm × 3 mm. Als geeignetes Material für einen Permanentmagneten haben sich seltene Erdmaterialien (z. B. NeFeBr, VACODYM 370 HR) mit einem optimalen BH- Maximum bei kleinsten Abmessungen erwiesen. Insofern ist es vorteilhaft, den Gradienten des Magnetfeldes besonders ausgeprägt zu dimensionieren. Aus diesem Grund soll auch die Positionierung des Magneten möglichst nah bei dem Gefäß erfolgen. Es ist bevorzugt, möglichst Probenbearbeitungsgefäße zu wählen, die eine möglichst geringe Dämpfung des Magnetfeldes bewirken, z. B. aus Polypropylen.

Unter der Gefäßwand des Probenbearbeitungsgefäßes wird zur Abscheidung der Beads in der Regel die Innenwand oder ein Teil davon, welche unter der Flüssigkeitsoberfläche der Probe befindlich ist, verwendet. Bevorzugt handelt es sich um eine Seitenwand des Gefäßes.

Anschließend wird die die biologischen Kompartimente umgebende Flüssigkeit aus dem Probenbearbeitungsgefäß entfernt. Dies geschieht unter Bedingungen, bei denen die Magnetpartikel an der Gefäßwand zurückbleiben. Die Art der Entfernung hängt von der Art des Probenbearbeitungsgefäßes ab. Sie kann z. B. abpipettiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform jedoch, bei der das Probenbearbeitungsgefäß eine untere Auslaßöffnung aufweist, wird die Flüssigkeit durch diese einfach abgesaugt. Diese Art der Entfernung hält die mechanische Belastung der Magnetpartikel gering und vermeidet somit die Ablösung der Magnetpartikel von der Gefäßwand.

Ein besonders wichtiger Schritt ist die Resuspension der an der Gefäßwand zurückgehaltenen Magnetpartikel in einer zugegebenen zweiten Flüssigkeit. Hierzu wird der Magnet aus der Nähe des Gefäßes entfernt, so daß die Magnetpartikel nicht mehr durch den Magneten an der Gefäßwand festgehalten werden. Wie oben beschrieben, ist es auch möglich, das Gefäß aus der Nähe des Magneten zu entfernen. Gemäß der vorliegenden Erfindung hat sich das einfache Entfernen des Magneten als nicht für eine ausreichende Resuspension erwiesen, wenn nicht das Gefäß ergänzend, bevorzugt gleichzeitig geschüttelt wird. Dieses Schütteln wird wiederum durch die Einheit 30 durchgeführt. Sie bewirkt eine gleichmäßige Verteilung der Magnetpartikel in der zweiten Flüssigkeit. Diese zweite Flüssigkeit kann vor Entfernen des Magneten, jedoch auch erst nach Entfernen des Magneten in das Probenbearbeitungsgefäß eingefüllt werden, z. B. durch Einpipettieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur weiteren Aufreinigung von biologischen Kompartimenten verwendet werden., Hierzu wird eine Suspension der Magnetpartikel, welche die biologischen Kompartimente gebunden enthalten, in einem Probenbearbeitungsgefäß so in Relation zu einem Magneten positioniert, daß die Magnetpartikel mit den biologischen Kompartimenten an der Gefäßwand festgehalten werden, anschließend die Flüssigkeit, welche die biologischen Kompartimente enthielt, aus dem Gefäß entfernt wird und anschließend die Magnetpartikel in einer zweiten Flüssigkeit, hier einer Waschflüssigkeit, durch Entfernen des Magneten aus der Nähe des Gefäßes, so daß die Magnetpartikel nicht mehr durch den Magneten an der Gefäßwand festgehalten werden, und gleichzeitig Schütteln des Gefäßes resuspendiert. Dieser Waschvorgang kann beliebig wiederholt werden, bis eine ausreichende Reinheit der biologischen Kompartimente erreicht ist.

