DE1933846C3 - Vorrichtung zur Synthese von Peptiden und Proteinen - Google Patents

Vorrichtung zur Synthese von Peptiden und Proteinen

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Description

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden dient, und dem Molverhältnis der zuerst mit dem Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die 35 Harz verbundenen Aminosäure. Zur Synthese eines reduzierten Druck erzeugenden Mittel (4, 5) eine gewöhnlichen Peptids (wenn die Umsetzung bis zu Kammer(4) mit variablem Volumen aufweisen. 10O0O gehen soll) beträgt die Menge an Aminosäure,
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden die in das Reaktioniigefäß zu geben ist, das 3- bis Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das 4fache der Menge der für die Reaktion erforderlichen Reaktionsgefäß (6) über Verbindungsleitungen 30 Aminosäure. Zum Beispiel beträgt die Menge des in (16, 17, 18, 2O1 C, D, I) mit der Überdruckquelle einer Stufe des Verfahrens verwendeten Reagenzes (3) nach Hineindrücken des· Reagenzes (R) mittels nicht weniger als 20 bis 40 ml. Da die meisten der unter Druck stehendem Gas ai, der Überdruck- für die Synthesereaktion erforderlichen Reagenzien quelle (3) in das Reaktiov.sgefäp· (6) zur Einlei- teuer sind, muß ihr Verlust in den Transportleituntung des Gases in das Reaktionsgefäß (6) unter 35 gen der Vorrichtung auf ein Minimum herabgesetzt Aufschäumen im Reaktionsgefäß (6) verbun- werden. Dabei muß ferner eine Vermischung verden ist. schiedener Reagenzien, die in den Transportleitungcn
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden zurückbleiben, vermieden werden. Um die Gesamt-Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zeit abzukürzen, die zur Vervollständigung aller Stu-Unterdruckquelle (4, S) über die Verbindungs- 40 fen des Verfahrens erforderlich ist, muß eine Ausleitungen (16, 17,18, 20, C, D, /) mit dem Reak- wahl von Reagenzien und deren Transport in das tionsgefäß (6) nach Vervollständigung der Um- Reaktionsgefäß und aus diesem heraus so schnell wie Setzung einer Syntheseverfahrensstufe im Reak- möglich durchgeführt werden; im Reaktionsgefäß ist tionsgefäß (6) verbunden ist und ferner ein es erforderlich, daß das gewählte und in das Gefäß zwischen dem Reaktionsgefäß (6) und der Unter- 45 geleitete Reagenz im Zwischenraum zwischen dem druckquelle (4, 5) angeordnetes Abfallgefäß (7) oberen und dem unteren Glasfilter während des Verzum Ab2:ug irgendeines nach Vervollständigung laufs der Reaktion verbleibt, so daß es in guter Beder Umsetzung einer Verfahrensstufe im Reak- rührung mit dem im Zwischenraum angeordneten DitionsgefäiB (6) verbleibenden Reagenzes durch vinylbenzol-Harz steht.
den reduzierten Druck in das Abfallgefäß (7) 50 Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine verbesvorgesehen ist. se:te Vorrichtung zur effektiveren und unkomplizier-
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden ten Synthese von Peptiden und Proteinen vorzu-Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie fer- sehen.
ner eine Programmiereinrichtung (8) zur Rege- Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist gekenn-
lung des Betriebs der aus den Reagenzflaschen 55 zeichnet durch ein zwischen Reaktionsgefäß 6 und (T1 bis Tn) in den Verteiler (A 0) führenden Zu- Verteiler A0 angeordnetes Probengefäß 2, das zur fuhrleitungen (1O0 bis 1On, A), der Verbindungs- Entnahme und Weitergabe der jeweiligen Probe leitungen (16, 17, 18, 20, C, D, I) und der Ver- wechselweise an eine Unterdruckquelle 4 und 5 bindungsleitungen (11,12,13,14, B, E, F, G, H) bzw. an eine Überdruckquelle 3 angeschlossen ist, gemäß einem vorbestimmten Programm enthält. 60 Um eine vorbestimmte Menge des ausgewählten Reagenzes in das Probengefäß zur vorübergehenden Ablagerung abzuziehen, läßt man das Vakuum oderver-
——— minderten Drück auf das Probengefäß einwirken.
