ES2206565T3 - Sistema para liberar y aislar acidos nucleicos. - Google Patents
Sistema para liberar y aislar acidos nucleicos.Info
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Abstract
UN PROCEDIMIENTO PARA LIBERAR Y AISLAR ACIDOS NUCLEINICOS DE COMPARTIMENTOS BIOLOGICOS DE UNA MUESTRA NECESITA UN APARATO APTO PARA LA RECOGIDA DE UNO O VARIOS RECIPIENTES PARA EL TRATAMIENTO DE LA MUESTRA; PARA EL CONTROL TERMOSTATICO DE LOS RECIPIENTES PARA EL TRATAMIENTO DE LA MUESTRA; PARA AGITAR LOS RECIPIENTES PARA EL TRATAMIENTO DE LA MUESTRA Y PARA LA PRECIPITACION MAGNETICA DE PARTICULAS MAGNETICAS. CON ELLO, SE SIMPLIFICA CONSIDERABLEMENTE EL AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEINICOS.
Description
Sistema para liberar y asilar ácidos
nucleicos.
Son objeto de la invención un sistema para
liberar y aislar ácidos nucleicos y un procedimiento para la
utilización de dicho sistema.
Los sistemas de detección que se basan en la
determinación de los ácidos nucleicos de una muestra están cobrando
un renovado interés en los últimos tiempos. Esto se debe, entre
otras cosas, a la especificidad que se puede lograr con esta
detección. En este sentido, las detecciones de ácidos nucleicos son
en principio mejores que (superiores a) las detecciones de
antígenos. Los antígenos suelen estar presentes en las muestras de
una forma relativamente accesible, mientras que los ácidos
nucleicos, en especial en las detecciones de organismos, requieren
por lo general varias etapas para hacerse accesibles. Por otro lado,
los ácidos nucleicos habitualmente están presentes en
concentraciones muy bajas. En particular para el aislamiento de
ácidos nucleicos a partir de muestras celulares se han practicado
hasta el presente procedimientos de purificación laboriosos.
La sensibilidad de los sistemas de
enriquecimiento y de preparación de muestras actualmente disponibles
en el mercado para ácidos nucleicos a menudo no es lo
suficientemente elevada. Cuando se preparan muestra con
procedimientos automatizados, a menudo la seguridad de evitar la
contaminación no es suficiente como para permitir una amplificación
p.ej. mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Además,
los sistemas de preparación de muestras actualmente disponibles
requieren disolventes orgánicos (mezclas de fenol- y/o
cloroformo-alcohol) para la obtención de los ácidos
nucleicos.
Los procedimientos empleados actualmente
recurriendo a la inmovilización de los ácidos nucleicos aplican
fundamentalmente dos principios para aislar los ácidos nucleicos. En
una primera posibilidad se succionan las muestras líquidas que
contienen los ácidos nucleicos a través de una matriz de fase fija,
con lo cual los ácidos nucleicos quedan retenidos en la matriz de
fase fija. Esto presupone la realización previa de una etapa de
lisis, que tendría lugar en un recipiente aparte. A continuación se
separan los ácidos nucleicos de la matriz de fase fija por succión
de un líquido eluyente a través de ella. La solución de elución de
los ácidos nucleicos se trasvasa por succión a un recipiente en el
que se procesa. Sin embargo, se ha constatado que los dispositivos
empleados actualmente no son satisfactorios en lo que respecta a la
pureza requerida para la ejecución de una operación ulterior de
amplificación, p.ej. la PCR.
Según el segundo principio se precipitan los
ácidos nucleicos y se separan mediante una centrífuga. Sin embargo,
para este procedimiento es imprescindible trabajar en un sistema
operativo por partidas (batch, es decir, discontinuo). En tal
procedimiento se trata por ejemplo una solución que contiene células
en un primer recipiente de reacción con agentes lisantes. A
continuación se trasvasa por pipeteo la mezcla reaccionante de este
recipiente a un tubo de centrifugación. Este tubo tiene una pieza
intercalada en el que pueden adsorberse los ácidos nucleicos
liberados, mientras que el resto del líquido puede ocupar la zona
inferior del tubo durante la centrifugación. Para lavar los ácidos
nucleicos absorbidos se trata dicha pieza intercalada una o varias
veces con un líquido de lavado. Para ello, la pieza intercalada
tiene que trasladarse a otro tubo de centrifugación, con el fin de
que los restos del líquido de muestra no mojen otra vez dicha pieza
intercalada. En la última etapa, la pieza intercalada se coloca en
un nuevo recipiente. Los ácidos nucleicos se trasladan por
centrifugación de una solución de elución a través de la pieza
intercalada a otro recipiente, en el que existe una solución idónea
para el procesado posterior. Sin embargo, este procedimiento adolece
por un lado de un gran riesgo de contaminación y requiere por otro
lado un gran número de cambios de recipientes de reacción.
En el documento
EP-A-0 265 244 se describe un
procedimiento y un dispositivo, en el que se realiza la detección
de los ácidos nucleicos mediante la fijación sobre partículas
magnéticas y la separación de dichas partículas magnéticas. En el
método descrito se efectúan etapas de calentamiento, de agitación y
de separación magnética. Para ello, la muestra se disgrega antes de
efectuar la separación de las partículas magnéticas. Además, las
distintas etapas del proceso se efectúan en diversos emplazamientos
(estaciones) de modo que se requiere el transporte de la muestra a
través de los distintos emplazamientos.
En el estado de la técnica se conoce además el
documento WO 92/05443, en el que se describe un aparato para la
separación de las partículas magnéticas cargadas con reactivo. En el
documento se describe un dispositivo combinado de
separación/agitación, que trabaja con placas de microvaloración.
Es objetivo de la presente invención consiste en
desarrollar un sistema que permita superar totalmente o por lo
menos parcialmente los inconvenientes del estado de la técnica. En
particular, con este sistema los ácidos nucleicos pueden absorberse
y desorberse de una matriz de fase fija, sin que para estas etapas
se requiera el uso de una centrífuga.
Un aspecto importante de la invención consiste en
un alojamiento para el recipiente de procesado de las muestras, que
puede mantenerse a temperatura constante y puede ponerse en
movimiento, de modo que se logre la mezcla completa de las
sustancias que se hallan dentro del recipiente de procesado de las
muestras. Este alojamiento dispone además de una conexión a un
sistema generador de una depresión (p.ej. bomba peristáltica, bomba
de émbolo). Con el alojamiento es posible además separar partículas
magnéticas dentro del recipiente de procesado de muestras. Las
ventajas importantes de la invención son la protección contra la
contaminación (tanto de una muestra a otra, como del sistema al
medio ambiente) así como la posibilidad de admitir un número
suficientemente grande de recipientes de procesado de muestras, con
el fin de garantizar la viabilidad económica de dicho sistema.
Es también objeto de la invención un
procedimiento según la reivindicación 1 para liberar y aislar o
detectar ácidos nucleicos existentes en compartimentos biológicos de
una muestra.
Otro objeto de la invención es un sistema de
liberación y aislamiento de ácidos nucleicos a partir de una
suspensión de compartimentos biológicos con partículas magnéticas
según la reivindicación 5.
En el sentido de la invención, los ácidos
nucleicos son ácidos nucleicos que existen en compartimentos
biológicos. Se entiende por compartimentos biológicos en especial
las células, por ejemplo las de origen vírico o bacteriano. De forma
especialmente preferida, las células están presentes en un estado
fundamentalmente aislado. En principio pueden procesarse también en
el sentido de la invención los compartimentos multicelulares. Estos
compartimentos con sus ácidos nucleicos están presentes en una
muestra en el inicio del procedimiento de la invención. Esta muestra
es con preferencia una suspensión de los compartimentos biológicos
en un líquido. Estas muestras pueden obtenerse por ejemplo a partir
de líquidos corporales, p.ej. sangre, saliva u orina.
En el sentido de la invención se entiende por
liberación de ácidos nucleicos la salida de dichos ácidos nucleicos
de los compartimentos biológicos. Esta salida puede efectuarse de
múltiples maneras. La salida tiene lugar con preferencia por
destrucción de la pared que delimita los compartimentos biológicos
frente al líquido. Esto puede realizarse por ejemplo por tratamiento
de los compartimentos con medios que destruyan la pared celular,
p.ej. la proteinasa K.
