DE1645977A1 - Verfahren zur Herstellung von Molekularverbindungen von Inosin-Tryptophan - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Molekularverbindungen von Inosin-Tryptophan

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DE1645977A1 DE19671645977 DE1645977A DE1645977A1 DE 1645977 A1 DE1645977 A1 DE 1645977A1 DE 19671645977 DE19671645977 DE 19671645977 DE 1645977 A DE1645977 A DE 1645977A DE 1645977 A1 DE1645977 A1 DE 1645977A1
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Takekazu Akashi
Tsuneo Hirahara
Tadashi Nakamura
Yoshihisa Suzuki
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FRANKFURT (MA|N),16.Juni 1967
AJinomoto Co., InC9.
No.71 1-chome, Takara-cho, Chuo-ku, !Tokyo, Japan
Verfahren zur Herstellung von Molekularverbindungen von Ino s in-iDryp te ophan ·
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen und nützlichen Molekularverbindungen von Inosin-Tryptophan«
Inosin hat sich auf dem medizinischen Gebiet z.B«. als Stabilisator für konserviertes Blut, als physiologisches Aktivierungsmittel für Vitamine, als Tonikum der Leber oder des Heraens und auf dem chemisch-synthetischen Gebiet des Natrium-*«inosinats als Würzstoff nützlich erwiesen·
Die Erfindung umfaßt die Herstellung einer nützlichen Mole-» kularverbindung von Inosin-Iryptophan, die die pharmazeutische Wirkung des Inosins und des tryptophane, wie die tonische Wirkung auf innere Organe und die stärkende Wirkung, aufweist, sowie eine Methode zur Isolierung oder Reinigung von Inosin
009884/20 01
in guten Ausbeuten unter Nutzung der geringen Löslichkeit, die die Molekularverbindung von Inosin-Tryptophan in wäßrigem Medium aufweist, und die Spaltung von DL-Tryptophan in die optisch aktiven Isomeren unter Nutzung der Löslichkeitsunterschiede zwischen der Molekularverbindung von Inosin-L— Tryptophan und der von Inosin-D-Tryptophan in v/äßrigem Medium·
fe In Bezug auf die chemische Natur des Inosins wurde gefunden, daß
1) Inosin mit Tryptophan in wäßrigem Medium unter Bildung von Molekularverbindungen von Inosin-Tryptophan inet Reaktion tritt und
Z) diese Molekularverbindungen in wäßrigem Medium nur wenig löslich sind*
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren z\ir Herstellung der Molekularverbindungen von Inosin-Tryptophan, wonach Inosin mit Tryptophan in wäßrigem Medium umgesetzt wird·
Als Ausgangsmaterial können gemäß Erfindung das freie Inosin . wie auch seine Salze, ζ·Β· die Alkalisalze des Inosina, verwendet werden· Tryptophan bildet sowohl in der optisch aktiven als auch in der optisch inaktiven Form mit Inosin die Mole-' kularverbindungen und kann alsSalz verwendet werden. So läßt sich z.B. ein Alkalisalz des Inosins mit einem stark sauren Salz des Tryptophane umsetzen· Das inosin und das Tryptophan
/20 01
braucht nicht nur in reiner Form, sondern kann auch in Form Inosin oder Tryptophan enthaltender Materialien, die von ITucleinsäure» stammen, anderen Aminosäuren und'anorganischen Salzen verwendet werden»
Ale Lösungsmittel werden Wasser oder wasserhaltige! mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, ζ·Β· niedere Alkenolef
Il
wie Methanol» Äthanol und Propanol, Ketone» wie Aceton, Methyl— äthylketon usw., im Verfahren geinass Erfindung benutzt· '
In ο si ii und Tryptophan werden im allgemeinen in äqulmolarer Menge im wässrigen Medium miteinander zur Reaktion gebracht·
!.•ar: kann aber auch Inosin oder Tryptophan im Überschuß bis zu 1C Mol einsetzen, ohne daß Schwierigkeiten auftreten· Die Reoktion ist innerhalb einer kurzen Zeit bei Raumtemperatur oder darunter beendet, kann aber auch bei erhöhter Temperatur durchgeführt werden. Die Umsetzung findet im pH-Bereich von 1 bis 10, vorzugsweise von 3 bis 8, statte
Die Buchführung der Reaktion gemäß Erfindung zwischen Inosin und Tryptophan erfolgt, in konventioneller Weise? durch* Vermischen einer wäßrigen Inosinlcsung mit einer wäßrigen TryptopLanlösung, Susatz von festem Tryptophan tu einer wäßrigen Iriosinlösung oder Zusatz von festem Inosin zu einer wäßrigen Tryptophan!5sung. Kristalle der iiolekularverbindung von Inosin«. Tryptophan erhält man auch dann, wenn man die Umsetzung von ■ Inosin-mit Tryptophan in-einer Suspension oder Aufschlämmung äi+rchführt·.
