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Ferner beruht die Erfindung auf der überraschenden Feststellung,
daß solche Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzyme an feste Träger gebunden und
so für diesen Zweck verwendet Werden können, welche eine freie Mercaptogruppe, die
keinen Teil des aktiven Zentrums des Enzyms bildet, aufweisen. Über diese Gruppen
kann nämlich das Enzym durch die &ubstitution des Protons mit kovalenter Bindung
an einen zur Bindung an Mercaptogruppen befähigten Träger
gebunden
werden, ohne daß das Binden den Verlust der Aktivität oder ihr Abnehmen verursachen
würde. Dies ist auf Grund der oben erörterten besonders hohen Empfindlichkeit der
Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzyme besonders überraschend, da bei der Bindung
des großen Moleküls des genannten Trägers an das große Molekül des Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzyms
eine besonders ausgeprägte Konformationsänderung mit dem Verlust der Aktivität dieses
Enzyms zu erwarten gewesen wäre.
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Gegenstand der Erfindung ist daher das im Patentanspruch 1 angegebene
Verfahren.
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Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird als fester Träger ein immobilisiertes Reagens, das eine Thiolgruppe aufweist
verwendet.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren können als feste Träger vorteilhaft
immobilisierte Thiolreagenzien mit modifizierter Agarosebasis, zum Beispiel die
Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia Information Booklet, 1977) oder die Activated
Thiol-Sepharose 4B (Pharmacia Information Booklet, 1974) verwendetwerden.
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Die Struktur der Thiopropyl-Sepharose 6B wird durch die folgende
Formel, in welcher die Matrix eine modifizierte Agarose ist, veranschaulicht
Die Thiopropyl-Sepharose 6B weist 20 uMol 2-Thiopyridylgruppen, bezogen auf 1 cm3
gequollenes Gel, auf. 1 g lyophilisiertes Gel nimmt im gequollenen Zustand ein Volumen
von etwa 3 cm3 ein Die durch eine 2-Thiopyridylgruppe maskierte und aktivierte immobilisierte
Thiolgruppe kann auf verschiedene Weise freigesetzt werden, sie kann aber auch mit
einer Mercaptogruppe unter Bildung einer Disulfidbindung direkt zur Umsetzung gebracht
werden. Nach dem Informationsmaterial der Pharmacia beträgt der molare Extinktionskoeffizient
des dabei sich abspaltenden Pyridin-2-thiones bei 343 nm 8,08 x 103 Mol-1 cm-1.
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Zur Herstellung des an den Träger gebundenen Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzymes
wird zweckmäßig wie folgt vorgegangen.
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Der gewählte feste Träger wird in einem Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert
= 7,4) gequollen, danach in eine Kolonne gefüllt und darauf das im Puffer gelöste
Enzym aufgebracht Wie bereits erwähnt, werden erfindungsgemaß solche Enzyme, welche
chemische Reaktionen eingehende freie Mercaptogruppen aufweisen, verwendet. - Dazu
gehört vor allem das aus der Bakterie Escherichia coli isolierbare Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzym
des Typs I (Kornberg-Polymerase). Dieses ist ein sphärisches Molekül ohne Untereinheit
mit einem Molekulargewicht von 109 000 Dalton, das 975 Aminosäuren aufweist. Sein
aktives Zentrum enthält unter anderen ein Lysinmolekül und ein Argininmolekül. Im
Molekül befinden sich eine einzige Sulfidbindung und eine Thiolgruppe (Sulfhydrylgruppe).
Die letztere kann ohne Aktivitätsverminderung mit Jodacetat und Quecksilbersalzen
zur Umsetzung gebracht werden.
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Ähnlich dem aus E. coli gewinnbaren Enzym werden auch die aus anderen
Bakterien, wie Bacillus subtilis,
Micorcoccus lisodeicticus und Mycobacterium tuberculosis,
isolierten Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzyme des Typs I nicht durch Sulfhydrylreagenzien
(Thiolreagenzien) gehemmt, das heißt, daß sie ähnlich wie das Enzym aus E. coli
immobilisierbar sind. Dagegen werden die aus allen 4 Bakterienarten isolierten Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzyme
der Typen II und III durch Sulfhydrylreagenzien (Thiolreagenzien) gehemmt, so daß
sie nicht auf die vorher angegebene Weise an den festen Träger gebunden werden können.