Als weiterer Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist anschließend der Aufschluß (Lyse) der biologischen Kompartimente vorgesehen. Verfahren zum Aufschluß biologischer Kompartimente sind dem Fachmann ebenso bekannt, wie die spezifischen Bedingungen für bestimmte Arten von Kompartimenten, z. B. Zellen. Beispielsweise werden für den Aufschluß von Bakterien die biologischen Kompartimente mit einer Mischung von Proteinase K versetzt und für eine bestimmte Zeit inkubiert, die für das Aufbrechen bzw. den teilweisen oder vollständigen Verdau der Zellwände unter Freisetzung der in den biologischen Kompartimenten enthaltenen Nukleinsäuren inkubiert wird. Dabei wird bevorzugt bei Temperaturen über Raumtemperatur, besonders bevorzugt zwischen 70 und 95°C gearbeitet. Die Mischung, welche durch den Aufschluß der Zellen erzeugt wird, wird im folgenden auch als Aufschlußmischung bezeichnet. Die Inkubation wird vorzugsweise über eine Zeit von 5 bis 20, besonders bevorzugt zwischen 10 und 15 Minuten durchgeführt.

Insbesondere, wenn der Aufschluß der Zellen bei Raumtemperatur oder geringfügig erhöhter Temperatur stattgefunden hat, ist es bevorzugt, die Aufschlußmischung anschließend auf höhere Temperaturen zu erhitzen, beispielsweise auf 70°C, oder, bei potentiell infektiösen Proben, auf 95°C. Hierbei kann gewünschtenfalls auch das Lysereagenz, sollte es bei weiteren Schritten stören, inaktiviert werden.

Heizung bzw. Kühlung der Flüssigkeit in den Probengefäßen wird erfindungsgemäß durch eine Einheit 20 vorgenommen. Diese Einheit, welche aus prinzipiell für Thermostate üblichen Baueinheiten besteht, ist vorzugsweise teilweise in die Einheit 10, in welcher die Probenbearbeitungsgefäße positioniert werden können, integriert. Sie enthält insbesondere einen Block aus Metall, welcher wärmeleitende Eigenschaften hat. Dieser ist auf die äußere Form der Probenbearbeitungsgefäße abgestimmt und wird bevorzugt über ein flüssiges Medium thermostatisiert. Je nach in dem Probenbearbeitungsgefäß durchzuführenden Reaktionsschritt wird die Temperatur dieses Blocks erhöht bzw. erniedrigt. Als flüssiges Medium können bekannte Mittel dienen. Das Medium wird bevorzugt über flexible Schläuche von einer Heizung bzw. Kühlung mittels einer Umwälzpumpe in den Block transportiert. Die Verwendung flexibler Schläuche ermöglicht auch die Befestigung der stationären Komponenten, wie der Heizung, der Kühlung und der Umwälzpumpe auf dem während des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht mit der Einheit 10 mitbewegten Rahmen des Gerätes. Dies wird insbesondere dadurch ermöglicht, daß die Auslenkungen während der Schüttelbewegungen nur relativ klein sind.

Anschließend wird die Aufschlußmischung abgekühlt, und zwar unter Bedingungen, die abhängig sind vom Zweck des erfindungsgemäßen Verfahrens. Soll eine Isolierung der Nukleinsäuren an einer festen Phase stattfinden, werden Bedingungen eingestellt, bei denen die Nukleinsäure an diese feste Phase binden können. Ein geeignetes Verfahren zur Bindung von Nukleinsäuren ist die Inkubation der freigesetzten Nukleinsäuren mit Glasoberflächen unter Anwesenheit chaotroper Salze. Ein solches Verfahren ist beispielsweise beschrieben in EP-A-0 389 063. Hierbei werden die Nukleinsäuren in unspezifischer Weise an die Glasoberfläche gebunden, während andere Bestandteile der biologischen Kompartimente sowie der Aufschlußreagenzien nicht oder nur unwesentlich an die Glasoberfläche gebunden werden. Bevorzugt wird anschließend die Flüssigkeit, welche die übrigen Bestandteile enthält, aus dem Probenbearbeitungsgefäß entnommen, z. B. abgesaugt, während die Glasoberfläche mit den daran gebundenen Nukleinsäuren im Probenbearbeitungsgefäß verbleiben kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine feste Phase in Form eines Glasfaservlieses in das Probenbearbeitungsgefäß eingeführt und mit der Mischung inkubiert. Hierdurch werden die Nukleinsäuren an der Glasfaser immobilisiert und können auf einfache Weise mit dem Glasfaservlies aus dem Probenbearbeitungsgefäß entnommen werden.

