DE1930057A1

DE1930057A1 - Verfahren zur Herstellung primaerabhaengiger Polynucleotidphosphorylase

Info

Publication number: DE1930057A1
Application number: DE19691930057
Authority: DE
Inventors: Jaworek Dr Phil Nat Dieter
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1969-06-13
Filing date: 1969-06-13
Publication date: 1970-12-17
Also published as: GB1294592A; FR2052554A5

Description

1 93 Ω Ω R 7

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann,

Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A. Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 27, DEN

MOHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 3921/22

int. Ur. 1630

BOEHRINGEE. MAMHEIM GMBH., Mannheim

Verfahren zur Herstellung primerabhängiger Polynucleotidphos- - phorylase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer primerabhängigen Polynucleotidphosphoryläse mit einer praktisch Primerabhängigkeit.

Eine 100$ig primerabhängige Polynucleotidphosphoryläse (PNPase) ist in der lage, bei Vorgabe.eines Primers bestimmter Zusammensetzung eine Polynucleotidkette gleicher Zusammensetzung zu synthetisieren. Eine primerabhängige PNPase wird gewissermaßen durch den Primer vorprogrammiert und synthetisiert die Polynucleotidkette entsprechend dieser Programmierung. Die primerunabhängige PNPase hingegen, wie sie aus der Zellsubstanz isoliert werden kann, läßt sich nicht "programmieren". Eine 100 <f» primerabhängige PNPase ist; auch in der Lage, synthetische Oligonucleotide zu hochpolymeren Nucleotiden weiterzubauen und hält sich dabei streng an das vorgegebene Schema, während die nicht 100?Sig primerabhängige PNPase eine Kette unterschiedlicher Zusammensetzung aufbauen würde. Es besteht daher für die wissenschaftliche Forschung auf dem Gebiet der Polynucleotidsynthese und der Proteinsynthese großes Interesse an einer praktisch 100#ig primerabhängigen PNPase.

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Die Herstellung primerabhängiger PNPase durch Inkubation mit Trypsin ist bekannt. Die bekannten Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß die Ausbeute nur etwa 35 % beträgt, bezogen auf die Aktivität der .eingesetzten primerunabhängigen PNPase, die Trypsinaktivität durch Inhibitoren gehemmt werden muß, die sich bei späterer Verwendung des so gewonnenen Enzyms entweder hemmend auf die Enzymaktivität auswirken oder aber durch Dialyse wieder entfernt werden müssen, wobei ein E_nzym ungenügender Haltbarkeit erhalten wird.

Sämtliche Nachteile der bekannten Verfahren werden durch das Verfahren der Erfindung beseitigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von primerabhängiger Polynucleotidphosphorylase durch proteolytische Behandlung ρrimerunabhängiger Polynucleotidphosphorylase besteht darin, daß ein auf einem Träger gebundenes für hochmolekulare Substanzen zugängliches, unlösliches proteolytisches Enzym verwendet wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Herstellung einer mindestens 95 i° primerabhängigen PNPase mit Ausbeμten bis zu 90 $>_t bezogen auf die Aktivität der eingesetzten primerunabhangigen PNPase. Gleichzeitig ist das Verfahren wesentlich einfacher und führt zu einem Enzym weit überlegener Haltbarkeit.

Als proteolytische Enzyme können im erfindungsgemäßen Verfahren alle proteolytischen Enzyme verwendet werden, deren Stabilität groß genüg ist, um ihre Fixierung auf einem Träger unter Erhalt der Aktivität zu gestatten. Beispiele hierfür sind Papain, Chymotrypsin und Trypsin. Wesentliche Wirkungsunterschiede bei den aufgeführten Enzymen konnten nicht beobachtet werden.

Als Träger eignen sich die zur Pixierung von Proteinen geeigneten unlöslichen Trägermaterial!en, die in der Lage sind, Enzyme so zu binden, daß der Zugang hochmolekularer Proteine zu dem gebundenen Protein möglich ist. Die besten Ergebnisse wurden

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mit dein in der deutschen Patentanmeldung P 19 08 290.7 be- _ schriebenen Trägermaterial erhalten. Gute Ergebnisse ließen sich aber z.B. auch mit Trägern auf Cellulosebasis, an die das Protein nach der Curtius¹sehen Azidmethode gebunden ist, erzielen. Die Zugänglichkeit für hochmolekulare Proteine läßt sich durch einen einfachen Vorversuch leicht bestimmen.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist äußerst einfach. Eine Lösung der primerunabhängigen PHPase wird mit einer Aufschlämmung des trägergebundenen unlöslichen proteolytischen Enzyms in einem auf die Aktivität des proteolytischen Enzyms abgestimmten Puffer zusammengebracht, einige Zeit einwirken gelassen und sodann durch einfaches Abfiltrieren wieder getrennt. Die so erhaltene Lösung der nunmehr primerabhängigen PNPase wird lyophilisiert oder eingefroren. Zweckmäßig wird ein Stabilisierungsmittel zugesetzt.

Das Zusammenbringen mit dem trägergebundenen. Enzym kann batchweise oder vorzugsweise in einer Säule erfolgen. Bevorzugt werden daher proteolytische Enzyme, die auf einem für die Säulenchromatographie geeigneten Träger gebunden sind. Die Behandlung kann bei den für enzymatische Umsetzungen üblichen Temperaturen durchgeführt werden, beispielsweise zwischen dem Gefrierpunkt der verwendeten lösung und mäßig erhöhter Temperatur. Bevorzugt werden Temperaturen zwischen O⁰C und 30⁰C.

Die Dauer der Einwirkung des proteolytischen Enzyms hängt im wesentlichen von der angewendeten Temperatur ab. Diese Zeitspanne kann zwischen wenigen Minuten bis zu mehreren Stunden liegen. Bei Anwendung des bevorzugten Trägermaterialε und Zimmertemperatur läßt sich praktisch 100 # primerabhängige PNPase bereits bei einer Eeaktionsdauer von 5 bis 10 Hinuten erhalten.

Ein besonderer Vorteil des^rerfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß sich die fortschreitende Umwandlung primerunabhängi-, ger PNPase zu prdserabhängiger PliPase leicht direkt verfolgen

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läßt, indem in bestimmten Zeitabständen Proben entnommen und einem normalen PNPase-Aktivitätstest in Gegenwart und in Abwesenheit eines Primers unterworfen v/erden. 1.00$ primerabhängige PNPase liegt vor, wenn in Gegenwart von Oligonucleotid eine PNPase-Aktivität vorliegt, in Abwesenheit des Oligonucleotids hingegen praktisch keine Aktivität mehr nachweisbar ist. Auf diese Weise läßt sich jedes proteolytisch wirksame Enzym auf Träger in unlöslicher Form in einigen Vorversuchen leicht auf seine spezifische Wirksamkeit für das Verfahren der Erfindung untersuchen. Aufgrund der so gewonnenen Werte kann rechnerisch ohne weiteres das zweckmäßigste Verhältnis von proteolytischem Enzym auf Träger zu primerunabhängiger PNPase bestimmt werden. Beispielsweise ist es so möglich, die Umsetzung in einer Säule durchzuführen, indem nach Bestimmung der speziellen Umwandlungaktivität die Säulendimension und die Tropfgeschwindigkeit berechnet werden. Eine derartige Säule läßt sich wiederholt für die Umwandlung bestimmter PNPase-Konzentrationen verwenden.

Zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung dient die beigefügte Zeichnung. In dieser stellen darJ

Fig. 1 eine graphische Darstellung der Änderung der Primerabhängigkeit von PliPase während der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Abhängigkeit von der Zeit.

Fig. 2 eine graphische Darstellung entsprechend Fig. 1, für einen Versuch, bei dem unter sonst gleichen Bedingungen wie in Fig. 1 ein Träger mit unzureichender Zugänglichkeit für hochmolekulare Substanzen verwendet wurde.

Fig. 3 eine graphische Darstellung entsprechend Fig. 1 bei" Verwendung eines anderen proteolytischen Enzyms.

Flg. 4 ebenfalls eine Darstellung entsprechend Fig. 1, für noch' ein anderes proteolytisch.es Enzym.

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Eine nähere Erläuterung der Figuren der Zeichnung wird in den folgenden Beispielen gegeben.

Beispiel 1

500 E käuflicher PNPase wurden mit 1,1 U (getestet gegen U-Benzoyl-1-arginin-p-nitranilid) Trypsin, auf dem in der deutschen Patentanmeldung P 19 08 290.7 beschriebenen Träger (insgesamt 0,5 g) in Tris-Puffer pH 8,0 bei Zimmertemperatur inkubiert. Der Puffer enthielt 50 mmol Tris-HCl, 5 mmol MgCl₂ und 0,5 mmol Kaliumäthylendiamintetraessigsäure (EDTA).

Zu Beginn, während der ersten 30 Minuten alle 5 Minuten, später alle 10 Minuten, wurden Proben entnommen und auf Aktivität der PNPase in Gegenwart und Abwesenheit eines Primers untersucht. Der Test beruht auf folgendem Prinzip:

η . ÜDP — (UMP)_n + η . P (anorganisch)

Die Umsatzrate wird anhand des Einbaues von UDP (8-C ^) in Polyuridinsäure gemessen. Eine Einheit ist die Enzymmenge, die unter den Testbedingungen ein μΜοΙ UDP einbaut*

Testansatz:

0,050 ml einer Reagenzienmischung, bestehend aus

0,350 ml Tris-Puffer, 1,0 M; pH = 8,8

0,025 ml .MgCl₂, 1 M

0,025 ml EDTA, 0,04 M; pH = 7,0

0,050 ml Albumin, 5 mg/ml

0,750 ml UDP, K-SaIz, 160 μΜοΐ/ml; pH = 8,0 0,050 ml UDP (8-C¹⁴), 10 μθί/ΐη1

1,150 ml bidest. Wasser und 0,100 ml GPU (ca. 40 μΜοΙ/ml ca.

20 mg/ml)

werden mit 0,005 ml Enzymlösung versetzt, mit bidest. Wasser auf 2,50 ml aufgefüllt und 60 min bei 37⁰C inkubiert. 0,020 ml wer-

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den zur Papierchromatographie (absteigend; 1 M Ammoniumacetat/ Äthanol 1:1) verwendet. Der Flecken mit hochpolymerer Substanz wird ausgeschnitten und die Radioaktivität bestimmt. Die ge- messene Radioaktivität ist der Enzymaktivität proportional. Die Primerabhängigkeit ergibt sich aus dem Verhältnis der Aktivität mit und ohne GpU.

Die Ergebnisse zeigt Pig. 1 der Zeichnung. Danach wird unter den angegebenen Bedingungen nach etwa 7 min eine praktisch lOO^ige Primerabhängigkeit erreicht. Die Gesamtaktivität des Enzyms sinkt während dieser Zeit von etwa 170 auf etwa 130 E, bleibt etwa 30 min auf dieser Höhe und sinkt dann langsam bis 100 E ab.

Beispiel 2

Eine Säule von etwa 1 cm Durchmesser wurde mit 15»7 g des in Beispiel 1 beschriebenen Trypsin auf Träger (9 U) gefüllt. Dann wurden 14 ml käuflicher PNPase (Boehringer) auf die Säule gegeben und mit solcher Geschwindigkeit durchlaufen gelassen, daß die Kontaktzeit etwa 7 min betrug. Eluiert wurde mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Tris-Puffer pH 8,0.

Die eiweißhaltigen Fraktionen wurden auf eine Sephadex G 50 Säule mit einem Volumen von ca. 4-0 ml gegeben und mit Tris-Puffer pH 8,0 wie oben beschrieben eluiert. Hierbei wurden zwei Proteinfraktionen erhalten, von denen die erste die primerabhängige PNPase enthält. Die erhaltene Lösung praktisch 100$iger primerabhängiger PNPase wird lyophilisiert. Das so erhaltene Lyophilisat weist etwa 70 # der ursprünglich eingesetzten Aktivität der primerunabhängigen PNPase auf. Die spezifische Aktiviiä beträgt etwa 30 bis 40 E.

Sechsmonatige Lagerung bei-18⁰C ergab keinen wesentlichen Aktivität sverlust des Lyophilisats.

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Beispiel 3

500 E käufliche PNPase (Boehringer) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit 0,6 U eines handelsüblichen Trypains auf Äthylenmaleinsäureanhydrid auf Träger (15 mg), hergestellt von der Pa. Miles, inkubiert. Wie in Beispiel 1 beschrieben wurde die Aktivität des Enzyms mit und ohne Primer während eines 2stündigen Versuches laufend kontrolliert. Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt. Man erkennt hieraus, daß das als Träger für das Trypsin verwendete Material für hochmolekulare Substanzen wie PITPase nicht zugänglich ist und praktisch keinerlei Reaktion eintritt.

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt unter Verwendung von 0,63 Π Trypsin, gebunden auf Carboxymethylcelluloseazid als Träger (100 ng). Die Aktivität des Enzyms in Gegenwart von GPU als Primer blieb praktisch unverändert. Die Aktivität ohne Primer sank etwa 60 min praktisch gleichmäßig ab und blieb dann bei etwa 95 5» Primerabhängigkeit längere Zeit konstant.

Beispiel 5

500 E PNPase wurden mit 10 mg eines von der Fa. Röhm und Haas unter der Bezeichnung "Papain PM Harz" erhältlichen trägergebundenen Papains wie in Beispiel 1 beschrieben inkubiert. Der Versuch wurde bei pH 5 durchgeführt, indem das verwendete handelsübliche PNPase-Derivat mit 1/10 N HCl auf diesen Wert eingestellt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse· zeigt Fig. 3 der Zeichnung. Man erhält danach in kurzer Zeit ein praktisch vollkommen primerabhängiges Enzym.

Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 5 wurde wiederholt unter Verwendung von 10 mg Chymotrypsin, gebunden an PM-Harz. Die Ergebnisse sind in?ig. 4 targ.,t.llt. ₀ · _{1 0} _

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung primerabhängiger Polynucleotidphosphorylase durch proteolytische Behandlung primerunabhängiger Polynucleotidphosphorylase, dadurch gekennzeichnet, daß ein auf einem Träger gebundenes, für hochmolekulare Substanzen zugängliches, unlösliches proteolytisches Enzym verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial für das proteolytische Enzym ein mit Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid oder Äthylendiacrylat vernetztes Mischpolymerisat aus Acrylamid und Äthylenmaleinsäure .oder/und Maleinsäure bzw. deren Anhydriden verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial für das proteolytische Enzym ein Carboxymethylcelluloseazid und Polymethacrylsäureanhydrid verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zwischen O und 30⁰C durchgeführt wird.

5. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung von stabiler lyophilisierter Polynucleotidphosphorylase mit einer Primerabhängigkeit von mindestens 98 56.

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