Se entiende por aislamiento de ácidos nucleicos
la separación de dichos ácidos nucleicos de otros componentes de la
muestra. Los demás componentes de la muestra son por ejemplo las
paredes de los compartimentos biológicos, sus productos de
descomposición, otros ingredientes que forman parte de los
compartimentos biológicos así como otros ingredientes del líquido
que rodea los compartimentos biológicos de la muestra. Entre ellos
se cuenta por ejemplo las proteínas, los inhibidores de enzimas, en
especial las enzimas que degradan a los ácidos nucleicos, como son
la DNasa y la RNasa. En este sentido, el aislamiento puede entender
también como una especie de purificación o lavado de los ácidos
nucleicos. Este aislamiento puede ser tanto específico como
inespecífico en lo que respecta a otros ácidos nucleicos existentes
en la muestra.
Según la invención se entiende por detección de
ácidos nucleicos un procedimiento en el que se determina la
presencia o la cantidad de los ácidos nucleicos. Estos
procedimientos pueden realizarse con fines cuantitativos o también
cualitativos. Para la ejecución de detecciones cuantitativas se
realiza normalmente un ensayo comparativo con una muestra que
contiene una cantidad conocida de los ácidos nucleicos a detectar.
La detección puede ser además específica de secuencia o inespecífica
de secuencia. Para hacer que las detecciones sean específicas se
emplean por lo general sondas, que están caracterizadas porque
presentan una secuencia de nucleobases que son más o menos
características de los ácidos nucleicos de la muestra. En el
supuesto de que se desee una detección específica de los ácidos
nucleicos, se empleará una sonda que contenga una secuencia de bases
que sea complementaria de la secuencia de bases que tiene el ácido
nucleico a detectar, pero no sea complementaria de otros ácidos
nucleicos de la muestra. Las sondas pueden ser moléculas que
contienen un grupo que puede detectarse de modo directo o indirecto.
Estos grupos directamente detectables son por ejemplo grupos
radiactivos (P^{32}) coloreados o fluorescentes o átomos
metálicos. Los grupos detectables de modo indirecto son por ejemplo
compuestos activos en sentido enzimático o inmunológico, por ejemplo
anticuerpos, antígenos, haptenos, enzimas o enzimas parciales
activas en sentido enzimático. Estos pueden detectarse en una
reacción ulterior o en una secuencia de reacciones. Son preferidos
en especial los haptenos, p.ej. la digoxigenina o la biotina. Tales
sondas marcadas con haptenos pueden detectarse fácilmente en una
reacción ulterior con un anticuerpo marcado contra el hapteno.
Es objeto de la invención un sistema de
liberación y/o aislamiento de ácidos nucleicos a partir de una
suspensión de compartimentos biológicos, que contiene los
componentes siguientes:
- una unidad de alojamiento (10) para uno o
varios recipientes de procesado de la muestra (A),
- una unidad de termostato (20) para mantener
constante la temperatura de los recipientes de procesado de la
muestra (A) y de los líquidos existentes en su interior,
- un agitador (30) para agitar los recipientes de
procesado de la muestra (A) y
- un separador (40) para la separación magnética
de las partículas magnéticas contra una pared de cada uno de los
recipientes de procesado de la muestra (A),
- una unidad de bomba (50) para eliminar el
líquido del recipiente de procesado de la muestra (A).
El sistema tiene una superficie fácil de limpiar
y protege al usuario de quemaduras (p.ej. mediante un encamisado de
plástico).
En la figura 1 y 2 se representa esquemáticamente
un sistema con las unidades de la invención.
El sistema posee una unidad de alojamiento (10)
para los recipientes de procesado de las muestras. Esta unidad de
alojamiento contiene varias depresiones (12), también llamadas
cavidades, en las que se alojan los recipientes de las muestras. La
disposición de las cavidades es con preferencia lineal o lineal en
subgrupos que están dispuestos en ángulo recto entre sí. La
distancia entre las cavidades equivale con preferencia a la
distancia de los hoyos de una placa de microvaloración, también es
preferida una distancia que sea el doble de la distancia citada. La
geometría de las cavidades será acorde con la geometría de los
recipientes de muestras que tienen que alojarse en ellas.
El recipiente de procesado de la muestra (A)
puede adoptar en principio una forma cualquiera. Tales recipientes
de procesado de muestras pueden ser p.ej. los hoyos de una placa de
microvaloración (p.ej. un formato de 96 hoyos). Sin embargo, serán
con preferencia recipientes cilíndricos que poseen una abertura
superior de entrada y, con preferencia especial, una abertura
inferior de vaciado (A11). Un recipiente de procesado de muestras de
este tipo puede utilizarse para el procesado de contaminación
reducida de muestras que contengan ácidos nucleicos. Estos
recipientes son por lo general de plástico, p.ej. de
polipropileno.
En el marco de la presente invención pueden
utilizarse con preferencia especial recipientes como los descritos
en números de expediente 29505652.5 y 29505707.6 de las solicitudes
de modelos (industriales) registrados de Alemania.
Mantener el líquido a una temperatura constante
dentro de los recipientes de procesado de muestras se realiza según
la invención con una unidad de termostato (20). Esta unidad,
compuesta en principio por los componentes habituales de
termostatos, está integrada por lo menos en parte en la unidad de
alojamiento (10), en la que pueden colocarse (posicionarse) los
recipientes de procesado de muestras. La unidad (10) contiene en
especial un bloque metálico, que posee buenas propiedades de
conductividad térmica. Este bloque tiene una forma adaptada a la
forma exterior de los recipientes de procesado de muestras de tal
manera que estos recipientes, que se hallan en el alojamiento, con
su pared exterior tienen a ser posible un buen contacto con el
bloque metálico, de modo que sea posible una transferencia térmica
eficaz. En función de la reacción a realizar en el recipiente de
procesado de muestras se elevará o se bajará la temperatura del
bloque. El abanico de temperaturas abarca de 4 a 95ºC. La elevación
de la temperatura se realiza de forma ideal con varias resistencias
eléctricas, que se hallan en la mayor proximidad posible del
recipiente de procesado de muestras. El enfriamiento del líquido del
recipiente de procesado de muestras se realiza con elementos
Peltier, colocados igualmente en la mayor proximidad posible de los
recipientes de procesado de muestras. La regulación de la
temperatura se efectúa con preferencia mediante un regulador
"fuzzy" o un regulador PIDT. En la unidad de termostato están
colocadas sondas termométricas en número suficiente y en lugares
representativos.
Otra forma de ejecución de la unidad de
termostato (20) posee un bloque en cuyo interior circula el líquido.
Como medios para mantener constante la temperatura se emplean
líquidos; por lo general agua o soluciones salinas acuosas. El
líquido empleado para mantener constante la temperatura se alimenta
con preferencia a través de tubos flexibles desde una unidad de
calentamiento o de enfriamiento mediante una bomba de recirculación,
entrando directamente por los orificios (21) del bloque (10). La
capacidad del depósito del sistema de acondicionamiento de la
temperatura (indicado en la figura 1 como calentador y enfriador)
fuera del módulo DNA es un múltiplo del volumen total del módulo
DNA, con lo cual se reduce al mínimo este parámetro molesto (que
puede interferir) cuando se acciona la válvula de 2 vías. El
calentador y el enfriador mantienen constante la temperatura de los
materiales antes de entrar en el recipiente y, en caso necesario, se
dotan de cadencia o intermitencia. Un regulador acciona la válvula;
el calentador y el enfriador junto con el caudal idóneo de la bomba
de recirculación permiten alcanzar las velocidades de calentamiento
o de enfriamiento deseadas. En esta forma de ejecución se entiende
por unidad de termostato (20) la combinación del bloque en cuyo
interior circula el líquido, bomba de recirculación, calentador,
enfriador y válvula de 2 vías. Se denomina módulo DNA el dispositivo
que consta de unidad de alojamiento de recipientes de procesado de
muestras, agitador y separador.
El sistema permite trabajar con partículas
magnéticas (beads, bolas, perlas). Se entiende por partículas
magnéticas aquellas que pueden transportarse en una dirección
determinada por acción de un imán. Entre ellas se cuentan por
ejemplo los materiales ferromagnéticos o superparamagnéticos. En el
sentido de la invención son preferidos en especial los materiales
ferromagnéticos. Las partículas son partículas fijas de un diámetro
pequeño. En el sentido de la invención son idóneas en particular las
partículas que tienen un tamaño medio de grano superior a 2,8
\mum, pero inferior a 200 \mum. Tienen con preferencia especial
un tamaño medio de grano comprendido entre 10 y 15 \mum. La
distribución de tamaños de grano es con preferencia homogénea. Estas
partículas se han modificado en su superficie de modo que pueden
fijar los compartimentos biológicos. Las partículas magnéticas
adecuadas para ello son las partículas magnéticas de látex, ya
conocidas y disponibles en el mercado, sobre las que pueden fijarse
p.ej. anticuerpos. Para fijar los compartimentos biológicos sobre
las partículas magnéticas se emplean en especial anticuerpos,
dirigidos contra los antígenos de la superficie de los
compartimentos biológicos. Tales partículas magnéticas son también
productos comerciales.