Für den Fall, daß die Nukleinsäuren nach ihrer Freisetzung nachgewiesen werden sollen, werden diese mit einer Sonde hybridisiert. Bei dieser Sonde handelt es sich, wie oben beschrieben, um ein Molekül, welches eine zu der nachzuweisenden Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementären Basensequenz aufweist. In einem bevorzugten Falle handelt es sich um ein Oligonukleotid, welches mit einer nachweisbaren Gruppe markiert ist. Die Abkühlung der Reaktionsmischung findet daher unter Bedingungen statt, bei denen eine Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit der Nukleinsäuresonde stattfindet. Diese Temperaturen sind einem Fachmann bekannt. In einer anderen Ausführungsform als Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren findet eine Hybridisierung zwischen der nachzuweisenden Nukleinsäure und einer Festphasen-gebundenen Nukleinsäuresonde statt. Hierbei kann die Sonde an eine beliebige Festphase, solange sie nur von der übrigen Reaktionsmischung abtrennbar ist, verwendet werden, z. B. Mikrotiterplatten-Kavitäten oder die Innenwand des Probenbearbeitungsgefäßes. Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuresonden, insbesondere der sogenannten Fangsonden, sind dem Fachmann bekannt, z. B. aus EP-A-0 523 557.

Im allgemeinen wird sich an die Abkühlung der Mischung eine Abtrennung der zu isolierenden bzw. nachzuweisenden Nukleinsäuren von der sie umgebenden Flüssigkeit, welche ggf. noch Reste der Aufschlußmischung und evtl. der für die Bindung der Nukleinsäuren an eine feste Phase benutzten Reagenzien enthält, anschließen. Hierzu kann, je nach Art der verwendeten festen Phase, eine Filtration oder eine Entfernung der festen Phase aus dem Probenbearbeitungsgefäß oder Abpipettieren der Flüssigkeit aus dem Probenbearbeitungsgefäß vorgenommen werden.

Die gebundenen Nukleinsäuren stehen anschließend entweder zur Aufhebung ihrer Bindung an die feste Phase oder ihren direkten Nachweis in üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen oder einer Markierung zur Verfügung.

Das erfindungsgemäße Verfahren benutzt daher eine Kombination von Bearbeitungsschritten, welche eine Einheit 10 zur Aufnahme eines oder mehrerer Probenbearbeitungsgefäße, eine Einheit 20 zur Thermostatisierung der Probenbearbeitungsgefäße und darin enthaltener Flüssigkeiten, eine Einheit 30 zum Schütteln der Probenbearbeitungsgefäße und eine Einheit 40 zur magnetischen Abscheidung der Magnetpartikel an eine Wand jedes Probenbearbeitungsgefäßes verwenden. Überraschenderweise lassen sich diese Verfahrensschritte und Einheiten in einem einzigen Reaktionsblock ausführen. Als Reaktionsblock wird hiermit eine Vorrichtung verstanden, welche die Einheiten 10, 20, 30 und 40 teilweise oder vollständig in aufeinander abgestimmter Kopplung enthält. Auf erfindungsgemäße Weise gelingt es auf einfache Weise einen Vorgang, welcher bisher eine Vielzahl manueller Arbeitsschritte voraussetzte, in einem einzigen Gerät ablaufen zu lassen. Insbesondere hat es sich erwiesen, daß die erfindungsgemäßen Reaktionsblocks besonders effektiv sind. Verfahren zur Freisetzung und Isolierung von Nukleinsäuren können mit ihnen schneller durchgeführt werden als bisher. Es ist darüber hinaus möglich, während der genannten Schritte die Nukleinsäure nicht aus dem Gefäß zu entfernen. Dies stellt sowohl im Hinblick auf den Zeitaufwand, als auch auf die Vermeidung von Kontaminationen einen erheblichen Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar. Üblicherweise wurden bisher nämlich Abkühlungen von Suspensionen durch manuelle Entnahme eines Probenbearbeitungsgefäßes aus dem Gerät und Eintauchen des Gefäßes in ein Kühlbad durchgeführt. Ein solches Vorgehen hat sich als für die Zukunft in der Routinediagnostik nicht ausreichend geeignet erwiesen.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist daher ein System zur Freisetzung und/oder Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Suspension von biologischen Kompartimenten, enthaltend die Komponenten

• - eine Einheit 10 zur Aufnahme eines oder mehrerer Probenbearbeitungsgefäße (A),
• - eine Einheit 20 zur Thermostatisierung der Probenbearbeitungsgefäße (A) und darin enthaltener Flüssigkeiten,
• - eine Einheit 30 zum Schütteln der Probenbearbeitungsgefäße (A) und
• - eine Einheit 40 zur magnetischen Abschaltung der Magnetpartikel an eine Wand jedes Probenbearbeitungsgefäßes (A),

in aufeinander abgestimmter Kopplung.