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Zur Isolierung der Molekularverbindung von Inosin-Tryptophan aus der Reaktionsmi sehung können alle konventionellen Methoden zur Trennung von Festsubstanz und Flüssigkeit, wie Filtrieren und Zentrifugieren, angewandt werden, und zwar entweder unmittelbar oder erst nach Maßnahmen, wie Einengen oder Abkühlen oder Zusatz von Lösungsmitteln, wie Alkohol, zur Reaktionsmi schung, um die Molekularverbindung vollständig zur Kristallisation zu bringen.
Die erhaltene Molekularverbindung von Inosin-Tryptophan enthält Inosin und Tryptophan in äquimolarem Verhältnis0 Nach Umkristallisation aus Wasser kann sie als Trihydrat in Form nadeiförmiger Kristalle erhalten werdene Die differential-thermometrische und thermogravimetrische Analyse der Trihydratkristalle ergab, daß sie bei 67 bis 115·0 in Monohydratkristalle, bei 147*0 in wasserfreie Kristalle übergehen und sich bei 195*0 zersetzen. (Inosin und L-Tryptophan zersetzen sich dagegen bei 2150C bzw. 289*0.) . ■ , '
Das Verfahren gemäß Erfindung ermöglicht ferner aufgrund der geringen Löslichkeit der Molekularverbindung von Inosin-Tryptophan in wäßrigem Medium eine sehr wirksame Isolierung des Inosins aus Inosin enthaltenden Lösungen. Zu diesem Zweck wird Tryptophan in einer Meni>;e, die etwa der von Inosin entspricht, die in einer Inosin enthaltenden Lösung, wie Inosin-Fermenta— tionemedium oder der nach Abfiltrieren eines Teils des Inosins
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"aus einem solchen Fermeiiationsmediums in konventioneller Weise erhaltenen Mutterlauge, zugesetzt,.wobei sich die Molekularverbindung Inosin-Tryptophan bildet, die gefällt und isoliert wird·
Die Gewinnung von reinem Inosin aus Lösungen, die noch andere, der Nucleinsäure verwandte Verbindungen enthalten, wie Hypoxanthin oder Guanosin., mit Hilfe der bisher gebräuchlichen, konventionellen Kristallisationsverfahren ist mit Schwierigkeiten verbunden, da es niaht möglich ist, allein durch Umkristallisation kristallines Inosin zu erhalten, das frei von Verunreinigungen ist. Da Tryptophan im Ver« , · fahren gemäß Erfindung mit Verunreinigungen, wie Hypoxanthin und Guanosin, keine Molekularverbindungen bildet, gelingt es axf diesem Wege, Inosin,'allein in guter Ausbeute in Form der Molekularverbinduiig Inosin-Tryptophan abzutrennen und zu isolierenc
Zur Isolierung des Inosins aus der Molekularverbindung von Inosin-Tryptophan kann die Molekularverbindung durch Ionenaustauscher-Chromatographie in die einzelnen Kpmponenten getrennt werden. Man kann aber auch, das Inosin als Alkalisalfs abbrennen, wenn man die Molekularverbindung in Wasser suspendiert und den pH-Wert der Suspension mit Alkali auf mehr »la 10 einstellt«