Pueden emplearse también pigmentos magnéticos de
vidrio, en cuya superficie se fijan los ácidos nucleicos. Tales
pigmentos magnéticos de vidrio son conocidos por la solicitud de
patente alemana 19537985.3.
Para que pueda realizarse con éxito el
procedimiento de la invención es necesario fijar las partículas
magnéticas para determinadas etapas de reacción sobre la pared
interior del recipiente de procesado de muestra y poder soltarlas de
nuevo y ponerlas en suspensión en una etapa posterior. En el sentido
de la invención se realiza de modo especialmente preferido para el
posicionado de los imanes un acercamiento del separador (40) al
recipiente de procesado de muestra mediante uno o varios imanes
permanentes o electroimanes fijados a dicho separador. La distancia
entre el imán del recipiente de procesado de muestra, necesaria para
que la separación sea eficaz, dependerá en gran manera de la
magnitud del campo magnético generado por el imán y del tamaño y de
la capacidad magnética de las partículas magnéticas. También el tipo
de etapas de procesado que vayan a realizarse posteriormente (p.ej.
carga mecánica de los imanes) tiene su influencia en la intensidad
de campo magnético a aplicar. En el supuesto de que sea un imán
permanente, este se colocará en la proximidad del recipiente desde
una posición, que no es suficiente para separar las partículas
magnéticas, de modo que las partículas magnéticas se mantengan
pegadas a la pared interior del recipiente. En caso de usarse un
electroimán, este se conecta y se mantiene activo hasta que termina
el procesado de los compartimentos biológicos retenidos.
Con la expresión "posicionado del imán cerca
del recipiente" se tiene que entender también el caso en el que
el recipiente se coloque cerca del imán. A fin de cuentas, lo que
importan es únicamente el movimiento relativo del imán hacia el
recipiente.
El separador (40) está provisto con preferencia
de un imán que puede moverse en un tramo predeterminado, p.ej. sobre
raíles o con preferencia por movimiento del imán sobre un círculo,
p.ej. alrededor de un eje situado junto al recipiente de la muestra,
en dirección al recipiente de procesado de muestras. El separador
contiene además un motor que puede ejecutar el movimiento del imán
hacia el recipiente de procesado de muestras y también su
alejamiento del mismo.
En otra forma de ejecución, el separador (40)
está provisto de una cremallera que puede accionarse linealmente
mediante un motor de corriente continua o, como alternativa,
mediante un motor paso a paso. Dispuesto en ángulo recto con
respecto a la cremallera se halla un dispositivo de paro de los
imanes, en este caso imanes permanentes. Las posiciones finales del
movimiento del imán pueden detectarse con células fotoeléctricas. Se
asigna con preferencia un imán a cada recipiente de procesado de
muestras, que por su cara frontal se aproxima a dicho recipiente.
Pero también es posible aproximar 2 imanes a cada recipiente de
procesado de muestras. En este supuesto se aproxima en cada caso 1
imán a 2 recipientes, de modo que para n recipientes se necesitan
solamente n+1 imanes.
Para efectuar la separación, los imanes tienen
que aproximarse cuanto sea posible a los recipientes de procesado de
muestras, con el fin de lograr un alto porcentaje de separación de
partículas magnéticas. Es importante además que el recorrido de los
imanes entre las posiciones sea suficiente. En función del material
magnético empleado y de la geometría de los imanes, los imanes
tendrán que guardar una distancia de hasta 40 mm con respecto al
recipiente de procesado de las muestras con el fin de evitar una
separación fortuita. Para el funcionamiento del instrumento es
importante que las fuerzas magnéticas sólo actúen sobre las
partículas del recipiente de procesado de muestras cuando sea
necesario o deseado. Por consiguiente, en su posición inactiva el
imán deberá desplazarse a una distancia tal del recipiente que el
campo magnético no tenga ya ningún efecto significativo sobre el
movimiento de las partículas.
Esto puede realizarse además de modo que no varíe
la distancia entre imán y recipiente de procesado de muestras. Sin
embargo, los campos magnéticos pueden interrumpirse con un metal
\mu que se mueve entre el recipiente y el imán.
Otra disposición posible de los imanes consiste
en un eje giratorio, accionado por un motor de corriente continua.
Con esta forma de ejecución es posible mover los imanes en una
circunferencia. Los imanes propiamente dichos pueden estar
dispuestos en cualquier posición de este eje, de modo que cuando el
eje se mueve tiene lugar una aproximación o un alejamiento de los
imanes con respecto a los recipientes de procesado de muestras. Es
ventajoso además un accionamiento, en el que en los lados opuestos
del sistema están dispuestos en cada caso 1 eje con un gran número
de imanes. Los ejes se accionan mediante una correa dentada movida
por un motor. En esta disposición se aproximan en cada caso 2 imanes
de forma síncrona hacia las caras frontales de los recipientes de
procesado de muestras.
Los imanes de la presente invención están
provistos con preferencia de una masa comprendida entre 0,5 y 5 g,
con preferencia especial entre 1 y 4 g. Las medidas externas,
empleadas en el prototipo, son de 10 mm x 10 mm x 3 mm. Como
material idóneo de un imán permanente han dado buenos resultados los
materiales de tierras raras (p.ej. NeFeB, VACODYM 370 HR) con un
máximo de BH óptimo en las medidas más pequeñas. Para una separación
eficiente es ventajoso dimensionar de forma muy acusada el
gradiente del campo magnético. Por este motivo, el posicionado del
imán debería realizar en la mayor proximidad posible del recipiente.
Como materiales de los recipientes de procesado de muestras se
emplean con preferencia aquellos que tienen una atenuación lo menor
posible del campo magnético, p.ej. el polipropileno.
En la unidad constructiva para alojamiento de los
recipientes de procesado de muestras se sujetan por la cara inferior
de la cavidad tubos flexibles (51) que a su vez están conectados a
un sistema generador de presiones negativas. Se asigna un tubo
flexible a cada cavidad. En la zona del fondo de los recipientes de
procesado de muestras están previstas aberturas, por consiguiente,
con la generación de presión negativa (vacío) puede sacarse por
succión el contenido de los recipientes de procesado de muestras y
trasvasarse al depósito de desechos (waste). En la ejecución
correspondiente a la figura 2, cada cavidad posee una junta que, en
el momento de succionar el desecho, impide que se succione aire
entre el recipiente de procesado de muestra y la entrada (14).
El sistema de vacío consta fundamentalmente de
una bomba de émbolo (50) que está conectada con las cavidades
mediante un sistema de tubos flexibles. Entre ambos está situado un
depósito de desechos (waste), en el que se recoge el líquido. El
líquido succionado de los recipientes de procesado de muestras es
desecho. Por lo demás, entre cada recipiente de procesado de
muestras y el recipiente de desecho está interpuesta una válvula.
Esta válvula permite transmitir el vacío a cada cavidad, cuando el
sistema se conecta al vacío de forma permanente desde la bomba
pasando por el depósito de desechos (waste) hasta la válvula. Según
la invención es posible una succión tanto paralela como secuencial
de los recipientes de procesado de muestras.
En otra forma de ejecución se sustituyen la bomba
de émbolo y las válvulas por una bomba peristáltica. En este caso,
el frasco de desechos no está conecta de forma permanente al vacío,
el frasco se halla en la dirección del flujo detrás de las cavidades
y la bomba peristáltica. Esta disposición sólo permite un vaciado
paralelo por succión de las cavidades. Pueden utilizarse también
varias bombas peristálticas, que se conectan a un número determinado
de cavidades. De este modo es posible un funcionamiento parcialmente
secuencial.
