DE1919894B2 - Vorrichtung zur trennung von proteinartigen substanzen durch gel-elektrophorese - Google Patents
Vorrichtung zur trennung von proteinartigen substanzen durch gel-elektrophoreseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Trennung von proteinartigen Substanzen durch Elektrophorese.
Die Gel-Elektrophorese ermöglicht die Trennung
von komplexen Mischungen proteinartiger Substanzen,
z.,?. Serum-Proteinen, Gewebeextrakten, Hormonen,
Enzymen, Polypeptiden usw. mit der Hilfe einer differenzierten Wanderung der Komponenten der
Mischung durch ein Gel-Medium in einem elektrischen
ao Feld. Obwohl die Gel-Elektrophorese ein bekanntes
analytisches Verfahren ist stand einer breiteren Verwendung dieser Elektrophorese für präparatives
Arbeiten in der Biologie und den verwandten Wissenschaften der Mangel einer geeigneten und
verhältnismäßig billigen Vorrichtung für diesen Zweck entgegen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung einer Vorrichtung zur präparativen Gel-Elektrophorese, die eine große Kapazität besitzt einen
hohen Grad an Trennfähigkeit aufweist, billig, dauerhaft und leicht zu handhaben ist und zur Reinigung oder zur
Lagerung auf einfache Weise zerlegt werden kann. Gleichzeitig soll erfindungsgemäß eine Vorrichtung
geschaffen werden, welche ein diskontinuierliches
Puffersystem aufweist und eine kontinuierliche Elution der Komponenten ermöglicht so daß die Sammlung der
Fraktionen der Komponenten während der Elektrophorese w isentlich erleichtert wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Gel-EIektro-
phorese ist gekennzeichnet durch eine vertikale Säule aus Elektrophorese-Gel mit einem oberen Bereich und
einem unteren Bereich, eine Vorrichtung zur Schaffung eines im wesentlichen gleichmäßigen in einer Richtung
verlaufenden Potentials in Längsrichtung der Säule, eine
Sammelkammer, die unterhalb der Gelsäule angeordnet
ist und mit deren unterem Bereich in Verbindung steht sowie eine Gewinnungsvorrichtung die eine proteinartige Substanz, die in die Sammelkammer eintritt, von der
Säule in im wesentlichen radialer Richtung zu einer
zentral angeordneten Austrittsvorrichtung und durch
diese hindurch nach außen leitet.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels
der Erfindung an Hand der Zeichnung.
Die Figur der Zeichnung zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung im Querschnitt.
Entsprechend der Darstellung in der Figur ist an einem Stützteil 12 ein an beiden Enden offener Zylinder
10 vertikal in ein offenes Gefäß oder Becherglas 11
eingehängt. Das Gefäß 11 dient der Aufnahme einer
ersten Pufferlösung 19. Der Zylinder 10 enthält ein Elektrophorese-Gel 16 und eine darüber befindliche
zweite Pufferlösung 20. Das Gel 16 kann starr (self-supporting) oder auch halbstarr sein und wird in
seiner Stellung durch eine Trennwand 15 gehalten, welche für Ionen und gleichzeitig auch für die
proteinartigen Substanzen, die durch das Gel wandern, durchlässig ist. Ein für diesen Zweck geeignetes
Material ist poröses Polyäthylen mit einer Porengröße
in» Bereich von 10 bis 50 Mikron. Vorzugsweise liegt die
Größe der Poren zwischen 30 bis 40 Mikron.
Ei·;* Elutionsplatte 13, weiche durch eine für Ionen
durchlässige Scheibe dargestellt wird, die vorzugsweise
aus porösem Polyäthylen oder einem ähnlichen Material besteht, ist in einem bestimmten Abstand unterhalb der
Trennwand 15 angeordnet Die Elutionsplatte 13 und die Trennwand 15 bilden zusammen eine Sammelkammer
29, die sich unterhalb der Gelsäule 16 befindet Vorzugsweise ist die Durchlässigkeit der Elutionsplatte
13 for Ionen derart gewählt daß ein im wesentlichen
gleichförmiges Potential in Längsrichtung der Säule 16 gebildet werden kann, wie dies im weiteren erläutert
Die Elutionsplatte 13 ist mit einer zentralen öffnung
30 versehen, die mit der Sammelkammer 29 in Verbindung steht und eine kontinuierliche Ableitung der
in der Sammelkammer 29 gesammelten proteinanigen Substanz ermöglicht Die Substanz wird durch die
öffnung 30 einer Leitung 14 zugeführt. Die Elutionsplatte 13 ist beweglich an der benachbarten Wand des
Zylinders 10 angeordnet so daß die Pufferlösung 19, die im Gefäß 11 untergebracht ist, frei dazwischen und in
die Sammelkammer 29 strömen kann.