Die Einheit 10 hat bevorzugt die Möglichkeit der Aufnahme mehrerer Probenbearbeitungsgefäße. Besonders bevorzugt besteht die Möglichkeit der Aufnahme von Mikrotiterplatten im 96 Well-Format. Bevorzugt enthält dieses System zusätzlich eine Einheit 50 zur Entfernung von Flüssigkeit aus dem Probenbearbeitungsgefäß (A). Ebenfalls bevorzugt sind die Einheiten 40 und 10 relativ zueinander beweglich gelagert. Außerdem bevorzugt weisen die Probenbearbeitungsgefäße (A) eine untere Auslaßöffnung (A11) auf, die mit einer Saugvorrichtung 50 verbunden sind oder verbunden werden können.

In Fig. 1 und 2 ist ein System mit erfindungsgemäßen Einheiten schematisch gezeigt:

Das Modul 10 nimmt ein oder mehrere Probenbearbeitungsgefäße (A) auf und sorgt dafür, daß der Wärmeübergang entsprechend den geforderten Heiz- und Kühlraten optimiert ist. Das Modul sorgt für eine minimale Abweichung der Temperatur von Kavität zu Kavität. Das Modul nimmt das Temperaturmedium (z. B. Wasser) auf und gibt die Wärme bzw. Kälte zielgerichtet in Richtung Probenbearbeitungsgefäß.

Das Modul nimmt die Mechanik 40 zur Bewegung der Magneten auf (Magneten und Drehachsen). Der Motor kann sich außerhalb des Moduls befinden, z. B. auf dem Rahmen positioniert.

Das Modul verbindet die Probenbearbeitungsgefäße zum gemeinsamen Mischen. Das Modul ist mit der Mischeinrichtung 30 verbunden.

Das Modul nimmt die Absaugschläuche 51 für die Absaugung der aus den Probengefäßen zu entfernenden Flüssigkeiten (den Waste) auf. Das Modul ist zwischen Probenbearbeitungsgefäß und einem Sockel 13, z. B. aus Polysulfon, abgedichtet, damit beim Absaugen des Waste keine Luft zwischen Probenbearbeitungsgefäß und Inlet 14, Block, z. B. aus Aluminium mit Löchern 12, angesaugt wird.

Das Modul hat eine leicht zu reinigende Oberfläche und schützt den Anwender vor Verbrennungen (z. B. durch einen Kunststoffmantel).

Einheit 20 besteht im wesentlichen aus flüssigen Temperierelementen, einem 3/2-Wege- Ventil, Leitungen 21, Heizung, Kühler und Umwälzpumpe. Das Temperierreservoir außerhalb des Moduls ist um ein Vielfaches größer als das Totvolumen des DNA-Moduls damit beim Umschalten des 3/2-Wege-Ventils die Störgröße minimiert wird. Die Heizung und der Kühler temperieren im Vorlauf und werden bei Bedarf getaktet. Eine Regelung schaltet das Ventil, Heizung und Kühlung, zusammen mit dem geeigneten Volumenstrom der Umwälzpumpe werden die gewünschten Heiz- und Kühlraten erreicht.

Alternativ besteht die Einheit 20 aus trockenen Temperierelementen. Die Heizstäbe zum Heizen und Peltiers zum Kühlen sind direkt in dem DNA-Modul integriert. Vorteil: Kein Liquid-Flow-System in diesem extremen Temperaturbereich.

Die Einheit 30 mischt und resuspendiert. Ein Schrittmotor mit einem Exzenter und einer Ausgleichsmasse treiben von einem festen Rahmen, das über Schwingungsdämpfer 11 aufgesetzte komplette DNA-Modul in eine kreisförmige exzentrische Bahn fester Amplitude und variabler Frequenz. Die Amplitude ist A 1,5 mm, die Frequenz 1 f 50 Hz. Die Misch- bzw. Resuspensionsdauer beträgt je nach physikalischen Eigenschaften des Probenmaterials zwischen 5 < t < 30 s. Durch Austausch des Excenters ist es aber auch in wenigen Minuten möglich, die Amplitude manuell zu variieren.