El movimiento de los recipientes de procesado de
muestras se efectúa con preferencia en sentido horizontal. Se mueve
con preferencia especial la unidad de alojamiento (10), que contiene
depresiones o cavidades (12) ocupadas en cada caso por un recipiente
de muestras, de modo que se agiten todos los recipientes de muestras
alojados en ellas. Con un amortiguador de vibraciones (11) se reduce
la transmisión del movimiento a la totalidad del aparato. En el
sentido de la invención es preferido el uso de un agitador
(sacudidor) (30) que efectúa el movimiento de los recipientes (A) de
procesado de muestras. Esta unidad puede ser en principio cualquier
dispositivo mecánico apropiado para mezclar líquidos dentro de un
recipiente. A continuación se describe un ejemplo preferido de tal
unidad.
Un motor paso a paso con una excéntrica y una
masa compensadora mueven de un bastidor fijo (1) la unidad de
alojamiento (10), colocada sobre un amortiguador de vibraciones
solidario con este bastidor, en un recorrido circular excéntrico de
amplitud fija y frecuencia variable. La amplitud preferida A es de
\leq 1,5 mm, la frecuencia preferida (f) es mayor que 1 Hz y menor
que 50 Hz. La duración del mezclado o de la resuspensión se sitúa en
función de las propiedades físicas del material de muestra entre 5 y
30 s. Cambiando la excéntrica se puede variar la amplitud.
La combinación del sistema de la invención y una
máquina automática de pipeteo como tal no es obvia, porque requiere
prever un posicionado definido de los recipientes de las muestras
antes y después de las etapas de pipeteo. La agitación (sacudida) de
los recipientes conduce a que, después de cada sacudida, los
recipientes ocupan una posición diferente. En el supuesto de que la
posición de los recipientes durante el proceso de pipeteo no se haya
especificado exactamente, se corre el riesgo de que la operación de
pipeteo no pueda realizarse correctamente. Por ello hay que procurar
que después de la agitación (por sacudida) el recipiente se halle en
una posición definida, también llamada base (home), en la que puede
realizarse el pipeteo u operaciones de otro tipo.
Es ventajoso el uso de un motor paso a paso con
respecto al uso de un motor de corriente continua para garantizar
que se alcanzará una posición base (home) definida. La posición base
puede detectarse con ventaja mediante una célula fotoeléctrica.
En lo referente a la ejecución constructiva
existen todavía las siguientes posibilidades alternativas no
invasivas, cuyo diseño es en todos los casos más costoso (variantes
1 y 2) o bien cuyas operaciones de mezclado (3) duran más.
1. Una combinación de uno, dos o tres
accionamientos lineales de la unidad de alojamiento en el plano o en
el espacio (ejes X, Y, Z) para generar p.ej. figuras de
Lissajous.
2. Basculación por inclinación del bastidor (1)
en un ángulo determinado y contraposición de la unidad de
alojamiento (10).
3. Agitador magnético.
4. Girar o batir (golpear) el módulo DNA.
La conjunción de los componentes del sistema
puede ser por un lado funcional, p.ej. por integración de los imanes
en la unidad 10. Por otro lado, los componentes del sistema pueden
ensamblarse temporalmente, por ejemplo si el funcionamiento de las
unidades se regula en un orden idóneo para una aplicación deseada,
en tal caso la regulación puede efectuarse mediante un programa
informático o cuando el mismo usuario inicia las distintas
operaciones parciales.
Variante
A
En una primera etapa se incuba la muestra en un
recipiente de procesado de muestra junto con las partículas
magnéticas (beads) que pueden fijar los compartimentos biológicos,
agitando (sacudiendo) el recipiente de procesado de muestras.
La incubación de las muestras con las partículas
magnéticas puede practicarse del modo que se quiera. Es necesario
que tanto la muestra como las partículas magnéticas se hayan
introducido en el recipiente de procesado de muestra. Para el
procedimiento de la invención, en principio no tiene mayor
importancia el método de introducción ni el orden. Sin embargo se
pipetean al recipiente de procesado de muestra con preferencia las
partículas magnéticas en forma de suspensión con un contenido
conocido de partículas magnéticas. La muestra se pipetea al
recipiente de procesado de muestra ya sea antes, ya sea después.
La incubación se realiza en condiciones idóneas
hasta que se haya fijado sobre las partículas magnéticas una
cantidad suficiente de compartimentos biológicos. Se trata por lo
general de un período de tiempo comprendido entre 1 min y 10 min. El
recipiente de procesado de la muestra se cierra para ello con
preferencia de modo adecuado, p.ej. con una tapa y/o con una
válvula.
Una característica importante de la invención
consiste en que durante la incubación se agita la mezcla que se
halla en el recipiente de procesado de muestra. Tal agitación puede
realizarse a intervalos. Sin embargo, la agitación puede realizarse
a lo largo de todo el período de incubación o bien solamente durante
partes del mismo. La agitación (por sacudidas) sirve para lograr un
mezclado suficiente de los compartimentos biológicos y las
partículas magnéticas dentro del líquido, en especial para lograr la
suspensión o resuspensión de las partículas (beads) y la aceleración
de la difusión. De este modo se reduce el período de incubación
necesario para que los compartimentos biológicos se fijen sobre las
partículas magnéticas.
Después de la incubación y fijación de los
compartimentos sobre las partículas magnéticas se separan dichos
compartimentos biológicos del líquido de la muestra que los rodea.
Esto se efectúa en condiciones en las que las partículas magnéticas
permanecen pegadas a la pared del recipiente. El tipo de separación
dependerá del tipo de recipiente de procesado de muestras. El
líquido puede quitarse p.ej. por pipeteo. Sin embargo, en una forma
preferida de ejecución, en la que el recipiente de procesado de
muestra está provisto de un orificio de vaciado por abajo, el
líquido se succiona simplemente a través de tal orificio. Este tipo
de vaciado supone muy poca carga mecánica para las partículas
magnéticas y evita por tanto que las partículas magnéticas se
despeguen de la pared del recipiente.
Una operación especialmente importante es
resuspensión de las partículas magnéticas retenidas sobre la pared
del recipiente en el segundo líquido que se añade. Para ello se
aleja el imán de las proximidades del recipiente, de modo que las
partículas magnéticas ya no permanecen pegadas a la pared del
recipiente por acción del imán. Tal como se ha descrito
anteriormente es posible también apartar el recipiente de la
proximidad del imán. Según la presente invención se ha constatado
que no basta el simple alejamiento del imán para la resuspensión, a
menos que de modo complementario y con preferencia simultáneo se
agite (por sacudidas) el recipiente. Esta agitación se lleva a cabo
con el agitador (sacudidor) (30). Tal agitación produce un reparto
homogéneo de las partículas magnéticas en el segundo líquido. Este
segundo líquido puede introducirse en el recipiente de procesado de
muestra p.ej. por pipeteo antes de apartar el imán, pero también
después de que se haya alejado el imán.
El procedimiento de la invención puede utilizarse
también para la purificación ulterior de los compartimentos
biológicos. Para ello, la suspensión de partículas magnéticas, sobre
las que se han fijado los compartimentos biológicos, se posiciona en
un recipiente de procesado de muestra en relación con un imán de tal
manera que las partículas magnéticas con sus compartimentos
biológicos adheridos se retengan sobre la pared del recipiente, a
continuación se saca del recipiente el líquido (que había contenido
los compartimentos biológicos) y seguidamente se resuspenden las
partículas magnéticas en un segundo líquido, en este caso un líquido
de lavado, previo alejamiento del imán de las proximidades del
recipiente, de modo que las partículas magnéticas ya no estén
retenidas por el imán sobre la pared del recipiente, al tiempo que
se agita (sacude) el recipiente. Este proceso de lavado puede
repetirse tantas veces como se quiera, hasta lograr que los
compartimentos biológicos tengan una pureza suficiente.
Como operación adicional del procedimiento de la
invención está prevista a continuación la disgregación (lisis) de
los compartimentos biológicos. El experto en la materia conoce
perfectamente los procedimientos de disgregación de compartimentos
biológicos, así como las condiciones específicas de determinados
tipos de compartimentos, p.ej. células. Por ejemplo, para disgregar
bacterias se añade a los compartimentos una mezcla de proteinasa K y
se incuban durante un tiempo determinado, que se requiere para la
rotura o bien para la digestión total o parcial de las paredes
celulares, liberándose los ácidos nucleicos contenidos en el
interior de los compartimentos biológicos. Para ello se trabaja con
preferencia a una temperatura superior a la temperatura ambiente y
comprendida con preferencia especial entre 70 y 95ºC. La mezcla
resultante de la disgregación de las células se denominará en lo
sucesivo mezcla de disgregación. La incubación se lleva a cabo con
preferencia durante un tiempo de 5 a 20, con preferencia especial de
10 a 15 minutos.
En particular cuando la disgregación de las
células se ha realizado a temperatura ambiente o a una temperatura
ligeramente superior, es preferido calentar seguidamente la mezcla
de disgregación a temperaturas más elevadas, por ejemplo a 70ºC o,
en caso de muestras potencialmente infecciosas, a 95ºC. En tal caso
si se desea puede inactivarse el reactivo de la lisis, en el
supuesto de que pueda molestar en etapas posteriores.
A continuación se enfría la mezcla de
disgregación, a saber en condiciones que dependen de la finalidad
del procedimiento de la invención. Si el aislamiento de los ácidos
nucleicos tiene que realizarse sobre una fase fija, entonces se
ajustan las condiciones que permitan dicha unión del ácido nucleico
sobre la fase fija. Un procedimiento idóneo de fijación de ácidos
nucleicos es la incubación de los ácidos nucleicos liberados junto
con superficies de vidrio en presencia de sales caotrópicas. Tal
procedimiento se ha descrito por ejemplo en el documento
EP-A-0 389 063. En él, los ácidos
nucleicos se unen a la superficie de vidrio de modo inespecífico,
mientras que otros componentes de los compartimentos biológicos así
como de los reactivos de disgregación no se unen a dicha superficie
de vidrio o lo hacen de forma insignificante. Con preferencia, a
continuación se retira, p.ej. se succiona del recipiente de
procesado de muestras el líquido que contiene los componentes
restantes, mientras la superficie de vidrio y los ácidos nucleicos
fijados en ella pueden permanecer en el recipiente de procesado de
muestras. En una forma preferida de ejecución, esta fase fija se
introduce en el recipiente de procesado de muestra en forma de
vellón (tejido no tejido) de fibras de vidrio y se incuba con la
mezcla. Con ello se inmovilizan los ácidos nucleicos sobre las
fibras de vidrio y pueden sacarse fácilmente del recipiente de
procesado de muestra junto con el vellón de fibras de vidrio.
Para el caso de que los ácidos nucleicos tengan
que detectarse después de su liberación, entonces se hibridan con
una sonda. Esta sonda es, tal como se descrito anteriormente, una
molécula provista de una secuencia complementaria del ácido nucleico
a detectar o de una parte del mismo. En un caso preferido, la sonda
es un oligonucleótido marcado con un grupo detectable. El
enfriamiento de la mezcla reaccionante se realiza por tanto en
condiciones en las que pueda tener lugar una hibridación del ácido
nucleico a detectar con la sonda de ácido nucleico. El experto ya
sabe cuáles son estas temperaturas. En otra forma de ejecución, como
procedimiento de detección de ácidos nucleicos se realiza una
hibridación entre el ácido nucleico a detectar y una sonda de ácido
nucleico unida a una fase fija. Para ello puede emplearse la sonda
en cualquier fase fija, en el supuesto de que solo sea separable de
la mezcla reaccionante restante, p.ej. cavidades de placas de
microvaloración o la pared interior del recipiente de procesado de
muestras. El experto ya conoce los procedimientos de inmovilización
de sondas de ácidos nucleicos, en especial de las sondas llamadas de
captura, descritas p.ej. en el documento
EP-A-0 523 557.
En general, después del enfriamiento de la mezcla
se separan los ácidos nucleicos a aislar o a detectar del líquido
que los rodea, que contiene event. otros restos de la mezcla de
disgregación y event. de reactivos empleados para unir los ácidos
nucleicos sobre la fase fija. Para ello y en función de la fase fija
empleada se puede realizar una filtración o se puede sacar la fase
fija del recipiente de procesado de muestra o se puede sacar el
líquido por pipeteo de dicho recipiente.
Seguidamente, los ácidos nucleicos quedan
disponibles para la eliminación de su unión con la fase fija o para
su detección directa por procedimientos habituales, ya conocidos del
experto, destinados a detectar secuencias de ácidos nucleicos o para
su marcado.
Variante B (no según reivindicación
1)
En una primera etapa se pipetea la muestra junto
con el reactivo lisante y partículas magnéticas de vidrio (beads),
que pueden fijar los ácidos nucleicos contenidos en los
compartimentos biológicos, a un recipiente de procesado de muestra,
seguidamente se cierra el recipiente y se agita. Es necesario que
tanto la muestra y el reactivo lisante como las partículas
magnéticas de vidrio se introduzcan en el recipiente de procesado de
muestras. Para el procedimiento de la invención no tienen mayor
importancia en principio ni el tipo de introducción, ni su orden.
Sin embargo, es preferido que las partículas magnéticas de vidrio se
pipeteen al recipiente de procesado de muestra en forma de
suspensión con un contenido conocido de partículas magnéticas de
vidrio. La muestra se pipetea a dicho recipiente de procesado ya sea
antes, ya sea después. Lo importante es que la muestra, las
partículas magnéticas de vidrio y el reactivo lisante se mezclen de
modo homogéneo mediante la agitación.
Otra etapa del procedimiento de la invención
consiste en la siguiente disgregación (lisis) de los compartimentos
biológicos. El experto conoce también los procesos para la
disgregación de compartimentos biológicos así como las condiciones
específicas que requieren determinados compartimentos, p.ej. las
células. Para disgregar por ejemplo bacterias se añade a los
compartimentos biológicos una mezcla de proteinasa K y se incuban
durante un tiempo determinado, necesario para romper o bien digerir
total o parcialmente las paredes celulares y liberar los ácidos
nucleicos contenidos en el interior de los compartimentos
biológicos. Para ello se trabaja con preferencia a una temperatura
superior a la temperatura ambiente y comprendida con preferencia
especial entre 70 y 95ºC. La mezcla resultante de la disgregación de
las células se denominará en lo sucesivo mezcla de disgregación. La
incubación se lleva a cabo con preferencia durante un tiempo de 5 a
20, con preferencia especial de 10 a 15 minutos.
En particular cuando la disgregación de las
células se ha realizado a temperatura ambiente o a una temperatura
ligeramente superior, es preferido calentar seguidamente la mezcla
de disgregación a temperaturas más elevadas, por ejemplo a 70ºC o,
en caso de muestras potencialmente infecciosas, a 95ºC. En tal caso
si se desea puede inactivarse el reactivo de la lisis, en el
supuesto de que pueda molestar en etapas posteriores.
Una característica importante de la invención
consiste en que durante la incubación se agita la mezcla que se
halla en el recipiente de procesado de muestra. Tal agitación puede
realizarse a intervalos. Sin embargo, la agitación puede realizarse
a lo largo de todo el período de incubación o bien solamente durante
partes del mismo. La agitación (por sacudidas) sirve para lograr un
mezclado suficiente de los compartimentos biológicos y las
partículas magnéticas dentro del líquido, en especial para lograr la
suspensión o resuspensión de las partículas (beads) y la aceleración
de la difusión. De este modo se reduce el período de incubación
necesario para que los compartimentos biológicos se fijen sobre las
partículas magnéticas.
A continuación se enfría la mezcla de
disgregación, a saber en condiciones que dependen de la finalidad
del procedimiento de la invención. Los ácidos nucleicos liberados
del compartimento biológico tienen que fijarse de modo inespecífico
sobre la superficie de las partículas magnéticas de vidrio. Para
lograr una mejora de las propiedades de fijación se añade
i-propanol o etanol a la mezcla de disgregación
después de la lisis, en función del tipo del compartimento
biológico. A continuación tiene lugar otro mezclado a fondo de la
mezcla por agitación del recipiente de procesado de la muestra. De
este modo, los ácidos nucleicos se unen de modo inespecífico sobre
la superficie de la fase fija, mientras otros componentes del
compartimento biológico y los reactivos de disgregación no se
adsorben sobre la superficie de vidrio o lo hacen en cantidades
insignificantes.
Una vez finalizada la unión sobre la fase fija se
activan los campos magnéticos y se precipita sobre la pared interior
del recipiente de procesado de muestras el pigmento magnético de
vidrio con el ácido nucleico adherido y se saca el líquido
sobrenadante del recipiente. Sin embargo, en una forma preferida de
ejecución, en la que el recipiente de procesado de muestra está
provisto de una abertura inferior para el vaciado, el líquido se
succiona simplemente a través de dicha abertura. Este tipo de
eliminación ejerce una carga mecánica pequeña sobre las partículas
magnéticas y evita por tanto que dichas partículas magnéticas se
despeguen de la pared del recipiente.