Von den aus Organismen von Säugetieren bisher isolierten Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzymen
[ECiJJJ.I werden die oc-Polymerase und die y-Polymerase ebenfalls gehemmt, während
die ß-Polymerase durch Sulfhydrylreagenzien (Thiolreagenzien) nicht gehemmt wird.
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Das aus seiner Lösung im Puffer auf den Träger aufgebrachte Enzym
wird mit einem weiteren Puffer in den Träger hineingespült, und dann wird das Gemisch
im Interesse einer möglichst vollständigen Bindung 10mal mit einer peristaltischen
Pumpe umgepumpt Die Reaktion erfolgt nach dem folgenden Reaktionsschema
worin E fflr das Desoxyrib onucleinsaure-Polymerase-Enzym des Typs I steht
bedeutet Die Menge des gebundenen Enzyms kann direkt durch die Messung der molaren
Lichtabsorption des sich äbspaltenden Pyridin-2-thiones und indirekt durch die Messung
der Desoxyribonucleinsäuremenge, welche mit der - durch das Enzym katalysierten
Synthese hergestellt wird, bestimmt werden.
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Nach dem Ende der Bindungsreaktion wird der Puffer abgelassen und
das Gel mit weiterem frischem Puffer gewaschen, und zwar zunächst so lange, bis
das Spektrum des abfließenden Puffers mit dem des reinen Puffers nicht identisch
ist, wozu etwa 10 cm3 benötigt werden, und anschließend mit noch 40 cm3 mit einer
Geschwindigkeit von 1 cm3/Minute. Für die Spektrophotometrie kann ein Registrierspektrophotometer
vom Typ Zeiss Specord UV VIS verwendet werden.
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Das so gebundene Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzym wird dann
zur erfmdungsgemäßen synthetischen Herstellung von Polydesoxynucleotiden verwendes
Das für die Synthese benutzte Reaktionsgemisch enthält in wäßrigem Medium die als
Substrat verwendeten Desoxynucleoside (2'-Desoxynucleosid-5t-triphosphate) und gegebenenfalls
den Templatprimärkomplex.
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Zweckmäßig wird erfindungsgemäß wie folgt vorgegangen.
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Das Reaktionsgemisch wird mit einem Puffer, durch
dessen
Menge und Art beziehungsweise Qualität die optimale Funktion des verwendeten Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzyms
sichergestellt werden muß, auf einen pH-Wert von 6,5 bis 9,5 gepuffert. Dem Reaktionsgemisch
wird außerdem ein die optimale Funktion des Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzymes
sicherstellendes Metallsalz, vorzugsweise Magnesiumsalz, in entsprechender Konzentration
zugesetzt Die Temperatur der Kolonne wird auf 37"C eingestellt und das Reaktionsgemisch
ebenfalls mit einer Temperatur von 37"C in sie eingebracht und so auf das an den
Träger gebundene Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzym aufgebracht, worauf es
mit einer peristaltischen Pumpe umgepumpt wird.
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Das Voranschreiten der Reaktion kann auf verschiedene Weise kontrolliert
werden, beispielsweise durch Messung der Radioaktivität des säureunlöslichen Materials,
Papierchromatographie, Analyse des Endproduktes oder eine Kontrollreaktion.
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Im Falle der Radioaktivitätsmessung muß das Reaktionsgemisch auch
markiertes Substrat enthalten.