Die Einheit 40 besteht aus einem Zahnriemen, der auf einer Seite des DNA-Moduls mit jeweils vier Wellen zur Aufnahme von je 4 Magneten und Zahnrad an den Stirnseiten die Drehbewegung des DC-Motors in die Kreisbewegung der Magneten wandelt. Die beiden Endpositionen werden mit jeweils einer Lichtschranke detektiert. Auf der gegenüberliegenden Seite des DNA-Moduls befindet sich genau die gleiche Anordnung, so daß die Magneten jeder Seite sich synchron entgegengesetzt aufeinander zu bewegen. In diesem Fall werden doppelt so viele Magneten wie Gefäße verwendet.

In einer alternativen Anordnung werden für n Gefäße n+1 Magneten verwendet. Hier werden ein und derselbe Magnet zwischen zwei benachbarte Gefäße geführt, man spart also n-1 [= 2n-(n+1)] Magnete. In der Stellung "ON" übt der Magnet maximale Wirkung auf die Magnetbeads aus. In der Stellung "OFF" ist der Magnet so weit vom Gefäß entfernt, daß er keine Wirkung auf die Magnetbeads ausübt. Die Fahrzeit zwischen den Endstellungen "ON" bzw. "OFF" beträgt t < 1,5 s.

Die Kopplung der Komponenten des Systems ist einerseits funktionell, z. B. durch Integration der Magneten in die Einheit 10, und andererseits zeitlich zu verstehen, z. B. durch Steuerung des Betriebs der Einheiten in für die gewünschte Anwendung geeigneter Abfolge; dies kann beispielsweise geschehen durch ein Computerprogramm oder durch Initiation der einzelnen Teilschritte durch den Anwender.

In Fig. 3 ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren gezeigt. Auf diese Figur wird bei der im folgenden Beispiel beschriebenen Schilderung eines Verfahrens Bezug genommen. Das Probengefäß befindet sich in einer Aufnahme in Einheit 10, wobei bevorzugt am Probengefäß ein Steg A20 vorgesehen ist, der der Innenform der Aufnahme angepaßt ist (z. B. konische Außenform). Die im Längsschnitt gezeigten Gefäße können auf einfache Weise spritzgußtechnisch aus Polypropylen hergestellt werden.

Ein Hauptvorteil der Erfindung ist, daß das System in weitem Umfang auf die Verwendung unterschiedlicher Größen von Magnetpartikeln adaptiert werden kann. Es ist relativ flexibel und in unterschiedlichsten Verfahren einsetzbar.

Durch das folgende Beispiel wird der Gegenstand der Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein Verfahren, dessen Grundzüge dem Fachmann aus der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im folgenden nicht ausgeführt sind, wird vollinhaltlich auf Molecular Cloning, Herausgeber J. Sambrook et al., CSH 1989 Bezug genommen.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Aufarbeitung nukleinsäurehaltiger Probenlösungen, werden folgende Arbeitsschritte durchgeführt (siehe Fig. 3). In einem ersten Schritt (I) wird eine zellhaltige Probenflüssigkeit in einem Probegefäß A mit einem Material inkubiert, an welches die Zellen gebunden werden, aus denen Nukleinsäuren gewonnen werden sollen. Hierzu kann dieses Material entweder spezifische Bindeeigenschaften für die Oberfläche der Zellen aufweisen, z. B. durch Immobilisierung von Antikörpern gegen Oberflächenantigene oder ein Absorbermaterial (A16, nicht gezeigt), es kann jedoch auch ein Material mit Filtereigenschaften (A15, nicht gezeigt) vorgesehen sein, durch welches die Zellen zurückgehalten werden, wenn die Flüssigkeit durch das Material durchtritt, z. B. aus dem Probengefäß entfernt wird. Bedingungen für die Immobilisierung von Zellen an Oberflächen sind dem Fachmann bekannt, z. B. aus Methods in Enzymology Vol. 171, Biomembranes/Part R Transport Theory: Cell and Model Membranes, Edited by Sidney Fleischer, Becca Fleischer, Department of Molecular Biology, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, Seiten 444 ff oder 581 ff.

Während der Inkubation ist das Probengefäß bevorzugt durch einen Deckel B verschlossen, um aktiven bzw. passiven Kontaminationsschutz zu gewährleisten.