En la siguiente etapa de procesado se resuspenden
las partículas magnéticas de vidrio en un líquido de lavado. Para
ello se retira el imán de las proximidades del recipiente, de modo
que las partículas magnéticas ya no se mantienen pegadas a la pared
del recipiente por acción de dicho imán. Tal como se ha descrito
anteriormente, el recipiente puede alejarse también de las
proximidades del imán. Según la invención, no basta con el simple
alejamiento del imán para lograr la resuspensión, a menos que el
recipiente además se agite, con preferencia de forma simultánea.
Esta agitación se realiza de nuevo mediante un sacudidor (30) y se
traduce en un reparto homogéneo de las partículas magnéticas en el
líquido de lavado. Este líquido de lavado puede introducirse en el
recipiente de procesado de muestra p.ej. por pipeteo antes de
retirar el imán, pero también después de haber retirado dicho imán.
La operación de lavado puede repetirse tantas veces como se quiera,
hasta que los ácidos nucleicos aislados tengan una pureza
suficiente.
Los ácidos nucleicos fijados están disponibles a
continuación ya sea para romper su unión con la fase fija, ya sea
para la detección directa mediante procedimientos de detección de
ácidos nucleicos que el experto ya conoce, ya sea para el
marcado.
El procedimiento de la invención aplica, pues,
una combinación de etapas de procesado que requieren una unidad de
alojamiento (10) para albergar uno o varios recipientes de procesado
de muestra, una unidad de termostato (20) para mantener constante la
temperatura de los recipientes de procesado de muestra y de los
líquidos contenidos en su interior, un agitador (sacudidor) (30)
para agitar los recipientes de procesado de muestra y una unidad
(40) para la deposición magnética de las partículas magnéticas sobre
la pared interior de cada recipiente de procesado de muestra. De
modo sorprendente, estas etapas de proceso y estas unidades pueden
realizarse en un solo bloque de reacción. Se entiende pues como
bloque de reacción un dispositivo que contiene las unidades 10, 20,
30 y 40 ensambladas entre sí de forma total o parcial. Según la
invención se puede ejecutar de forma simple y en un solo aparato un
proceso que hasta el presente requería la ejecución de un gran
número de operaciones manuales. Se ha constatado en particular que
los bloques de reacción de la presente invención son muy eficaces.
Los procesos de liberación y de aislamiento de ácidos nucleicos
pueden realizarse en ellos con mayor rapidez que hasta ahora. Por
otro lado es posible también realizar las etapas mencionadas sin
sacar el ácido nucleico del recipiente. Si se compara con el estado
de la técnica anterior, esto supone un progreso considerable en
cuanto a la dedicación de tiempo y también a la evitación de
contaminaciones. En efecto, hasta ahora se realizaban los
enfriamientos de las suspensiones sacando manualmente el recipiente
de procesado de muestra del aparato y sumergiendo dicho recipiente
en un baño de enfriamiento. Tal proceder no parece satisfactorio con
vistas al diagnóstico rutinario del futuro.
En la figura 3 se representa un procedimiento de
la invención para aislar ácidos nucleicos. En la descripción de un
procedimiento que se efectúa en el ejemplo siguiente se toma como
referencia esta figura. El recipiente de la muestra se halla en un
alojamiento de la unidad 10, con preferencia está previsto que el
recipiente de muestra tenga un nervio o talón (A20) que encaja con
la forma interior del alojamiento (p.ej. una forma exterior cónica).
Los recipientes mostrados en su sección longitudinal pueden
fabricarse fácilmente con polipropileno por la técnica de moldeo por
inyección.
La principal ventaja de la invención consiste en
que el sistema puede adaptarse en gran medida al uso de diferentes
tamaños de partículas magnéticas. Es relativamente flexible y puede
utilizarse en los métodos más diversos.
Con el ejemplo siguiente se ilustra con mayor
detalle el objeto de la invención.
El procedimiento de la invención es un
procedimiento, cuyos fundamentos son conocidos por el experto en
diagnóstico basado en ácidos nucleicos. En cuanto a los detalles
experimentales que no se mencionen explícitamente a continuación se
remite al contenido completo de la obra Molecular Cloning,
coordinador J. Sambrook y col., editorial CSH 1989.
En una forma especial de ejecución del
procedimiento de la invención se efectúan las siguientes operaciones
(ver figura 3) para el procesado de soluciones de muestra que
contengan ácidos nucleicos. En una primera etapa (I) se incuba el
líquido de muestra que contiene células en un recipiente de muestras
(A) con un material, sobre el que se fijan las células de las que
tienen que obtener los ácidos nucleicos. Para ello, este material
puede estar provisto de propiedades específicas de unión para la
superficie de las células, p.ej. por inmovilización de anticuerpos
sobre los antígenos de superficie o ser un material absorbente (A16,
no mostrado), pero puede preverse también un material con
propiedades filtrantes (A15, no mostrado) que retiene las células
cuando pasa a través de él el líquido que las contiene, p.ej. cuando
se saca del recipiente de la muestra. El experto ya conoce las
condiciones para inmovilizar células sobre una superficie, ver p.ej.
Methods in Enzymology, vol. 171, Biomembranes / Part R Transport
Theory: Cell and Model Membranes, coordinadores Sidney Fleischer,
Becca Fleischer, departamento de Biología Molecular, Universidad
Vanderbilt, Nashville, Tennessee, páginas 444 y sig. o 581 y
sig.
Durante la incubación, el recipiente de la
muestra se mantiene con preferencia cerrado con una tapa (B) para
asegurar que se evitará cualquier contaminación activa o pasiva.
En otra etapa se saca el líquido del recipiente
de la muestra, mientras que las células, cuyos ácidos nucleicos se
pretende aislar, permanecen en el recipiente de muestra en estado
fijado sobre el material. El material que fija las células es un
material de tipo partícula, por lo tanto para retenerlo se puede
recurrir al uso de un material magnético (fabricante: Dynal, Oslo,
Noruega) y aproximar un imán desde fuera hasta el recipiente de la
muestra. El líquido puede sacarse por succión a través del orificio
de vaciado (A11) aplicando un ligero vacío. Para ello, el orificio
de vaciado deberá estar provisto de una válvula que se abra cuando
aplique un vacío desde el exterior.
Para separar después de las células los
componentes de las muestras eventualmente molestos se prevén una o
varias operaciones de lavado. Para ello se introduce un líquido de
lavado en el recipiente de la muestra, en el que deberán disolverse
las eventuales impurezas, pero que fundamentalmente no debe romper
la unión de las células con la superficie del material que las fija.
El experto en la materia ya conoce estas soluciones de lavado, p.ej.
por los métodos de separación de células o por las instrucciones
adjuntas a los kits de lavado de ácidos nucleicos. Dependerán
básicamente del tipo de fijación existente entre las células y el
material.
Después de haber succionado la última solución de
lavado del recipiente de la muestra (A) se ponen en contacto las
células lavadas y concentradas con un líquido idóneo de lisis para
liberar los ácidos nucleicos de las células. Los reactivos de esta
solución de lisis dependerán en gran manera del tipo de las células
inmovilizadas (Rolfs y col., PCR, Clinical Diagnostics and Research,
editorial Springer, 1992, pp. 84 y sig.). En el supuesto de que las
células sean bacterias, la solución de lisis contendrá con
preferencia proteinasa K para descomponer la pared celular. Si se
desea, la lisis se favorece por calentamiento o enfriamiento y
mezclado de la mezcla reaccionante por agitación (por sacudidas) del
recipiente de la muestra. Al finalizar esta disgregación, los ácidos
nucleicos a aislar se hallan libres en la solución.
También durante la lisis, el recipiente de
reacción se mantiene con preferencia cerrado con una tapa para
evitar las contaminaciones procedentes del entorno. Una vez
finalizada la lisis se retira la tapa, con preferencia mediante un
dispositivo mecánico adecuado. Seguidamente se introduce un objeto
moldeado (C) en el recipiente de muestra, que contiene una mezcla de
productos de disgregación de las células y los ácidos nucleicos, el
contorno exterior de dicho objeto moldeado (C12) se ajusta el
contorno interior (A17) del recipiente de la muestra. Este objeto
moldeado es hueco y está cerrado en el sentido del recipiente de
muestra y de la mezcla reaccionante con un filtro (C11) (matriz
porosa). La introducción del objeto moldeado (C) se realiza con
preferencia mediante un elemento constructivo (B11) de la tapa (B),
que contiene además un elemento constructivo (B10) idóneo para
cerrar el recipiente de la muestra. En este caso, el objeto moldeado
se sujeta con la tapa (II) y se introduce en el recipiente de la
muestra al mismo tiempo que el cierre de dicho recipiente. Durante
esta operación, la mezcla reaccionante penetra (IV) además a través
del filtro (C11) y alcanza la cavidad interior (C14) del objeto
moldeado. Si se prevé un filtro se puede evitar por un lado que las
partículas grandes penetren en dicha cavidad y por otro lado,
gracias a las propiedades de fijación de ácidos nucleicos, se logra
una fijación de los ácidos nucleicos sobre el filtro durante el
mismo paso de la mezcla reaccionante a través del filtro. En este
caso se elige un material de filtro que contenga fibras de
vidrio.
En la etapa siguiente, por el orificio de vaciado
(A11) del recipiente de la muestra se saca por succión la mezcla
restante de reacción de lisis del dispositivo constituido por A y C.
De este modo se elimina también la solución que ha penetrado en la
cavidad interior (C14) del cuerpo hueco, de forma que a ser posible
el filtro ya no contenga resto alguno de líquido. A continuación se
quita la etapa (B) empleada hasta el momento, quedando inicialmente
el objeto moldeado (C) dentro del recipiente de la muestra
(encajado) (V).
Al mismo tiempo o después se prepara un
recipiente de elución (D) para recibir el objeto moldeado (C) (ya
sea dentro del sistema de la invención, ya sea fuera del mismo). Se
quita la tapa eventualmente colocada sobre este recipiente (VI).
Antes del traslado del objeto moldeado (C) al recipiente de elución
(D) se deposita previamente con preferencia la solución de elución
en el recipiente, p.ej. por pipeteo. La composición de la solución
de elución dependerá del tipo de fijación de los ácidos nucleicos
sobre el material del filtro (C). Contiene reactivos, cuya acción
provoca la elución, es decir el despegue de los ácidos nucleicos
inmovilizados del material. La tapa (B), que inicialmente cerraba el
recipiente de elución, se coloca (VII) sobre el recipiente de la
muestra (A) con el objeto moldeado (C).
Para retirar el objeto moldeado (C) del
recipiente de la muestra (A) se saca (VIII) dicho objeto (C) con la
tapa (B). La combinación de tapa y objeto moldeado se introduce
seguidamente en el recipiente de elución (IX). El objeto moldeado
(C) contiene con preferencia medios (C13), no mostrados) para fijar
el objeto moldeado al recipiente de elución (D), que hacen que el
objeto moldeado solamente puede sacarse del recipiente (D) por
destrucción del objeto moldeado (C) o del recipiente (D) o por
aplicación de una fuerza mayor que la necesaria para soltar la tapa
(B) del objeto moldeado (D). No se pretende sacar el objeto moldeado
del recipiente de elución.
Durante la introducción del objeto moldeado (C)
en el recipiente de elución, la solución de elución depositada
previamente penetra en el filtro (C11) y separa el ácido nucleico
inmovilizado de la matriz fija. En función de la solución de elución
depositada previamente, el filtro quedará simplemente impregnado de
dicha solución o bien la solución de elución junto con los ácidos
nucleicos soltados otra vez penetrará en la cavidad interior (C14).
Para que la elución de los ácidos nucleicos sea lo más completa
posible, el contorno interior del recipiente de elución deberá
adaptarse del modo más estrecho posible al contorno exterior del
objeto moldeado.
En la etapa siguiente se quita (X) la tapa (B) de
la combinación de objeto moldeado (C) y recipiente de elución (D).
Se utiliza la tapa para alojar (XI) un cuño (E) y para introducirlo
(XII) en la cavidad interior del objeto moldeado (C). Esta tapa
engrana desde dentro en el cuño (E). Se presiona el cuño contra el
filtro (C11) con una fuerza tal que el líquido del filtro penetre en
la cámara interior del cuño por el orificio existente en la
superficie de apriete. Este proceso es especialmente eficaz cuando
la superficie de apriete se adapta en su contorno exterior, por lo
menos en la zona en la que tiene que efectuarse la compresión y
vaciado (acción de exprimir), al contorno interior del objeto
moldeado (C). El cuño (E) puede fijarse con preferencia en esta
posición, p.ej. por enclavamiento. El dispositivo descrito está
relativamente bien cerrado con la tapa, por lo tanto la solución que
contiene ácidos nucleicos puede guardarse dentro de este
dispositivo.
Para sacar una cantidad deseada de solución de
ácidos nucleicos puede quitarse la tapa (XIII) y a través de un
orificio de la cámara interior del cuño puede retirarse la cantidad
deseada, p.ej. mediante una operación de pipeteo (XIV). A
continuación se vuelve a colocar la tapa.
Seguidamente se presenta el diagrama de flujo
adecuado para el procedimiento descrito.
| Aparato | Usuario |
| automático (programado) | manual |
| - mantener temperatura constante | - pipetear |
| - vaciar por succión | - colocar tubos, un elemento intercalado de |
| - separar (fase fija magnética) | fibra de vidrio, un recipiente secundario |
| - mezclar / resuspender | (back-up) sobre el aparato |
Las operaciones manuales se representan impresas
en negrita. Las operaciones no manuales o los procesos parciales se
ponen en marcha mediante el accionamiento por ejemplo de una
tecla.
A continuación, el recipiente de la muestra A se
denomina tubo, el recipiente de elución D se denomina recipiente
secundario (back-up), el objeto moldeado C se
denomina elemento intercalado de fibra de vidrio y el cuño E se
denomina cuño de exprimir.
(Tabla pasa a la página
siguiente)
Si se desea se pueden enjuagar los tubos
flexibles de succión y los escotes con un líquido de lavado y de
este modo quedan limpios (antes o después de la ejecución del
procedimiento y en ausencia de recipientes de muestra).
Otra forma de ejecución del sistema de liberación
y de aislamiento de ácidos nucleicos se representa en las figuras de
4 a 8.
La figura 4 contiene una representación en
perspectiva del sistema.
La figura 5 contiene un esquema de los elementos
interiores que componen el sistema.
La figura 6 representa la unidad de alojamiento
de los recipientes de procesado de muestra.
La figura 7 representa una sección de una
posición de alojamiento de un recipiente de muestra.
La figura 8 representa una corredera con
imanes.
El sistema representado en la figura 4 contiene 4
unidades de alojamiento (100) para recipientes de muestras. Las
unidades de alojamiento (100) están montadas sobre un soporte (101).
Moviendo el soporte (101) se pueden mover y agitar (por sacudidas) a
la vez las 4 unidades de alojamiento (100). En la vista detallada de
las piezas internas (figura 5) se puede ver con detalle cómo se
efectúa el movimiento del soporte (101). En sus 2 extremos, el
soporte posee en cada caso un escote (vaciado) circular (102), en el
que se introduce un perno o pivote (103). El perno (103) está
dispuesto de forma excéntrica sobre el eje de un motor (104), de
modo que cuando gira el eje del motor se produce un desplazamiento
del soporte en un plano. En la vista detallada de las piezas
internas (figura 5) se advierte además que la unidad de alojamiento
(100) está provista de aletas de refrigeración (105). Con los
ventiladores (106) dispuestos en el fondo del sistema se impulsa una
corriente de aire que pasa entre las aletas de refrigeración.
En la figura 6 se representa con detalle la
unidad de alojamiento (100). La unidad de alojamiento posee 6
posiciones de alojamiento distintas (107) para albergar los
recipientes de procesado de muestra. Las posiciones de alojamiento
(107) están unidades mediante un bastidor (108) térmicamente
conductor al elemento Peltier (109) y este con las aletas de
refrigeración (105). En el bastidor (108) se halla un calentador de
resistencias para calentar las posiciones de alojamiento y los
detectores de temperatura. El bastidor (108) está montado sobre un
elemento Peltier (109) que mantiene un intercambio térmico con las
aletas de refrigeración (105). El calentamiento de los recipientes
de procesado de muestra se efectúa mediante los elementos
calefactores alojados en el bastidor. Para enfriar los recipientes
de procesado de muestra se enfrían con el elemento Peltier (109) las
posiciones de alojamiento (107). El calor cedido por el elemento
Peltier a la cara opuesta se evacua mediante las aletas de
refrigeración (105).