Danach wird das unter Druck stehende Gas in das 6s Probengefaß geleitet, um das Reagens aus dem Pro-Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung bengefäß in das Reaktionsgefäß zu drücken. Die zur Synthese! von Peptiden und Proteinen mit men- Wahl und der Transpott der Reagenzien werden rerert über einen Verteiler an ein gemeinsames Reak- durch Betätigung verschiedener in der Vorrichtung
vorgesehener Ventile in vorbestimniter Folge durchgeführt; der aufeinanderfolgende Betrieb der Ventile kann automatisch durch eine geeignete Programmiereinrichtung geregelt werden. Da Vakuum und der Druck eines inerten Gases zum Transport der Reagenzien angewendet werden, wird die für den Transport erforderliche Zeit im Vergleich mit den bekannten Vorrichtungen stark herabgesetzt, bei denen Flüssigkeitspumpen für den gleichen Zweck verwendet werden.
Nachstehend wird die Vorrichtung gemäß der Erfindung an Hand einer bevorzugten AusfüHrungsform unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert, in der
Das Probengefäß 2 besitzt eine Auslaßöffnung 2', die durch ein Rohr 16 mit einem Einwegventil P, z, B. einem Kugelventil, verbunden ist, das so ausgebildet ist, daß es den Reagenzienstrom durch dts Rohr 16 in der Richtung des Pfeils X durchläßt, jedoch den Durchstrom in der entgegengesetzten Richtung blockiert. Das Ventil C besitzt die drei Einlaßöffnungen C1, C2 und C3 und eine Einlaßöffnung Cn. Die öffnung C1 ist mit der Auslaßseite des Einwsgventils D durch ein Rohr 17 verbunden; die öffnung C, ist mit der Stahlflasche 3 durch ein Rohr 18 verbunden, in das ein Strömungsmesser/ eingesetzt ist; die öffnung C3 ist mit dem Abfallgefäß 7 durch ein Rohr 19 verbunden; die Auslaßöffnung C0 ist mit
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Vorrich- 15 dem Reaktionsgefäß 6 durch ein Rohr 20 verbunden,
tung gemäß der Erfindung ist. Wie im einzelnen aus F i g. 3 zu ersehen ist, gehört
Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, welche die zu dem Reaktionsgefäß 6 ein unterer Glasfilter 6a,
Arbeitsweise der Dosierkammer erläutert, die in der Vorrichtung gemäß F i g. 1 verwendet wird und
F i g. 3 ein vergrößerter Querschnitt des in der Vorrichtung gemäß der Erfindung verwendeten Reaktionsgefäßes ist.
In Fig. 1 werden mehrere Flaschen 7",, T.,. ., Tn gezeigt, von denen jede ein Reagenz/?,, /?.,.. ., Rn enthält, die zur Synthese des gewünschten Peptids erforderlich sind. Ein Wahlventil A weist mehrere Einlaßöffnungen Ax, A,..., A
„ und eine einzige Ausbis Tn sind mit
An durch geeignete
40
45
laßöffnung A0 auf. Die Flaschen T, den Einlaßöffnungen
Rohre 10-1, 10-2 . . ., bzw. 10-n verbunden, während ein Probengefäß 2 mit der Auslaßöffnung A0 durch ein geeignetes Rohr lO-o verbunden ist. Das Gefäß 2 ist vorgesehen, um vorübergehend eine vorbestimmte Menge eines Reagenzes aufzubewahren, das von dem Wahlventil A aus den Flaschen in der nachstehend zu beschreibenden Weise gewählt wurde. Das Ventil B ist vorgesehenem nacheinander den Transport eines Reagenzes aus einer gewählten Flasche in das Gefäß 2 und danach in das im folgenden beschriebene Reaktionsgefäß zu bewirken. Das Ventil B besitzt vier Öffnungen Bn, B1. B., und B3. Die öffnung B1 ist mit dem Probengefäß 2 durch ein Rohr 11 verbunden; die Öffnung B., ist mit einer Dosierkammer 4 durch ein Rohr 12 verbunden, in das ein elektromagnetisches Vakuumventil E eingesetzt ist; die Öffnung B1 ist mit einer Stahlflasche 3, die ein inertes Gas, z. B. Argon oder Stickstoff enthält, durch ein Rohr 13 verbunden, in das eine Steuereinrichtung H eingesetzt ist; die Öffnung/?., ist gegen die Atmosphäre geöffnet. Die Kammer 4 bestimmt die M^nge eines Reagenzes, das von der unter den Flaschen T1 bis Tn gewählten Flasche in das Probengefäß2 abzuziehen ist. Das Innenvolumen der Kammer4 kann eine bestimmte Größe besitzen, vorausgesetzt, daß es groß genug ist, um die Einführung eines Reagenzes in das Gefäß 2 in einer derartigen Menge zu ermöglichen, wie zur Reaktion im Gefäß erforderlich ist. Die Kammer 4 kann auch ein veränderliches Volumen besitzen oder so ausgebildet sein, daß sie automatisch auf ein optimales Volumen für jedes Reagenz eingestellt werden kann. Die Kammer 4 ist mit einer Vakuumpumpe S durch ein geeignetes Rohr 14 verbunden, in das ein Vakuumder in der Nähe des Gefäßbodens angeordnet ist, eine Schicht aus Divinylbenzol-Hara 6B, die dicht auf dem unteren Filter angeordnet ist und ein oberer Filter 6 C weit oberhalb der Schieb» 6 B. Das Reagenz wird in das Gefäß6 durch eine Einlaßöffnung 6' eingeführt, die im Boden des Gefäßes ausgebildet ist, und passiert den unteren Filter 6A, um im Raum zwischen dem unteren und dem oberen Filter zu verbleiben.
Eine Programmiereinrichtung 8 regelt und betreibt die Vakuumventile A bis G der Reihe nach.
Der Betriebsablauf der Vorrichtung wird nachstehend insbesondere unter Bezug auf das Reagenz Rx in der Flasche T1 beschrieben.
Zuerst wird im Ventil/i die Einlaßöffnung A, mit der Auslaßöffnung A0 verbunden, so daß das Reagenz Rx in der Flasche T1 abgezogen werden kann.
Danach wird das Ventil E geschlossen und das Ventil F geöffnet, wobei das Ventil G so eingestellt ist, daß die Öffnungen α und b verbunden sind, während die Öffnung r geschlossen ist. Dadurch läßt man die Vakuumpumpe 5 Luft aus der Dosierkammer 4 absaugen. Das Ventil B wird danach so betätigt, daß die Öffnungen B0 und Bx, wie in Fig. I dargestellt, verbunden sind; das Ventil F wird geschlossen und das Ventil E geöffnet. Gleichzeitig mit Jer Schließung des Ventils F kann auch die Öffnung a des Ventils G von der Öffnung b getrennt und mit der Öffnung c verbunden weiden. Die öffnung des Ventils E bewirkt, daß der Druck im Probengefäß 2 in einem Maß herabgesetzt wird, das dem Volumen der Kammer 4 entspricht, so daß das Reagenz Rx von der Flasche T1 in das Gefäß 2 abgezogen wird. Zu diesem Zeitpunkt wird das Ventil D infolge des Gewichts der darin befindlichen Kugel und der darauf aus der Kammer 4 ausgeübten Saugwirkung geschlossen. Gemäß der Erfindung durchgeführte Versuche zeigen, daß die Menge des Reagenzes, das in das Gefäß 2 eingeleitet wird, im wesentlichen dem Volumen des GeRßes 2 proportional ist, vorausgesetzt, daß der Druck in der Kammer 4 kleiner als 0,1 mm Hg ist, wobei dieser Wert durch eine 10 bis 15 Sekunden lange Evakuierung der Kammer 4 erreicht wird.
F i g. 2 ist eine graphische Darstellung, in der die Menge in ml eines Reagenzes, das in das Probengefäß 2 abgezogen wird, gegen die Zeit in Sekunden
55
ventil F und ein elektromagnetisches Dreiwegventil G
mit den öffnungen α, b und c eingesetzt ist. DasVen- 65 einer Evakuierung der Dosierkammer 4 aufgetragen til G verbindet selektiv die Pumpe 5 mit der Kam- ist. Die Kurve A ergab sich, wenn das Volumen der rtier 4 durch das Rohr 14 und mit einem Abfallge- Kammer 4 60 ml betrug, und die Kurve W ergab faß 7 durch ein Rohr 15. sich, wenn das Volumen 48 ml betnie.
Wenn die erforderliche Menge des Reagenzes in das Gefäß 2 eingeleitet wurde, wird das Ventil E geschlossen und die öffnung B0 des Ventils B von der Öffnung B1 getrennt und mit der Öffnung B., verbunden, während die öffnung C0 des Ventils C mit der ÖffnungCx, wie in Fig. 1 gezeigt, verbunden wird. Infolgedessen wird das inerte Gas aus der Stahlflasche 3 durch die Steuereinrichtung H und das Ventil B in das Gefäß 2 zur Entfernung des aufbewahrten Reagenzes aus dem Gefäß 2 eingeleitet. Das Reagenz drückt das Einwegventil Ö auf, um durch das Ventil C in das Reaktionsgefäß 6 durch die Einlaßöffnung 6' in dessen Boden zu gelangen. Die Steuereinrichtung H wird so eingestellt, daß der Druck des inerten Gases ausreicht, um das Reagenz vollständig aufwärts durch den unteren Filter 6 A zu drücken, so daß es im Raum zwischen dem oberen Filter 6 C und dem unteren Filter 6/f verbleibt. Selbst wenn ein Aufwallen durch das inerte Gas und ein Schütteln durch eine geeignete nicht dargestellte Einrichtung zur Beschleunigung der Reaktion im Gefäß 6 durchgeführt werden, kann das Reagenz im Raum zwischen dem oberen Filter 6 C und dem unteren Filter 6 A verbleiben. Dies gewährleistet eine gründliche Berührung zwischen dem Reagenz und dem Harz und verhindert einen Verlust des Reagenzes. Der Druck des inerten Gases hilft auch das im Rohr 10-1 verbleibende Reagenz in die Flasche Tx zurückzudrücken. Daher verbleibt kein Reagenz in den Transportleitungen zwischen der Flasche T1 und dem Reaktionsgefäß 2. Dies ist ein großer Vorteil der Vorrichung gemäß der Erfindung, da irgendein im Rohr verbleibendes Reagenz, das in einer Stufe des Verfahrens verwendet wird, mit dem in der nächsten Stufe zu verwendenden Reagenz sich vermischen und reagieren würde, wodurch ein richtiger Ablauf der geforderten Reaktion verhindert würde. Wenn die Einführung des Reagenzes Rx in das Reaktionsgefäß 6 abgeschlossen ist, wird die öffnung B0 des Ventils B mit der Öffnung Bn verbunden, die gegen die Atmosphäre geöffnet ist, und wird die öffnung Cn des Ventils C mit der ÖffnungC2 verbunden, worauf das inerte Gas aus der Stahlflasche 3 in das Reaktionsgefäß 6 eingeleitet wird, indem das Gas ein Aufschäumen zur Beschleunigung der Reaktion bewirkt. Nach einer vorbestimmten Zeitspanne wird die Öffnung C0 des Ventils C mit der öffnung C3 und
ίο von dort aus mit dem Abfallgefäß 7 verbunden; die Öffnungen α und c des Dreiwegventils G werden verbunden, so daß man das von der Pumpe S erzeugte Vakuum auf das Reaktionsgefäß 6 durch das Ventil G. die Rohre IS und 19, das Ventil C und das
is Rohr 20 einwirken läßt. Dies bewirkt, daß irgendein im Gefäß 6 zurückbleibender Reagenzüberschuß aus diesem in das Abfallgefäß 7 abgezogen wird. Wenn die Evakuierung des Reaktionsgefäßes 6 abgeschlossen ist, werden die Ventile G und C wieder in die
ao Ausgangsstellungen, wie in Fig. 1 gezeigt, gebracht, wodurch diese eine Stufe des Verfahrens abgeschlossen wird.
Bezüglich der anderen Reagenzien ist der Betrieb der Vorrichtung der gleiche wie unmittelbar vorstehend beschrieben, so daß keine weitere diesbezügliche Beschreibung erforderlich ist.
Auf diese Weise können gemäß der Erfindung alle Arbeitsweisen bei der Synthese von Peptiden durch Betrieb der verschiedenen Ventile in einer vorbestimmten Reihenfolge durchgeführt werden und kann der Betrieb der Ventile der Reihe nach automatisch durch eine Programmiereinrichtung geregelt werden. Da Vakuum und der Druck eines inerten Gases zum Transport der Reagenzien verwendet werden, wird die Betriebsdauer der Vorrichtung stark herabgesetzt und kann eine Vermischung von Reagenzien, die in verschiedenen Stufen des Verfahrens verwendet werden, vollständig vermieden werden.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

! 933 846 1 2 Patentansnriiche· tionsgefäß anschließbaren Reagenzfiaschen. Die Vor- ratentansprucbe. richtung der Erfindung ist insbesondere auf dem in
1. Vorrichtung zur Synthese von Peptiden und der Technik allgemein als »Festphasen-Peptidsyn-Pmteinen mit mehreren über einen Verteiler an these« bezeichneten Gebiet anwendbar und wird msein gemeinsames Reaktionsgefäß anscbüeßbarea 5 besondere mit Bezug auf diese Synthesemethode be-Reagenzflaschen, gekennzeichnet durch schrieben. Aus der Beschreibung geht jedoch hervor, ein zwischen Reaktionsgefäß (6) und Verteiler daß sich auch bei der Synthese einer Anzahl von (A0) angeordnetes Probengefäß (2), das zur Ent- Proteinen anwendbar ist.
nähme und Weitergabe der jeweiligen Probe Bekanntermaßen werden gemäß der Festphasen-
wechselweise an eine Umterdruckquelle (4, 5) io Synthesemethode t-BOC-Aminosäuren der Reihe
bzw. an eine Überdruckquelle (3) angeschlos- nach auf das Grundmaterial aus Divinylbenz.J-Harz
sen ist. aufgebracht, um darauf als lange Peptidkette zu
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch ge- wachsen. Diese Methode hat tatsächlich sehr viel zur kennzeichnet, daß die reduzierten Druck erzeu- Theorie undTechnik der Peptidsynthese beigetragen, genden Mittel (4, 5) eine Kammer (4) und eine 15 Jedoch erfordert dieses Verfahren eine große Anzahl mit dieser verbundene Vakuumpumpe (5) zur Er- von Stufen und demgemäß Zeit Um z. B. eine zeugung von vermindertem Druck in der Kammer Aminosäure Zm- wachsenden Peptidkette zuzugeben, (4) aufweisen. müssen elf Reagenzien der Reihe nach in das Reak-
3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden tionsgefäß in soviel wie 28 Stufen gegeben werden; Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die ao die Arbeitsweise erfordert mehrere Siuiiucn. Die reduzierten Drude erzeugenden Mittel (4, 5) eine Reagenzmenge, die für eine Stufe des Verfahrens erKammer (4) mit einem unveränderlichen VoIu- forderlich ist, ist der Menge des Harzes proportional, men aufweisen. das als unlöslicher fester Träger bei der Reaktion
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