In einem weiteren Schritt wird die Flüssigkeit aus dem Probengefäß entfernt, während Zellen, deren Nukleinsäuren isoliert werden sollen, in an das Material gebundenem Zustand im Probengefäß zurückbleiben. Da es sich bei dem zellbindenden Material um partikuläre Materialien handelt, kann ein Zurückhalten dadurch erreicht werden, daß das Material magnetisch ist (Hersteller: Dynal, Oslo, Norwegen) und der Magnet von außen an das Probengefäß herangeführt wird. Die Flüssigkeit kann durch die Auslaßöffnung A11 unter Anlegen eines leichten Vakuums, abgesaugt werden. Hierzu ist an der Auslaßöffnung ein Ventil vorgesehen, welches sich durch Anlegen von Unterdruck öffnet.

Zur weitergehenden Entfernung eventuell störender Probenbestandteile von den Zellen werden ein oder mehrere Waschschritte vorgesehen. Hierzu wird das Probengefäß eine Waschflüssigkeit eingefüllt, in der sich eventuell Verunreinigungen lösen, die jedoch die Bindung der Zellen an die Oberfläche des zellbindenden Materials nicht wesentlich beeinträchtigen. Solche Waschlösungen sind dem Fachmann z. B. aus den Zellseparationsprotokollen bzw. aus entsprechenden Reinigungskitsprotokollen für Nukleinsäuren bekannt. Sie richten sich im wesentlichen nach der Art der Bindung der Zellen an das Material.

Nachdem gegebenenfalls die letzte Waschlösung aus dem Probengefäß A abgesaugt wurde, werden die gereinigten, angereicherten Zellen mit einer geeigneten Lyseflüssigkeit zur Freisetzung der Nukleinsäuren aus den Zellen in Kontakt gebracht. Die Reagenzien dieser Lyselösung richten sich weitgehend nach der Art der immobilisierten Zellen (Rolfs et al.: PCR, Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992, S. 84 ff). Sofern es sich bei den Zellen um Bakterien handelt, enthält die Lyselösung bevorzugt Proteinase K zum Abbau der Zellwand. Gewünschtenfalls wird die Lyse durch Erhitzen bzw. Abkühlen sowie Mischen der Reaktionsmischung durch Schütteln des Probengefäßes unterstützt. Am Ende dieses Aufschlusses liegen die zu isolierenden Nukleinsäuren frei in der Lösung vor.

Auch während der Lyse ist das Reaktionsgefäß bevorzugt durch einen Deckel verschlossen, um Kontaminationen aus der Umgebung zu verhindern. Nach Ende der Lyse wird der Deckel, bevorzugt mit Hilfe einer entsprechenden mechanischen Vorrichtung, entfernt. Danach wird in das Probengefäß, welches eine Mischung von Abbauprodukten der Zellen sowie die Nukleinsäuren enthält, ein Formkörper C eingeführt, dessen äußere Kontur C12 auf die innere Kontur A17 des Probengefäßes abgestimmt ist. Dieser Formkörper ist hohl und in Richtung auf das Probengefäß und die Relationsmischung hin durch einen Filter C11 (poröse Matrix) verschlossen. Die Einführung des Formkörpers C erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines Bauelementes B11 des Deckels B, der außerdem ein Bauelement B10 enthält, welches zum Verschluß des Probengefäßes geeignet ist. In diesem Fall wird der Formkörper mit dem Deckel ergriffen (II) und gleichzeitig mit dem Verschluß des Probengefäßes in das Probengefäß eingeführt. Während dieses Vorgangs wird außerdem die Reaktionsmischung durch den Filter C11 in den Hohlraum C14 des Formkörpers eindringen (IV). Durch das Vorsehen des Filters können einerseits große Partikel an dem Eintritt in den Hohlraum gehindert werden und andererseits wird wegen der nukleinsäurebindenden Eigenschaften schon während des Durchtritts der Reaktionsmischung eine Bindung der Nukleinsäuren an den Filter erreicht. In diesem Fall wird ein glasfaserhaltiges Filtermaterial gewählt.

In einem nächsten Schritt wird die verbleibende Lysereaktionsmischung aus der durch A und C gebildeten Vorrichtung entfernt durch Absaugen durch die Auslaßöffnung A11 im Probengefäß. Auch die in den Hohlkörper C14 des Formkörpers eingedrungene Lösung wird somit entfernt, so daß der Filter möglichst keine Flüssigkeitsreste mehr enthält. Danach wird der bisher verwendete Deckel B entfernt, wobei der Formkörper C zunächst im Probengefäß verbleibt (eingerastet) (V).