En la figura 7 se representa la sección de una
posición individual de alojamiento (107). La posición de alojamiento
posee un orificio taladrado en el que se halla un recipiente de
muestra (110). El recipiente de muestra y el orificio taladrado
guardan entre sí una relación estrecha, de modo que sus paredes se
tocan, con el fin de facilitar una transmisión térmica eficaz. El
recipiente de la muestra presenta con preferencia una ligera
conicidad, es decir, se estrecha en su parte inferior, ya que de
este modo, en caso de que la posición de alojamiento posea la
conicidad correspondiente, se puede conseguir un buen contacto entre
ambas paredes. La conicidad será con preferencia de 0,5 a 1º. En la
zona inferior de la posición de alojamiento se halla un elemento
intercalado que, en su cara inferior, presenta un escote o vaciado
(112), en el que puede atornillarse la oliva de un tubo flexible. La
pieza intercalada (112) posee en su cara superior un vaciado o
escote, en el que se inserta la parte estrechada del recipiente de
muestra (110). Para lograr un cierre estanco entre este escote y la
parte estrechada del recipiente de muestra se coloca en esta parte
un anillo de junta (113) en forma de junta tórica, que abraza la
parte estrechada del recipiente de muestra. Para sacar líquidos del
recipiente de muestra (110) se conecta dicho recipiente de muestra
(110) al vacío mediante un tubo flexible que está unido al escote o
vaciado (112).
El uso del sistema según la invención prevé que
pueda aplicarse un campo magnético a los recipientes de muestra
(110) mientras están en las posiciones de alojamiento (107) con el
fin de retener las partículas magnéticas. A tal fin se aproxima el
conjunto de imanes dispuesto del modo representado en la figura 8 a
las posiciones de alojamiento (107).
La figura 8 muestra una disposición móvil de 4x6
imanes (114), equivalente al número de 4 unidades de alojamiento
(110), cada una de ellas con 6 posiciones de alojamiento (107). La
disposición mostrada en la figura 8 está provista de un carril
(115), sobre el que están montadas las 4 unidades, cada una de ellas
con 6 imanes. El carril (115) está montado sobre un soporte (116)
dotado además de un motor (117). Sobre el eje del motor está montada
una rueda dentada (no representado) que engrana con una cremallera
(118). El soporte (116) puede desplazarse sobre cilindros (120)
mediante rodamientos de bolas lineales (119). En la posición, en la
que tiene lugar una separación de las partículas magnéticas, los
imanes (114) están tocando con sus superficies frontales
directamente a las caras achatadas (121) de las posiciones de
alojamiento (107). Para alejar los imanes de las posiciones de
alojamiento se activa el motor (117) y el soporte junto con el
carril (115) se desplaza linealmente.
10 orificio de entrada
11 orificio de vaciado
17 forma interior
19 forma exterior
20 nervio periférico
22 elemento para fijación de otros elementos
funcionales
10 elemento para cerrar el recipiente de muestra
A
11 elemento para asir el objeto moldeado C
11 matriz porosa
12 contorno exterior
13 medio para fijar el objeto moldeado en el
recipiente de elución
14 cuerpo hueco
15 medio para fijar una tapa
16 contorno interior
17 medio para fijar un cuño E, periférico
18 nervio periférico, que puede romperse
19 borde
12 ranura de enclavamiento
10 superficie de apriete
11 contorno exterior
12 cámara interior
13 orificios en la superficie de apriete
14 abertura de extracción
15 junta
16 anillo de enclavamiento
17 rebajo (entalladura)
1 bastidor
10 unidad de alojamiento de recipientes de
muestra
11 amortiguador de vibraciones
12 depresión/cavidad
13 zócalo
14 entrada para calentar y enfriar A
20 unidad de termostato para mantener constante
la temperatura de los recipientes de muestra
21 tubería del líquido de
calentamiento/enfriamiento
30 agitador de los recipientes de muestra
40 separador para la separación magnética de las
partículas magnéticas
41 eje para girar los segmentos magnéticos
42 segmentos magnéticos
50 bomba de vacío/unidad de bomba
51 tubo flexible (de vacío)
100 unidad de alojamiento de recipientes de
muestra
101 soporte
102 escote circular
103 perno
104 motor
105 aletas de refrigeración
106 ventilador
107 posición de alojamiento
108 bastidor
109 elemento Peltier
110 recipiente de muestra
111 elemento intercalado
112 escote
113 anillo de junta
114 imán
115 carril
116 soporte
117 motor
118 cremallera
119 rodamiento de bolas lineal
120 cilindro
Claims (15)
1. Procedimiento para liberar y aislar o bien
para liberar y detectar ácidos nucleicos de compartimentos
biológicos de una muestra, que consta de las etapas siguientes:
- incubar la muestra en un recipiente de
procesado de muestra junto con partículas magnéticas, que pueden
fijar los compartimentos biológicos, agitando el recipiente de
procesado de la muestra,
- posicionar un imán en la proximidad del
recipiente de modo que las partículas magnéticas se retengan pegadas
a la pared interior del recipiente,
- sacar el líquido resultante del recipiente,
- resuspender las partículas magnéticas en un
segundo líquido mediante
a) el alejamiento del imán de la proximidad del
recipiente, de modo que las partículas magnéticas ya no se mantengan
pegadas a la pared de recipiente por acción del imán y
b) la agitación simultánea del recipiente,
- disgregar los compartimentos biológicos para
obtener una mezcla de disgregación,
- calentar la mezcla disgregada,
- enfriar la mezcla en condiciones que permitan
el aislamiento o la hibridación de los ácidos nucleicos que se
pretende aislar o detectar,
caracterizado porque la retención de las
partículas magnéticas sobre la pared interior del recipiente se
realiza antes de la disgregación de los compartimentos biológicos y
porque el líquido se saca del recipiente por un orificio inferior de
vaciado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque durante las etapas citadas no se sacan
los ácidos nucleicos del recipiente.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las etapas citadas se realizan en un
único bloque de reacción.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las partículas magnéticas tienen un
tamaño mayor que 2,8 \mum.
5. Sistema para la liberación y el aislamiento de
ácidos nucleicos de muestras biológicas con partículas magnéticas
que consta de las unidades siguientes:
a) una unidad de alojamiento (10, 100) para uno o
varios recipientes de procesado de la muestra (A),
b) una unidad de termostato (20) para mantener
constante la temperatura de los recipientes de procesado de la
muestra (A) y de los líquidos existentes en su interior,
c) un agitador (30) para agitar los recipientes
de procesado de la muestra (A),
d) un separador (40) para la separación magnética
de las partículas magnéticas contra una pared de cada uno de los
recipientes de procesado de la muestra (A),
en el que las unidades mencionadas en los
apartados a), b), c) y d) se integran en un único bloque de reacción
en un ensamblaje ajustado recíprocamente y
uno o varios recipientes de procesado de muestra
(A) están provistos de un orificio inferior de vaciado (A11), que
está unido con un dispositivo de succión en la disposición de los
recipientes de procesado de muestra dentro de la unidad de
alojamiento.
6. Sistema según la reivindicación 5,
caracterizado porque el dispositivo de succión consta de una
unidad de bomba (50) para sacar el líquido del recipiente de
procesado de muestra (A).
7. Sistema según la reivindicación 5 ó 6,
caracterizado porque el separador (40) y la unidad de
alojamiento (10) están montados de modo que el uno puede moverse con
respecto al otro.
8. Sistema según la reivindicación 5,
caracterizado porque la unidad de alojamiento (10, 100) puede
moverse en un plano accionada por una excéntrica, dicho plano es
perpendicular al eje o a los recipientes de procesado de
muestra.
9. Sistema según la reivindicación 5,
caracterizado porque la unidad de termostato contiene un
calentador de resistencias y un elemento Peltier.
10. Sistema según la reivindicación 5, en el que
los recipientes de procesado de muestra y las posiciones de
alojamiento poseen una conicidad ajustada recíprocamente.
11. Sistema según la reivindicación 5,
caracterizado porque mediante el dispositivo de succión se
trasvasa el contenido del recipiente de procesado de muestras al
depósito de desecho.
12. Sistema según la reivindicación 5,
caracterizado porque una junta evita la succión de aire entre
el recipiente de procesado de muestra y la entrada (inlet) (14).
13. Sistema según la reivindicación 6,
caracterizado porque el dispositivo de succión consta
fundamentalmente de una bomba de émbolo.
14. Sistema según la reivindicación 13,
caracterizado porque el sistema posee varios recipientes de
procesado de muestra, que se someten a una succión paralela o
secuencial.
15. Sistema según la reivindicación 6,
caracterizado porque el dispositivo de succión consta
fundamentalmente por lo menos de una bomba peristáltica.
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