Wenn durch eine Pumpe oder einen geeigneten Siphon im flüssigen Material in der Kammer 29 durch
die Leitung 14 ein Unterdruck gebildet wird, so strömt an der Peripherie der Elutionsplatte 13 frische
Pufferlösung in die Kammer 29. Die Lösung bewegt sich in radialer Richtung zur zentralen öffnung 30 und
schwemmt die aus der Gelsäule 16 eluierte proteinartige Substanz in die öffnung 30. Die besondere radiale
Strömung der Pufferlösung 19 durch die Kammer 29 kann auch durch die Anordnung geeigneter kleiner
öffnungen in der Elutionsplatte 13 oder durch eine geeignete Wahl der Porosität der Platte variiert werden.
Die Strömungsgeschwindigkeit der Pufferlösung durch die Sammelkammer 29 kann durch die Geschwindigkeit
der Ableitung der Flüssigkeit durch die Leitung 14 gesteuert werden. Die Elutionsplatte 13 kann durch
einen Haltering 17 oder eine andere geeignete Vorrichtung in ihrer Stellung gehalten werden. Um zu
gewährleisten, daß die Kammer 29 ein konstantes Volumen behält kann auch ein Distanzhalteteil 18
zwischen der Platte 13 und der Trennwand 15 angeordnet werden. Zu diesem Zweck kann ein
Nylonsieb oder ein ähnliches Teil verwendet werden. Um eine Strömung der proteinartigen Substanz durch
die Elutionsplatte 18 zu verhindern, kann falls nötig zwischen dem Distanzhalteteil 18 und der Platte 13 eine
Dialyse-Membran oder ein ähnliches Element angeordnet werden.
Die treibende Kraft für die unterschiedliche Wanderung der verschiedenen Komponenten in einem
proteinartigen Gemisch ist die elektromotorische Kraft durch die Säule. Um eine verhältnismäßig scharfe
Trennung der einzelnen Komponenten zu gewährleisten, muß ein gleichförmiges Gleichstrom-Potential in
der Längsrichtung der Gelsäule 16 wirken. Zu diesem Zweck ist die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer
Elektrode 21 versehen, welche in elektrischem Kontakt mit der Pufferlösung 20 steht und durch Leitung 23 mit
einem Pol einer Gleichstromquelle 28 verbunden ist. Die andere Elektrode 22 ist im elektrischen Kontakt mit der
Pufferlösung 19 angeordnet und ist durch Leitung 24 mit dem anderen Pol der Gleichstromquelle 28 verbunden.
nip Elektroden 21 und 22 können aus Kohlenstoff,
einem Edelmetall, z. B. Platin, oder dergleichen bestehen.
Da die Pufferlösungen 19 und 20 leitfähig sind und Wasser enthalten, tritt bei Betrieb der Vorrichtung eine
S beträchtliche Elektrolyse ein, die mit einer Gasentwicklung verbunden ist Zu diesem Zweck ist vorzugsweise
die untere Elektrode 22 derart angeordnet daß Gasblasen, die an ihr entwickelt werden und an ihr
aufsteigen, nicht im unteren Bereich des Zylinders 10 gefangen werden, sondern zur Oberfläche der Pufferlösung
19 aufsteigen und von der umgebenden Atmosphäre aufgenommen werden können.
Die Pufferlösungen 19 und 20 dienen gleichzeitig im Betrieb auch zur Ableitung der während der Gel-Elektrophorese
entwickelten Wärme. Falls sich diese Wärmeableitung als ungenügend erweist können
geeignete Vorrichtungen zum Wärmeaustausch, z. B. Kühlschlangen, sogenannte »Kühlfinger«, ein Kühlmantel
um den Zylinder 10 oder den Behälter 11 oder andere geeignete Anordnungen verwendet werden.