Gleichzeitig oder anschließend wird ein Elutionsgefäß D zur Aufnahme des Formkörpers C vorbereitet (entweder im erfindungsgemäßen System oder außerhalb). Ein gegebenenfalls auf diesem Gefäß befindlicher Deckel wird entfernt (VI). Bevorzugt wird vor Überführung des Formkörpers C in das Elutionsgefäß D eine Elutionslösung in das Elutionsgefäß vorgelegt, z. B. einpipettiert. Die Zusammensetzung der Elutionslösung richtet sich nach der Art der Bindung der Nukleinsäuren an das Material im Filter C. Sie enthält Reagenzien, unter deren Einwirkung die immobilisierten Nukleinsäuren von dem Material eluiert, d. h. gelöst, werden. Der ursprünglich das Elutionsgefäß verschließende Deckel B wird auf das Probengefäß A mit dem Formkörper C aufgesteckt (VII).

Zur Entnahme des Formkörpers C aus dem Probengefäß A wird der Formkörper C mit dem Deckel B entfernt (VIII). Die Kombination aus Deckel und Formkörper wird anschließend in das Elutionsgefäß eingeführt (IX). Bevorzugt enthält der Formkörper C Mittel (C13, nicht gezeigt) zur Fixierung des Formkörpers im Elutionsgefäß D, die bewirken, daß der Formkörper nur unter Zerstörung des Formkörpers C oder des Gefäßes D oder mit einer Kraft, die größer ist als die Kraft, die zur Lösung des Deckels B vom Formkörper C erforderlich ist, aus dem Gefäß D entfernt werden kann. Eine Entfernung des Formkörpers aus dem Elutionsgefäß ist nicht beabsichtigt.

Während des Eindringens des Formkörpers C in das Elutionsgefäß dringt die vorgelegte Elutionslösung in den Filter C11 und die löst die immobilisierte Nukleinsäure von der festen Matrix ab. Je nach Menge der vorgelegten Elutionslösung wird entweder nur der Filter mit der Elutionslösung getränkt oder dringt die Elutionslösung mit den wieder gelösten Nukleinsäuren in den Hohlkörper C14 ein. Damit die Elution der Nukleinsäuren möglichst vollständig verläuft, sollte die Innenkontur des Elutionsgefäßes möglichst dicht an die Außenkontur des Formkörpers angepaßt sein.

In einem folgenden Schritt wird der Deckel B von der Kombination aus Formkörper C und Elutionsgefäß D entfernt (X). Er wird benutzt, um einen Stempel E aufzunehmen (XI) und in den Hohlraum des Formkörpers C einzuführen (XII). Dieser Deckel greift von innen in den Stempel E. Der Stempel wird so kräftig gegen den Filter C11 gepreßt, daß Flüssigkeit aus dem Filter durch eine in der Andrucksfläche befindliche Öffnung in einen Innenraum des Stempels eindringt. Dieser Vorgang ist besonders effektiv, wenn die Andrucksfläche in ihrer äußeren Kontur zumindest in dem Bereich, in dem die Auspressung stattfinden soll, an die innere Kontur des Formkörpers C angepaßt ist. Der Stempel E kann bevorzugt in dieser Lage, z. B. durch Einrasten, fixiert werden. Da die so gebildete Vorrichtung durch den Deckel relativ gut verschlossen ist, kann die nukleinsäurehaltige Lösung in der Vorrichtung aufbewahrt werden.

Zur Entnahme einer gewünschten Menge an Nukleinsäurelösung kann der Deckel entfernt (XIII) und über eine Öffnung des Innenraums des Stempels die gewünschte Menge entnommen, z. B. in einem Pipettiervorgang (XIV). Anschließend kann der Deckel wieder aufgesetzt werden.

Im folgenden wird das zu dem geschilderten Verfahren passende Ablaufschema angegeben.

Manuelle Arbeitsschritte sind fettgedruckt dargestellt. Nicht-manuelle Arbeitsschritte oder Teilabläufe werden durch Betätigen beispielsweise einer Taste aufgerufen.

Im folgenden werden das Probengefäß A als Tube, Elutionsgefäß D als Back-Up-Gefäß, Formkörper C als Glasvlieseinsatz und Stempel E als Auspreßstempel bezeichnet.

Gewünschtenfalls werden die Absaugschläuche und die Ausnehmungen mittels einer Reinigungsflüssigkeit gespült und somit gereinigt (vor bzw. nach Durchführung des Verfahrens und in Abwesenheit der Probengefäße.