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Dazu kann zum Beispiel [H3]-2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat ICH3]dATP)
benutzt werden. Die Messung wird in der Weise durchgeführt, daß dem die Kolonne
durchfließenden Gemisch in bestimmten Zeitabständen Proben von jeweils 25 tjl mit
einer Hamilton-Mikropipette entnommen und diese Anteile auf Glasfilterplatten vom
Typ GF/C (Durchmesser 2,5 cm, Whatman) gemessen werden. Diese werden in eine Lösung
(10 cm3 Lösung je Glasfilter, 0 bis 5"C, 10 Minuten) aus einer kalten (0 bis 5"C)
5%gen Trichloressigsäure (TCA) und einer 1 %gen Natriumpyrophosphatlösung eingebracht,
2mal mit 5%Der Trichloressigsäurelösung, dann 2mal mit 96%igem Äthylalkohol und
schließlich 2mal mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Radioaktivität
der säureunlöslichen Polymermoleküle (aus mehr als 10 Monomermolekülen bestehenden
Polymere) wird im Gemisch mit Toluol mit einem Packard-Spektrometer gemessen. Mit
dieser Verfahrensweise kann auch die Kontrollreaktion verfolgt werden.
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Die Papierchromatographie ist bei radioaktiven Substraten zur quantitativen
Verfolgung der Reaktion und bei inaktiven Substraten zur qualitativen Verfolgung
der Reaktion geeignet Auf einen 1 cm breiten und 15 bis 18 cm langen DE 81-Papierstreifen
(DEAE-Cellulose, Whatman) werden 5 bis 25 Zl des Reaktionsgemisches aufgetragen.
Als Laufmittel wird eine 0,15 m Ammoniumbicarbonatlösung verwendet; die Rr-Werte
der Nucleotide liegen zwischen 0,35 und 0,55, die Polynucleotide bleiben am Startpunkt
Zum vom Gel abgelassenen und ausgewaschenen (bei 260 nm kontrollierten) Reaktionsgemisch
wird eine 2,5 Mol Natriumchlorid und 0,038 Mol Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA)
je Liter enthaltende Lösung im Volumenverhältnis von 1:0,65 zugegeben und danach
wird das Gemisch 10 Minuten lang auf 70"C gehalten.
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Nach dem Abkühlen wird es 3mal mit dem gleichen Volumen eines Gemisches
von Chloroform und Isoamylalkohol im Volumverhältnis von 24:1 ausgeschüttelt Die
2 Phasen werden getrennt (durch Zentrifugieren oder auf Phasentrennpapier, Whatman)
und die wäßrige Phase wird mit doppelt destilliertem Wasser dialysiert (Bio-Fiber
50 Minibeaker, Rühren, 4"C, kontinuierlich). Die Leitfähigkeit der Dialysierlösung
wird gemessen. Nachdem die Leitfähigkeit nach Durchfluß von 0,8 1 doppelt destilliertem
Wasser den
Wert des doppelt destillierten Wassers (0,2 bis 0,6 1S) erreicht hatte,
wird mit noch 0,4 bis 0,5 1 doppelt destilliertem Wasser dialysiert. Danach wird
das Produkt bis zur Trockne lyophilisiert und in 500 L einer 10-3 Mol 2-Amino-2-hydroxymethylpropan-
1 ,3-diolhydrochlorid [TRIS . HCI] (pH-Wert = 7,4) und 10-4 Mol Äthylendiamintetraessigsäure
enthaltenden Lösung aufgenommen. Von den der erhaltenen Lösung entnommenen Anteilen
werden die Konzentration , das UV-Spektrum, die Wärmehyperchromizität und die Aktivität
des Templatkomplexes bestimmt. Die Polymerlösungen werden bei 250 C gelagert.
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Die Kontrollreaktion kann wie folgt vorgenommen werden. Zu 165 oil
des mit dem bei der Reaktion des Enzyms auf dem immobilierten Träger für die erfindungsgemäße
Herstellung verwendeten Gemisch identischen zu reagierenden Gemisches wird eine
volumanteilige Menge des Enzyms zugegeben und es wird bei 37"C bebrütet. Die Probenahme
wird zu den gleichen Zeitpunkten wie bei der zu kontrollierenden Reaktion vorgenommen
und das Auftragen auf das Glasfilter [GF]C, die Aufarbeitung und die Messung erfolgen
wie oben beschrieben.
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Die Lagerung und Wiederverwendung des immobilisierten Enzyms können
wie folgt durchgeführt werden: Nach dem Ablassen und Auswaschen des Reaktionsgemisches
wird das Gel mit noch 100 cm3 eines 60mmolaren Kalimphosphatpuffers und danach mit
20 cm3 einer 0,02%igen Natriumazidlösung gewaschen und darin wird es in der Säule
oder nach seiner Entfernung aus ihr bei 3 bis 6"C gelagert. Nach dem Herauswaschen
der Natriumazidlösung kann das Enzym erneut verwendet werden und bei seiner Wiederverwendung
nimmt seine ursprüngliche Aktivität kaum (um 0 bis 5%) ab. Das bei seiner Wiederverwendung
am meisten untersuchte und stabilste immobilisierte Enzym war die E. coli Desoxyribonucleinsäure-Polymerase
1, gerade II. Innerhalb 2 Monate änderte sich seine Aktivität bei 6 Wiederverwendungen
nicht.
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Die wichtigsten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind wie
folgt: A) Das an einen festen Träger durch kovalente Bindung gebundene Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzym
nimmt, bei der Synthese der Desoxypolynucleotide an einer Reaktion in heterogener
Phase teil und kann daher nach dem Ende der Reaktion ohne Denaturalisation aus dem
Reaktionsgemisch entfernt werden.
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B) Das gebundene Enzym kann mehrmals verwendet werden.
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C) Das gebundene Enzym kann auch bei kontinuierlicher Betriebsweise
verwendet werden.
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Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert
Beispiel 1 Synthetische Herstellung des Copolymers von 2'-Desoxyadenosin-5'-monophosphat
(dAMP) und 2'-Desoxythymin-5'-monophosphat (dTMP) {Poly-d(A-T)} Die Temperatur der
wie weiter unten beschrieben erhaltenes an Thiopropyl-Sepharose 6B gebundenes Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzym
als Gel enthaltenden Kolonne wurde mit einem Thermostaten
auf 37"C
eingestellt und dann wurden 10cm3 eines Reaktionsgemisches der folgenden Zusammensetzung
in das Gel eintreten gelassen 60 mMol/l Kaliumphosphat (pH-Wert=7,4), 6 mMol/l Magnesiumchlorid,
1 mMol/l [H3J-2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat ([H3]dATP (dessen spezifische Aktivität
10,9 Zerfalle/ Minute/pmol betrug), 1 mMol/l 2'-Desoxythyrnin-5-triphosphat jdTTP},
100,uMol [Pl/l aktiviertes Copolymer von 2'-Desoxyadenosin-5'-monophosphat (dAMP)
und 2'-Desoxythymin-S~monophosphat (dTMP) {Polyd(A-T} als Templatprimärkomplex mit
doppelt destilliertem Wasser zu einem Volumen von 10 cm3 gelöst Die dem Totraumvolumen
entsprechenden 2 bis 3 cm3 des Puffers wurden (spektrophotometrisch kontrolliert)
ausgegossen und danach wurde das Reaktonsgemisch mit einer peristaltischen Pumpe
mit einer Geschwindigkeit von 0,5 cm3/Minute umgepumpt Das Fortschreiten der Reaktion
konnte durch eine Radioaktivitätsmessung verfolgt werden.
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Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden betrug die entstandene Polymermenge
auf Grund des Einbaues von [H3]-2'-Desoxyadenosin-5'-monophosphat i[H3]dAMP} in
einen säureunlöslichen Stoff 3,04 mg Der Substratverbrauch lag bei 45 Gew.-%.
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Aus dem so gewonnenen Copolymer von 2'-Desoxyadenosin-5'-monophosphat
(dAMP) und 2'-Desoxythymin-5'-monophosphat (dTMP) jPoly-d(A-T)l wurden durch Dialyse
Stoffe mit niedrigem Molekulargewicht abgetrennt Die Menge des reinen nativen Copolymers
von 2'-Desoxyadenosin-5'-monophosphat (dAMP) und 2'-Desoxythymin-5'-monophosphat
(dTMP) {Polyd(A-T)i mit hohem Molekulargewicht betrug 2,2 mg Das verwendete Desoxyribonucleinsäure-Polymera
se-Enzym wurde wie folgt beschrieben erhalten.
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Vorbereiten der Thiopropyl-Sepharose 6B Es wurde 1 g lyophilisiertes,
fabrikmäßiges Thiolreagens Thiopropyl-Sepharose 6B 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur
in einem 60mmolaren Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert=7,4) gequollen, danach in eine
mit einem Mantel und Glasfilter versehene Glaskolonne (1,5cmxl5cm) gefullt und mit
200cm3 des obigen Puffers gewaschen, um die fabrikmäßig zugesetzten Stabilisierungsmittel
herauszuwaschen.
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Immobilisieren des Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzyms Zu etwa
0,5 cm3 des Puffers über dem abgesetzten, blasenfreien Gel wurden 100 Einheiten
(20 kl) des Enzyms E. coli MRE 600 Desoxyribonucleinsäure-Polymerase I, grade I
(Produkt der Firma Boehringer-Mannheim GmbH) mit einer spezifischen Aktivität von
3850 Einheiten/mg Eiweiß mit einer Hamilton-Mikropipette
zugegeben (1 Einheit Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzym
baut 10 mol Gesamtnucleotid bei 37C innerhalb 30 Minuten in das säureunlösliche
Polymer in Gegenwart des entsprechenden Templatprimärkomplexes in einem bestimmten
Puffer ein). Durch langsames Abtropfenlassen (0,1 bis 0,2 cm3/Minute) wurde es in
die Gelschicht eingelassen und mit noch 10 cm3 Puffer bei Raumtemperatur hineingespült
und danach 10mal mit einer peristaltischen Pumpe umgepumpt Beispiel 2 Es wurde mit
in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durch Binden von 150 Einheiten (100 ul)
des Enzyms E. coli MRE 600 Desoxyribonucleinsäure-Polymerase I, grade II (Produkt
der Firma Boehringer-Mannheim GmbH) mit einer spezifischen Aktivität von 116 Einheiten/mg
Eiweiß an das im Beispiel 1 verwendete immobilisierte Thiolreagens erhaltenem an
diesen Träger gebundenem Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzym die Synthese in
der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt Als Substrat wurden 2 mMol/l
[H3]2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat {[H3JdATPj und 2 mMoVl 2'-Desoxythymin-5-triphosphat
(dTTP verwendet Die Menge des so innerhalb 4 Stunden hergestellten Polymers betrug
auf Grund der Radioaktivitätsmessung 2,37 mg und der Substratverbrauch lag bei 18
Gew=% Das Molekulargewicht des isolierten und gereinigten- Polymers war niedrig
(5 bis 200 000 Dalton) und seine Menge betrug 1,78 mg Beispiel 3 Es wurde mit in
der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durch Binden von 45 Einheiten (50,um) des
Großfragment-Enzyms E. coli MRE 600 Desoxyribonucleinsäure-Polymerase I (Enzym A
nach Klenow; Produkt der Firma Boehringer-Mannheim GmbH) mit einer spezifischen
Aktivität von 6940 Einheiten/mg Eiweiß an das im Beispiel 1 verwendete immobilisierte
Thiolreagens erhaltenem an diesen Träger gebundenem Desoxyribonucleinsäure-Polymerase-Enzym
die Synthese in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt Als Substrat
wurden 0,5 mMol/l rH31-2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat j[H3jdATP} und 0,5 mMoVl
2'-Desoxythymin-5-triphosphat {dTTP} verwendet Nach Radioaktivitätsmessungen betrug
die Menge des so innerhalb 24 Stunden synthetisierten Gesamtpolymers 22,74 mg und
der Substratverbrauch lag bei 82 Gew.-%. Das isolierte gereinigte Copolymer von
2'-Desoxyadenosin-5'-monophosphat (dAMP) und 2'-Desoxythynun-5'-monophosphat (dTMP)
fPolyd(A-T) hatte ein hohes Molekulargewicht (>200 000 Dalton) und seine Menge
betrug 2,12 mg.
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