Der Zylinder iO kann auch mit einem Deckel 25 versehen sein, welcher eine öffnung 26 aufweist
Für vorliegende Vorrichtung kann eine Vielzahl verschiedenartiger Elektrophorese-Gele verwendet
werden, z. B. Stärkegele, Silikagele, Agargele und dergleichen.
Die Gele können starr oder halbstarr sein. Für die Verwendung in der vorliegenden Vorrichtung ist
vorzugsweise ein halbstarres wasserunlösliches Acrylamid-Polymer-Gel
geeignet, welches durch eine Kopolymerisation von Acrylamid mit Methylenbisacrylamid
erhalten wird. Das Gel ist praktisch durchsichtig und kann mit einem Minimum von etwa 2,5% des
Monomerengemisches gebildet werden, wobei die maximale Konzentration des Polymeren im Gel nur
durch die Löslichkeit des Acrylamide und des Methylenbisacrylamids
begrenzt ist. Das vernetzende Mittel ist Methylenbisacrylamid, dessen Konzentration von
einem Minimum von etwa 1% des gesamten Gehaltes der Monomeren bis zu einem Maximum, das durch die
Grenze seiner Löslichkeit in Wasser begrenzt ist, variiert werden. Bei einer Erhöhung der Konzentration
des Polymeren wird das Gel fester und starrer. Ein festes Gemisch von etwa 95% Acrylamid und 5%
Methylenbisacrylamid ist im Handel erhältlich.
Die Vorrichtung wird durch gebrauchsfertig gemacht, daß ein geeignetes Gel, z. B. das vorstehend erwähnte
Acrylamid-Polymer-Gel in den Zylinder 10 im wesentlichen
wie in Figur gezeigt, eingegossen wird. Das Gießen kann auf die Weise erfolgen, daß zuerst das untere Ende
des Zylinders 10 verschlossen wird, der Zylinder so hoch mit Wasser gefüllt wird, daß die Elutionsplatte 13 und
die Trennwand 15 bedeckt sind, wenn sie sich an ihrer Stelle befinden und dann diese beiden Elemente in ihre
normale Stellung gebracht werden. Ein über der Trennwand 15 befindlicher Wasser-Überschuß wird
dekantiert und die gewünschte Gel-Lösung eingefüllt. Das Luftvolumen über der eingefüllten Gel-Lösung
wird durch Stickstoff verdrängt und die Lösung wird zum Erstarren (to set) gebracht Die zur Erstarrung
erforderliche Zeit kann abgekürzt werden, wenn der Gel-Lösung der Sauerstoff entzogen wird.
Sobald das Gel erstarrt ist wird der untere Teil des
Zylinders 10 geöffnet und das Wasser aus dem Zylinder 65 10 abgeleitet. Die Leitung 14 wird an die öffnung 30 der
Elutionsplatte 13 angeschlossen und der Zylinder 10 im Gefäß 11 befestigt. Anschließend werden die Pufferlösungen
19 und 20 eingefüllt die erforderlichen
elektrischen Anschlüsse durchgeführt und das zu trennende proteinartige Gemisch auf die obere Fläche
27 des Gels 16 mittels einer Pipette oder dergleichen aufgetragen. Dann wird die Gleichstromquelle eingeschaltet
und der durch das Gel fließende Strom derart eingestellt, daß das proteinartige Gemisch in das Gel 16
ohne übermäßige Distorsion eindringen kann. Wenn das Eindringen erfolgt ist, wird die Stromstärke auf den
normalen Betriebswert erhöht und die Trennung durchgeführt Die Spülung der Sammelkammer 29 wird
begonnen, kurz bevor die erste abgetrennte Komponente des Gemischs durch die Trennwand 15 austritt. Sie
wird so lange fortgesetzt, bis alle gewünschten Komponenten gewonnen worden sind.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (11)
- Patentansprüche:...\ 1. Vorrichtung zur Trennung von proteinartigen Substanzen durch Gel-Elektrophorese, gekennzeichnet durch eine Säule(16) aus Elektrophorese-Gel mit einem oberen Bereich und einem unteren Bereich, eine Vorrichtung (21, 22, 28) zur Bildung eines im wesentlichen gleichmäßigen Potential in. Längsrichtung der Säule (16X eine Sammelkammer (29), die sich unterhalb der Säule (16) befindet und mit deren unteren Bereichen in Verbindung steht, sowie eine Gewinnungsvorrichtung (13,14), welche eine proteinartige Substanz, die in die Sammelkammer (29) eintritt, von der Säule in im wesentlichen radialer Richtung zu einer zentral angeordneten Austrittsvorrichtung (30) und durch diese hindurch nach außen leitet
- 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn-. zeichnet daß die Säule (16) aus EJektrophorese-Gel durch eine poröse, für Proteine durchlässige Trennwand (15) getragen wird.