Bezugszeichenliste

A Probengefäß

10 Einlaßöffnung
11 Auslaßöffnung
17 innere Form
19 Außenform
20 umlaufender Steg
22 Element zur Fixierung von weiteren Funktionselementen

B Deckel

10 Bauelement zum Verschließen des Probengefäßes A
11 Bauelement zum Ergreifen des Formkörpers C

C Formkörper

11 poröse Matrix
12 äußere Kontur
13 Mittel zur Fixierung des Formkörpers im Elutionsgefäß
14 Hohlkörper
15 Mittel zur Befestigung eines Deckels
16 innere Kontur
17 Mittel zur Fixierung eines Stempels E, umlaufend
18 umlaufender Steg, abbrechbar
19 Rand

D Elutionsgefäß

12 Einrastkerbe

E Stempel

10 Andrucksfläche
11 Außenkontur
12 Innenraum
13 Öffnungen in der Andrucksfläche
14 Entnahmeöffnung
15 Dichtung
16 Einrastring
17 Aussparung

Gerät

 1 Rahmen
10 Einheit zur Aufnahme von Probengefäßen
11 Schwingungsdampf
12 Loch zur Aufnahme von A
13 Sockel
14 Inlet zum Heizen und Kühlen von A
20 Einheit zur Thermostatisierung von Probengefäßen
21 Kühl-/Heizmittel-Leitung
30 Einheit zum Schütteln von Probengefäßen/Excentermotor
40 Einheit zur magnetischen Abscheidung von Magnetpartikeln
41 Achsen zum Drehen der Magnetsegmente
42 Magnetsegmente
50 Vakuumpumpe
51 (Unterdruck-)Schlauch

Claims (10)

1. Verfahren zur Freisetzung und Isolierung oder zur Freisetzung und Nachweis von Nukleinsäuren aus biologischen Kompartimenten einer Probe, enthaltend die Schritte:

• - Inkubation der Probe in einem Probenbearbeitungsgefäß zusammen mit Magnetpartikel, welche die biologischen Kompartimente binden können, unter Schütteln des Probenbearbeitungsgefäßes,
• - Positionierung eines Magneten in der Nähe des Gefäßes, so daß die Magnetpartikel an der Gefäßwand festgehalten werden,
• - Entfernen der resultierenden Flüssigkeit aus dem Gefäß
• - Resuspension der Magnetpartikel in einer zweiten Flüssigkeit durch
  • a) Entfernen des Magneten aus der Nähe des Gefäßes, so daß die Magnetpartikel nicht mehr durch den Magneten an der Gefäßwand festgehalten werden und gleichzeitig
  • b) Schütteln des Gefäßes,
• - Aufschluß der unter Herstellung einer Aufschlußmischung,
• - Erwärmung der Aufschlußmischung,
• - Abkühlung der Mischung unter Bedingungen, die die Isolierung oder Hybridisierung der zu isolierenden oder nachzuweisenden Nukleinsäure ermöglichen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der genannten Schritte die Nukleinsäuren nicht aus dem Gefäß entfernt werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Schritte in einem einzigen Reaktionsblock stattfinden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Partikel eine Größe von mehr als 2,8 µm haben.

5. System zur Freisetzung und Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Suspension von biologischen Kompartimenten mit Magnetpartikeln enthaltend die Komponenten

• - eine Einheit (10) zur Aufnahme eines oder mehrerer Probenbearbeitungsgefäße (A),
• - eine Einheit (20) zur Thermostatisierung der Probenbearbeitungsgefäße (A) und darin enthaltenen Flüssigkeiten,
• - eine Einheit (30) zum Schütteln der Probenbearbeitungsgefäße (A),
• - eine Einheit (40) zur magnetischen Abscheidung der Magnetpartikel an eine Wand jedes Probenbearbeitungsgefäßes (A),

in aufeinander abgestimmter Kopplung.

6. System gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Einheit (50) zur Entfernung von Flüssigkeit aus dem Probenbearbeitungsgefäß (A) enthält.

7. System gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Einheiten (40) und (10) relativ zueinander beweglich gelagert sind.

8. System gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenbearbeitungsgefäße (A) eine untere Auslaßöffnung (A11) aufweisen, die mit einer Saugvorrichtung (70) verbunden ist oder verbunden werden kann.

9. System gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Vielzahl von Probenbearbeitungsgefäßen (A) enthält.