Ein weiteres, sehr einfaches Verfahren, das Inosin von dem Tryptophan, zu trennen, "besteht - wie gefunden wurde - darin, die Molekularverbindung mit Methanol in Berührung zu bringen* Hierbei wird die Molekularverbindung unter Rühren in Methanol gegeben, wobei sich eine Suspension bildet© Wenn die Molekularverbindung langsam in Lösung geht, kristallisiert Inosin aus, während das Tryptophan in Lösung bleibt» »t Die Temperaturkontrolle während dieser Behandlung ist nicht so wesentlichι jedoch bei niedrigen Temperaturen werden maximale Inosinausbeuten erhalten»
Durch Zusatz von Impfkristallen wird die Kristallisation des Inosine begünstigt und durch Vermählen der kristallinen Mole~ kularverbindung zu feinem !Pulver vor dem Auflösen eine schnelle Reaktion gewährleistet. Die bei dieser Behandlung stattfindende Reaktion nimmt gewöhnlich etwa einige Stunden in Anspruch. Einige Minuten wird heftig gerührt} dann lasst " man die Mischung unter langsamem Rü»hren über Nacht stehen*
Eine der wesentlichsten Bedingungen dieser Behandlung stellt die Koneentrati on der Molekai2.#rv«rbiaaung in Methanol dar^ die unterhalt? von etwa 20 g/l, VOrssugsweie· bei etwa 15 g» liegen β oll* Bei zu hoher Konzentration der Molekularver~ . bindung kriitsallisiert ausser dem Inosin auch das Tryptophan in des Methanol aue·
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weitere, sehr wesentliche Bedingung stellt der Wassergehalt des Methanols darf der unterhalb von etwa 5 V/V liegen soll· Oberhalb von 5 %+ kristallisiert beim Abkühlen weder
Inosin noch Tryptophan» sondern statt dessen die Molekular« verbindung selbst aus· Versuche, die mit 10 g Molekularverbindung pro 1 wäßrigem Methanol bei 10eC durchgeführt wurden, zeigten, daß diese Behandlung bei 95%igem Methanol mit Erfolg durchgeführt werden konnte, dagegen bei 92%igem Methanol
nicht gelange .
I!
Andere organische Lösungsmittel, wie Äthanol, Aceton usw.,
wurden wegen der gleichzeitigen Kristallisation von Tryptophan und Iuosin oder der Unlöslichkeit der Molekularverbindunge» in diesen organischen Lösungsmitteln nicht benutzt·
Löst culer suspendiert man ein Balz des Inosins in wässriger Lösung, und neutralisiert man die erhaltene Lösung oder
Suspension mit einer Säure, wie Salz- oder Schwefelsäure,
dann erhält man nach Konzentration sehr reines kristallines
Inosin· "' - \
Es wurde weiterhin gefunden,dass
1) Inosin rr.it DL-Tryptophrin in wäßrigem Medium unter Bildung einer Mischung äquimolarer Verbindungen von Inosln-L-Tryptophan und Inosin-D-Tryptophan reagiert und
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-β* ...-■■■
2) die gebildeten Molekularverbindungen Inosin~L-Tryptophan und- Inosin-D-Tryptophan Unterschiede in den Kr is tall strukturen und den Loslichkeitseigensehaften zeigen».
Das Verfahren der Erfindung liefert somit auch eine Methode, DL-Tryptophan in die optisch aktiven Isomere zu spalten· Mit anderen Worten: DL-Tryptophan läßt sich leicht in die optisch aktiven Isomeren mittels eines Verfahrens spalten, das die Umsetzung von Inosin mit DL-Tryptophan in einem wäßrigen Medium unter Bildung einer Mischung der Molekularverbindungen: Inosin-L-Tryptophan und Inosin-D-Tryptophan, Abscheidung der Molekularverbindungen aus dem wäßrigen Medium durch fraktionierte Kristallisation der erhaltenen Mischung und Zersetzung des abgetrennten Inosin-L-(oder D)Tryptophane unter Bildung von L-(oder D)-Tryptophan umfaßt·
Es sind bereits verschiedene Methoden zur Spaltung von DL-Tryptophan in die optisch aktiven Isomeren - gewöhnlich in Form der N-Acyl- oder Alkylesterderivate - vorgeschlagen worden« Jedoch die vorbekanntenMethoden zur Spaltung-von N-Acyl-DL-tryptophan oder der Alkylester des DL-Tryptophans erfordern die Anwendung von optisch aktivem Material, wie Brucin, Chinin, D-Y-Phenyläthylamin, L-Lysinr L-(^)-threo-(i-p-Kitrophenyl^-Z-amino-propandiol-Ci,2) oder (+)-Camphersulfansäure als Spaltmaterial (vgl. USA 2 797 226, 2 813 876 ' und 2 865 928), Diese Methoden sind im allgemeinen wegen der relativ hohen. Kosten der Spaltmittel für die Praxis nicht geeignet·
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Ein eindeutiger Vorteil des Verfahrens gemäss Erfindung . stellt die Tatsache dar, dass hier das DL-Tryptophan selbst der Spaltungsreaktion unterworfen werden kann und nicht zuvor in eines seiner Derivate! wie das N-Acyl—DL-tryptophan oder den Alkylester des DL-Tryptophans, übergeführt werden mußP Ein weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß Erfindung ist darin zu sehen», daß sich die Spaltung in die optisch aktiven Isomere in einfacher Weise aber die Bildung und Zersetzung der Molekularverbindungen von Inosin-D-Tryptophan und Inosin-L—Tryptophan schneller als über die weiter oben erwähnten DL—Tryptophanderivate verwirklichen lässt*
Vorteilhaft ist beim Verfahren der Erfindung ferner, daß das Spaltmittel Inosin - verglichen mit einigen der zuvor benutzten optisch aktiven Materialien■- relativ billig ist und im Verfahren leicht wiedergewonnen werden kann,
Gemäss Erfindung bildet DL-Tryptophan mit Inosin in einem wässrigen Medium Diastereoisomere, die dann unter Nutzung der Unterschiede in den Löslichkeitseigenschaften voneinander getrennt werden·-
Die Molekularverbindungen von Inosin und L-Tryptophan bzw· von Inosin und D-Tryptophan können bei der Umsetzung von, L- bzw. D-Tryptophan mit Inosin in Wasser erhalten werden. Die
.4/ZOQt
-1ο-
Die Molekularverbindung voa Inosin und L-Tryptophan wird ■=- gewöhnlich, als Trihydrat,erhalten, während die von Inosin und D-Tryptophan als Monohydrat erhalten wird, wenn die entsprechenden Molekularverbindungen nahe bei Raumt,empe — ratur zur Kristallisation gebracht werden·
Diese Molekularverbindungen haben folgende physikalische Eigenschaften:
1) Schmelzpunkt (Kapillarmethode) = Inosin-L-Tryptophan · 3HpO: 195°O (Zersetzung unter Schäumen)
• Inosin-D-Tryptophan . HpO: 193°C
2) Elementaranalyse t
Inosin-L-Tryptophan ο 3H2O (C2iH30N6
C ,91 H ,74 N ,96
48 ,17 5 ,94 15 ,02
48 5 16
berechnet Ö%)
gefunden {%)
. Inosin-D-Tryptophan · HgO (G^H26NgOg)t
OHN
berechnet (%) ' 51,42 5,34 1?,14
gefunden(%) 51,39 5,44 17,15
3) Röntgenstrahlen-pulver-diffraktionsdaten (Cu.Κα) ί Einige hohe Spitzen im Diagramm (Intensitäten stellen die Höhen der Spitzen über dem Untergrund dar, wobei die höchste Spitze dem Wert 100 gleichgesetzt ißt)
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Inosin-L-Tryptophan* 3H2O d(X) Ι/Ιο Ιηοsin-D-TryptophanβHpO d(i> Ι/Ιο
2 θ (β) 10,7 30* 2 θ (9) 9,9 20
8,3 ■ 7,6 100- 8,9 8,53 20
11,6 6,35 90 10,4 7,14 20
14,0 5,57 30 12,4 5,87 30
15,9 5,34 50 15*1 5,75 20
16,6 5,07 50 15ι* 5,23 100
17,5 3,33 • 30 , 17,0 5,07 40
26,8 3,25 30 17,6 3,33 20
27,4 26,8 3,15 20
28,3
Inesin *- ■d(i) Ι/Ιο L- oder D-Tryptophan I/Io
2 β(°) 10,7' 20 2 ©(«) d(A) 100
8,3 , 8,4 100 4,9 18,0 20
10,6 6,66 30 9,9 8,9 50
13,3 6,57 60 14,8 5,99 100
13,9 '6,30 50 18,3 4,85 40
14,1 4,98 40 22,5 3,95 50
17,9 ^,07 20 23,2 3,83 40
21,9 23,5 3,79
Lcrlio';iiei." in Wasser
. 11 rverfcl :*
10°G
(berealmet auf Axthydrid) 300C 500C
.Ho
0,245
0,470 0,620
1,08 1,46 '
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Als Ausgangsmaterial können gemäß Erfindung außer dem freien DL-Tryptophan auch dessen Salze, wie das Hydro— Chlorid, verwendet werden, und außer dem freien Inosin sein.Alkalisalz, wie das Kalium- oder Hatriumsälz, benutzt werden· Jedoch wenn man entweder das B-Tryptophan oder das Inosin in der Sälzform "benutzt, wie es in der Kombination von freiem Inosin und DL-Tryptophan-KydiOChlorid oder in der .von ilatriuminosinat und freiem BL-Tryptophan der Fall ist, wird das Mischmedium mit Alkali oder Säure auf einen pH-Wert von 1 bis 10, vorzugsweise, von 5 bis 8, eingestellt» In diesem bevorzugten pH-Bereich liegen die Molekularver— bindungen von Inosin und D- und L-Tryptophan in stabiler Form vor· Die pH-Einstellung ist dagegen nicht nötig, venn sowohl das Inosin als auch das DL-Tryptophan in Salzform verwendet ' werden, wie das in der Kombination von Ifätriuminosinairfmd DL-Tryptophan-Hydrochlorid der Fall ist·
Bei Durchführung des Verfahrens gemäss Erfindung werden 1/3 bis 10 Mol, vorzugsweise t/2 bis 1 Mol, Inosin pro Mol DL-Tryptophan eingesetzt« Das DL-Tryptophan wird in einem wäßrigen Medium gelöst, dem dann das Inosin zugegeben wird, .wobei sich eine Mischung der Molekularverbindungen von Inosin-D-Trypto— phan und Inosin—L—Tryptophan bildet« Danach trennt man die Molekularverbindung von Inosin-L-Tryptophan, die eine geringere Löslichkeit als die Molekularverbindmag von Inosin-D—Tryptophan. aufweist, als erste durch fraktionierte Kristallisation ab·
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BAD QHK3INAL
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Die- fraktionierte Kristallisation führt man gewöhnlich in Wasser durch. Man kann sie aber auch in einer Mischung von Wasser mit einem geeigneten organischen !Lösungsmittel, das den Unterschied in Löslichkeitseigenschaften der beiden Molekularverbindungen begünstigt, ausführen» Wird beispielsweise die Bildung der Molekularverbinilungen in einem wäßrigen Medium herbeigeführt, das. einen niederen Alkylalkohol, wie Methanol oder Äthanol, enthält, dann laßt sich nur die Mole« kularverbindung von.Inosin und L-Tryptophan selektiv aus diesem Medium durch Kühlen oder Einengen auskristallisierene Die Kristallisationstemperatur liegt zweckmäßig im Bereich von 0 und 500C, vorzugsweise zwischen 5 und 200C Die Kristallisation nimmt einige- Minuten bis eine Woche in Ansprüche
Für die Kristallisation der Molekularverbindungen von Inosin— L-Tryptophan oder Inosin-D-Tryptophan hat es sich als wirksam erwiesen, Kristalle der gewünschten Molekularverbindung als Impfkristalle zuzusetzen» Nach dem Abfiltrieren der kristallisierten Molekularverbindung von Inosin und L-Tyyptophan wird die Mutterlauge, die ausser einer geringen Menge der Molekularverbindung von Inosinvund L-Tryptophan eine grosse Menge der Molekularverbindung von Inosin und D-Tryptophan enthält, soweit konzentriert, bis Kristallisation der Molekularverbindung von Inosin und D-Tryptophan einsetzt* In diesem Fall können der Mutterlauge Kristalle der Molekularverbindung von Inosin und D-Tryptophan als Impfkristalle zur Erleichterung der Kristallisation der Molekularverbindung von Inosin und
.D-Tryptophan zugesetzt werden»
■■■:-ν^:;;-"·: 009 884/20 01
Zur Gewinnung des optisch aktiven D- bzw. L-Tryptophana au3 den entsprechenden Molekularverbindungen von Inosin mit D- bzw. L-Tryptophan kann man die Molekularverbindimgen von Inosin mit B- bzw» !-Tryptophan einer Kationenaustauscherbehandlung* unterwerfen·- . .
■Zu diesem Zweck werden die Molekularverbindungen von Inosin und D- oder L~Tryptophan in Wasser suspendiert, die erhaltene Suspension auf pH 1 bis 2 eingestellt, wobei man eine klare Lösung erhielt, die man dann durch eine Kolonne mit einem kationischen Ionenaustauscherharz vom NE^-Typ hindurchführt* Hierbei wird nur das D- oder L—Tryptophan am Ionenaustauscherharz absorbiert, während das Inosin ausfließt. Gewünschfcenfalls kann man zur vollständigen Entfernung des Inosins die Kolonne mit Wasser waschen» Danach kann das am Ionenaustauscherharz absorbierte D~ oder L-Tryptophan mit wäßriger Ammoniaklösung eluiert und nach Konzentrieren und Kühlen aus dem Ämmoniak- ψ eluat das reine kristalline D- oder L-Tryptophan erhalten werden. Das auf diese Weise erhaltene D-Tryptophan kann in bekannter Weise zu DL-Tryptophan racemisiert werden (vgl» USA. 3 213 106), wonach D-Tryptophan zunächst in Wasser auf 150 bis 2000C erhitzt und dann wieder gemäß Erfindung in die optisch aktiven Isomere gespalten wirdo
Die Racemisierung von D—Tryptophan kann nach der Rückgewinnung des Inosins durchgeführt werden, ohne daß zuvor das D-Trypto« •-phan in kristalliner Form aus der Molekularverbindung von
BAD 009884/2001
Inosin—D—Tryptophan-isoliert zu werden toaucht^ So kann man ζ.Β« zur Racemisierung die B-Tryptopaan. enthaltende rLösung direkt erhitzen, die nach Abtrennung der Molekularverbindung von Inosin-L—Tryptophan durch fraktionierte Kristallisation und nach Rückgewinnung des Inoslns aus der Restlösung erhalten vrird und in der noch -die Molekularverbindurig von Inosin-D-* Tryptophan vorhanden ist.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfirdun ο Hieraus sollen jedoch keine Beschränkungen bergeleitet werdenc
Herstellung der Molekularverbindung von Inosin-Tryptophan
Zu 1 1 Wasser werden 5i7 g Inosin und 4,3 g L-Tryptophan jiepeben und die erhaltene Suspension unter Rühren, Mischen, und Erhitzen vollständig in Lösung gebracht* Aus dieser; lösung kriFtalliPiert nan durch Kühlen die gebildete Mole— kularverbindariE von In ο sin-L—Tryptophan aus, filtriert die erhaltenen Erlstalle ab und trocknet sie bei Raumtemperatur· 3s"A-iDht ?,7 γ:, Arsbeute 8? %, Smp, 195*0 (Zersetzung)e
Einige hohe Spitzen (2θβ) waren auf Diagrammen der Röntgen-Etrahlen-pulv9r-diffraktions(Cti.Ea)-Metiioäe bei 8,3 , 11,6 , 14,ο , 15,9 , 16,6 , 17,5 , 26,8 und 29,4 vorhanden..
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-1 b— H · 1645977 . . N ■
Elementaranalyse: C 5,74 15,96
berechnet (%) 47 ,91 5,49 16,o2
gefunden (%) 48
Beispiel 2 Herstellung der Molekularverbindung von Ino sin-L-Trypt ophan
Zu 500 g wäßriger Inosinlösung (3,3 g /100 ecm) gab man unter Rühren 12,6 g kristallines L-Tryptophan, ließ die Mischung 2 Stunden stehen und hielt sie bei 5e0 über Nacht· Die Molekularverbindung von Inosin-L—Tryptophan wurde zur Kristallisation gebracht, die gebildeten Kristalle abfiltriert und getrocknet*. Gewicht 30,5 gi Ausbeute 95 %» Smp· 195«C (Zersetzung)·
Einige hohe Spitzen (2Θ0) waren auf dem Diagramm der Röntgenstrahlen-pulver-diffraktions-(Cu.Ka)-Methode bei 8,3 , 11,6 , 14,0 , 15,9 , 16,6 , 17,5 » 26,8 und 27*4 vorhanden,
Beispiel 3 Reinigung von Inosin
30 g kristallines Inosin, das 0,9 g Guanosin enthielt, wurden in 300 ecm Wasser gelöst, diese Lösung mit 1,2 1 einer erhitzten Lösung von 22,2 g L-Tryptophan vermischt und danach auf Raumtemperatur abgekühlte Die L-ol^kularverbindung von Inosin-L-»Tryptophan wurde zur Kristallisation gebracht und
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ab'filtriert. Die Ausbeute betrug 45 g (Trockengewicht)o Es waren somit 82 % des Inosins als Molekularverbindung " .gefällt worden« Die PapierChromatographieanalyse ergab, dass diese Kristalle kein Guanosin mehr enthielten.»
In einem Parallelversuch kühlte man die ursprüngliche Inosinlösung, die Guanosin enthielt, unmittelbar "ab, ohne daß sie zuvor mit der erhitzten L- Tryptophan!ösnng vermischt worden war. Das Inosin wurde ebenfalls zur Kristallisation gebracht und abfiltriert. Die Inosinausbeute betrug 60 %\ diese Inosinkrisballe waren durch Guanosin verunreinigte
33 g der.reinen Molekularverbindung von InosinÄL-tryptophan suspendierte man in 200 ecm Wasser, stellte mit Natriumhydroxyd den pH-Wert äer Suspension unter Erhitzen auf 11 ein, wobei man eine klare Lösung erhielt, ie man auf 40 ecm einengte und auf 5°C kühlte, um das Natriumsalz des Inosins -auszu·· fällen· Die Ausbeute betrug 21 g· Dieses Natriumsalz des Inosins löste man in 200 ecm Wasser bei 500G, stellte die Lösung mit Salzsäure auf pH 5fO- ein und kühlte ab« Man erhielt 13 g Inosin mit einem Reinheitsgrad von 100 %a
Beispiel 4 .
Isolierung von Inosin
Ein Inosin-Fermentationsmedium wurde mit Celite filtriert, um aggregierte und suspendierte Materialien zu entfernen, wobei man 300 ecm eines klaren Filtrates mit 3,9 g Inosin erhielii«,, -■■,,;. c\f :g . .-"-... ; -. - '"'.-■ ' . 009884/2001
Dieses Filtrat engte man auf etwa 50 ecm ein und kristallisierte das Inosin bei 50C aus· Nach. 4 Stunden filtrierte man die Kristalle ab und wusch sie mit Wasser; Man erhielt 5g, die 2,5 g Inosin enthielten» Die mit den Waschwässern vereinigte Mutterlauge enthielt 1,2 g Inosin in=60 ecm. Dieser Lösung setzte man 1,0 g L-Tryptophan bei 300C mit Spuren von Impfkristallen der Molekularverbindung zu, rührte die Lösung 1 Stunde und kühlte sie dann etwa 2 Stunden auf 5eG»
Den Kristallniederschlag filtrierte man ab, wusch und trocknete ihn. Man erhielt 2,1 g mit einem Gehalt von 1,0g Inosine
Dann vermählte man die Kristalle zu einem feinen Pulver, das man in 200 ecm Methanol suspendierte, setzte Impfkristalle von Inosin in Spuren zu, um die Kristallisation zu begünstigen, und rührte die Suspension etwa 5 Stunden bei 10°C· Das kristalline Inosin filtrierte, wusch und trocknete | " man· Man erhielt 0,8 g. Damit waren 66 % des Inosins aus der Mutterlauge des konzentrierten Mediums isoliert» Die Gesamtausbeute an Inosin betrug 85 %*
Beispiel 5 Spaltung von BL-!Tryptophan in die optischen Isomere
1,02 g DL-Tryptophan gab man in 200 ecm Wasser, wrv/ärmte die Mischung (auf etwa 70°C), um das DL-Tryptophan vollständig in Lösung zu bringen, setzte noch in der Wärme 0,66 g Inosin zu und kühlte die erhaltene Mischung auf 30e0, um die Mole—
BADORlGiNAL
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kularverbindung von Inosin und L-Tryptophan in kristalliner Form auszufällen· Danach kühJie man die Mischung auf 10*0, hielt sie 1 Stunde unter Rühren auf dieser Temperatur und filtrierte die ausgefallenen Kristalle ab. Ausbeute 1,0 g« ITV-Absorption und die Analyse der optischen Drehung ergab, daß die Kristalle 52,9 % Inosin, 24,9 % !-Tryptophan und 0,9 % D-Tryptophan enthielten /f*a_7 IJ61 - -28,8 (Lösungsmittel t Wasser), optischer Reinheitsgrad 95 %·
0,9 g der so erhaltenen Kristalle suspendierte man in 30 ecm Wasser, stellte den pH-Wert der Suspension mit Salzsäure auf 1,5 ein und fährte sie durch eine Kolonne von 5 ecm. Ionenaustauscherharz Dowex-50-W (NH^-Typ). Danach wusch man die Kolonne mit Wasser und führte 100 ecm 0,5n wäßrige Ammoniaklösuns; durch die iColoime. Die vereinigten Fraktionen des Ammoniakeluats engte man ein, kühlte es und filtrierte die ausgefallenen L-Tryptophankristalle ab· Die Ausbeute an kristallinem L-Tryptophan betnug 0,18 g· Messung der spezifischen Drehung und Papierchromatographie ergab, daß es sich bei den Kristallen um reines kristallines L-Tryptophan handelte·
Beispiel 6
Spaltung von DI—Tryptophan in die optisch aktiven Isomere Eine liischurig von 1,02- g DL-Tryptophan und 4-50 ecm Wasser erwärmte man (auf 60°G), um das DL-Tryptophan völlig zu lösen. Dann mlsch-üe. sär. 4*«· eine Lösung voi. 1,34 g Inosin in 50 ccn
009884/2001
äA0 ORIGINAL
Wasser ein und kühlte die erhaltene Mischung auf 100C'. Nach 15stündigem Stehen filtrierte man den Kristall-nieder-" schlag ab. Ausbeute 1,0 g» Messung der UV-Absorption und Analyse der optischen Drehung ergab, daß die erhaltenen Kristalle 35»4- % Inosin, 25,7 % L-Tryptophan und 2,5 % D-Tryptophan enthielten /Γα.7%ΐ+ζ<\ m -29,9 (Lösungsmittel : Wasser).
Diese Kristalle wurden der in Beispiel 5 beschriebenen Behandlung mit Ior.enaustauscherharz unterworfen, wobei m?n 0,2 g kristallines L-Tryptophan erhielt« Der optische Reinheitsgrad dieser Kristalle betrug nach Messung der spezifischen Drehung 98 %·■ .
009884/2001
BAD ORIGINAL

Claims (2)

Patentansprüche
1) Verfahren zur Herstellung von lolekularverbindungen von Inosin-ii-Tryptophan und/oder Inosin_D~0?ryptophanj· dadurch gekennzeichnet, dass Inosin mit Ip= und/oder D« Tryptophaii umgesetzt und die erhaltenen Molekularverbindungen in kristalliner Form isoliert werden»
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet % dass die beiden kristallinen Enantiomdrphe der Molekularverbindungen auf Grund der LoslichkeitsuntersGhiede im Medium voneinander getrennt werden* " ■
0098.84/20
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