- 3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Gewinnungsvorrichtung eine für Ionen durchlässige poröse Scheibe enthält die sich unterhalb der Säule (16) aus Elektrophorese-Gel befindet im Abstand von dieser angeordnet ist und eine zentrale Öffnung (30) aufweist welche mit der Sammelkammer (29) in Verbindung steht
- 4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Vorrichtung zur Bildung eines gleichmäßigen Potentials in Längsrichtung der Säule ein Paar Elektroden (21, 22} enthält die in getrennten Pufferlösungen (19, 20) angeordnet sind, welche in elektrischer Verbindung mit dem oberen bzw. dem unteren Bereich der Säule (16) stehen und an eine Gleichstromquelle (28) angeschlossen sind.
- 5. Vorrichtung nach Anspruch t, dadurch gekennzeichnet daß das Elektrophorese-Gil ein Acrylamid-Polymer-Gel ist
- 6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß sich die Säule (16) in einem an beiden Enden offenen Zylinder (10) befindet der im wesentlichen vertikal in einem offenen Gefäß (U) mit einem festen Boden angeordnet ist, wobei das Gefäß (H) der Aufnahme einer Pufferlösung (19) dient.
- 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß im oberen Bereich des Zylinders (10) eine Elektrode (21) angeordnet und in eine Pufferlösung (20) eingetaucht ist, eine zweite Elektrode (22) in der Pufferlösung (19) des Gefäßes (11) eingetaucht ist und beide Elektroden mit den Polen einer Gleichstromquelle verbunden sind.
- 8. Vorrichtung nach Anspruch 2, 3 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für Proteine durchlässige poröse Trennwand (i5) im unteren Bereich des Zylinders (10) angeordnet ist und die Säule (16) aus Elektrophorese-Gel trägt, wobei im Abstand unterhalb der Tunnelwand (IS) eine für Ionen durchlässige Scheibe (13) angeordnet ist, welche eine zentrale öffnung (30) aufweist, an die eine Leitung (14) angeschlossen ist.
- 9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die für Proteine durchlässige Trennwand (15) und die Scheibe (13) die Sammelkammer (29) begrenzen.
- 10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurchgekennzeichnet daß die Scheibe an der Sammelkammer (29) zugewandten Seite mit einer Dialyse Membran versehen ist
- 11. Vorrichtung nach Ansprucn 8, dadurch gekennzeichnet daß zwischen der für die Proteine durchlässigen Trennwand (15) und der Scheibe (13) ein Distanzteil (18) angeordnet ist
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US72365868A | 1968-04-24 | 1968-04-24 | |
US72365868 | 1968-04-24 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1919894A1 DE1919894A1 (de) | 1969-11-06 |
DE1919894B2 true DE1919894B2 (de) | 1976-12-30 |
DE1919894C3 DE1919894C3 (de) | 1977-08-18 |
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ID=
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Publication number | Publication date |
---|---|
DE1919894A1 (de) | 1969-11-06 |
BE732002A (de) | 1969-10-24 |
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GB1254346A (en) | 1971-11-17 |
FR2006843A1 (de) | 1970-01-02 |
NL6904523A (de) | 1969-10-28 |
IL31951A (en) | 1972-07-26 |
CH508420A (de) | 1971-06-15 |
SE366663B (de) | 1974-05-06 |
IL31951A0 (en) | 1969-06-25 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |