DE1643701C - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Creatinphosphat - Google Patents

Description

trationen über diese Werte hinaus bringt keinen besonderen Vorteil.

Bei der Umsetzung werden Creatin und 3-Phosphoglycerinsäure in etwa äquimolarem Verhältnis verbraucht. Die Reaktion läßt sich durch Anwendung eines geringen Überschusses eines dieser beiden Stoffe leicht bis zur vollständigen Umsetzung des anderen Reaktionspartners durchführen. Vorzugsweise werden etwa 1,1 bis 1,5 Äquivalente Creatin pro Äquivalent 3-Phosphoglycerinsäure eingesetzt, um eine quantitative Umsetzung der letzteren zu erzielen. Ein Überschuß an Creatin ist von Vorteil, da dieses den wesentlich billigeren Reaktionspartner darstellt.

Adenosintriphosphat (abgekürzt ATP) wird nur in katalytischen Mengen zugesetzt. Man verwendet etwa 1 Äquivalent Adenosintriphosphat auf je 60 bis 100 Äquivalente Creatin bzw. 3-Phosphoglycerinsäure. Die Adenosintriphosphatmenge kann natürlich auch erhöht werden, dies ist jedoch aus wirtschaftlichen Gründen unerwünscht und technisch nicht von besonderem Vorteil. Die Adenosintriphosphatmenge kann auch verringert werden. Hierbei erhöht sich jedoch die Reaktionsdauer.

Wie bereits erwähnt, ist ein Zusatz von Puffer nicht erforderlich. Der gewünschte alkalische pH-Wert kann mit irgendeinem alkalischen Mittel wie Natronlauge eingestellt werden.

Der geeignete pH-Wert liegt zwischen etwa 7,0 und 11, vorzugsweise zwischen 8 und 9. Die Reaktionstemperatur liegt günstig zwischen Zimmertemperatur und etwa 45° C, vorzugsweise zwischen 32 und 40° C. Die angegebene Temperatur kann bei Verwendung einer relativ hohen Enzymkonzentration noch gesteigert werden und auch 50° C noch etwas überschreiten.

Die Reaktionsdauer hängt von der Temperatur und von der eingesetzten Rohenzymmenge ab. Bei den angegebenen bevorzugten Mengen und Temperaturen beträgt die Ausbeute nach einstündiger Reaktionsdauer etwa 80 bis 90% der Theorie. Durch Verlängerung der Reaktionsdauer bis zu 3 und gegebenenfalls auch 4 Stunden ist unter den genannten Bedingungen die Erzielung einer quantitativen Ausbeute möglich.

Wenn die Reaktion bis zum gewünschten Umsetzungsgrad fortgeschritten ist, wird sie durch rasches Erhitzen des Reaktionsgemischs auf eine Temperatur von 70 bis 100° C, vorzugsweise 80 bis 90° C abgestoppt. Hierbei flockt Protein aus und wird gegebenenfalls nach dem Abkühlen entfernt, beispielsweise durch Abfiltrieren.

Die Gewinnung des Creatinphosphats erfolgt durch Abtrennung der Fremdionen, Einengen der Lösung und Fällung durch Zusatz von Alkohol oder einem anderen, die Löslichkeit herabsetzenden Stoff, vorzugsweise unter Animpfen mit Creatinphosphatkristallen.

Die Lösung wird bei schwach-alkalischem pH-Wert (vorzugsweise pH 8 bis 8,5) mit einem mit Natrium equilibrierten Kationenaustauscher behandelt. Vorzugsweise wird sie über eine Austauschersäule gezogen. Dem creatinphosphathaltigen Durchlauf, der dann eingeengt wird, wird Alkohol bis zum Auftreten einer deutlich erkennbaren Trübung zugesetzt. Vorzugsweise wird mit Creatinphosphat angeimpft und die Mischung einige Zeit in der Kälte stehengelassen. Der dabei gebildete Kristallbrei wird vom Überstand abgetrennt. Das so erhaltene Roh-Creatinphosphat wird durch eine, gegebenenfalls zwei Umkristallisationen gereinigt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

a) Herstellung eines Kaninchenmuskelextraktes.
Kaninchenmuskel wird zerkleinert; homogenisiert und mit Wasser extrahiert. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt und die Mischung 15 Minuten auf 53° C erhitzt. Ausgefallenes Protein wird abzentrifugiert. Dem Überstand wird Ammonsulfat bis zu einer Konzentration von 1,5 M zugesetzt.

Eventuell ausfallendes Protein wird abzentrifugiert. Dann wird die Ammonsulfatkonzentration auf 3 M erhöht. Das ausgefallene Protein wird abzentrifugiert und die erhaltene Ammonsulfatpaste nach 3stündiger Dialyse gegen Leitungswasser für die weitere Reaktion eingesetzt.

b) In 1001 Wasser werden 260 g Creatin gelöst, dann werden 15 g ATPNa₂H^SH₀O (entspricht etwa 12 g ATP), 380~g~3-Phösphoglycerinsäüre-Na, 14 g Mg-Acetat, 17 g K-Acetat und 80 g Ammoniumacetat zugegeben und gut gemischt. Mit Natronlauge wird der pH-Wert auf 8,5 eingestellt und die Mischung auf 37° C erwärmt. Nun wird das nach a) erhaltene Enzymgemisch zugegeben, das etwa 80 000 Einheiten Creatinphosphokinase, etwa 100 000 Einheiten Enolase, etwa 100 000 Einheiten Phosphorglyceratmutase und etwa 250 000 Einheiten Pyruvatkinase enthält. Unter Konstanthalten des pH-Wertes wird die Mischung 1 bis 3 Stunden bei 37° C belassen.
Nach Ablauf der Reaktion, die durch enzyma-

4" tische Analyse des gebildeten Creatinphosphats verfolgt werden kann, wird die Mischung rasch auf 80 bis 90° C erhitzt und wieder gekühlt. Das ausgefallene Protein wird gegebenenfalls abfiltriert, und die Lösung wird über 101 mit Natriumhydroxyd behandelten und auf pH 8 bis 9 gewaschenen Kationenaustauscher gezogen. Der schwachgelb gefärbte klare Durchlauf wird gesammelt und eingeengt, bis das Volumen etwa 4 bis 61 beträgt. Nun wird mit 8 bis 121 Alkohol unter gutem Rühren versetzt und bei beginnender Trübung mit kristallisiertem Natrium-Creatinphosphat angeimpft. Die Mischung läßt man über Nacht in der Kälte stehen, saugt den ausgefallenen Kristallbrei ab und wäscht ihn gut mit Alkohol. Nach Umkristallisation

wird das Creatinpliosphat im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 300 bis 350 g Creatinphosphat
(CP-Na., · 6 H₂O).

Beispiel 2

Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch wird an Stelle des dialysierten Kaninchen-Rohenzyms ein Kalbfleischextrakt verwendet, der durch Extraktion von frischem zerkleinertem Kalbfleisch mit dem doppelten Volumen Wasser durch Abfiltrieren der festen Bestandteile gewonnen wurde. Es wird soviel

5 * €

Extrakt verwendet, daß 50 000 bis 80 000 Ein- Menge dieser Ionen bereits im Extrakt vor-

heiten Creatinphosphokinase ziir Anwendung banden ist.

kommen. Die Reaktionsdauer beträgt 2 bis 4 Stunden,

Der Zusatz von Magnesium und Kaliumionen die Ausbeute 250 bis 300 g, da einmal öfter

kann hier unterbleiben, da eine ausreichende 5 umkristallisiert werden muß.

Claims (3)

1 2 mit einem wäßrigen Muskelextrakt Creatinphosphat Patentansprüche: bilden. Hierbei handelt es sich jedoch nicht um ein präparatives Verfahren, und die Ausbeuten liegen

1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung niedrig, obwohl im Mikromaßstab gearbeitet wird, von Creatinphosphat durch Inkubieren von 5 Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines prä-Creatin und 3-Phosphoglycerinsäure mit einem parativen enzymatischen Verfahrens, welches in wäßrigen Muskelextrakt in Gegenwart von äußerst einfacher Weise und mit guter Ausbeute in Adenosindiphosphat im alkalischen Medium und jeder beliebigen Dimension durchführbar ist, ohne Abstoppen der Reaktion, dadurch gekenn- teuere Ausgangsprodukte zu benötigen, zeichnet, daß man an Stelle von Adenosindi- io Das erfindungsgemäße Verfahren zur enzymatiphosphat katalytische Mengen Adenosintriphos- sehen Herstellung von Creatinphosphat durch Inkuphat verwendet, die Reaktion durch kurzzeitiges bieren von Creatin und 3-Phosphoglycerinsäure mit Erhitzen der Lösung auf 70 bis 100° C abstoppt einem wäßrigen Muskelextrakt in Gegenwart von und das gebildete Creatinphosphat daraus in an Adenosindiphosphat im alkalischen Medium und Absich bekannter Weise isoliert 15 stoppen der Reaktion ist dadurch gekennzeichnet,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- daß man an Stelle von Adenosindiphosphat katalytikennzeichnet, daß 1,1 bis 1,5 Äquivalente Crea- sehe Mengen Adenosintriphosphat verwendet, die tin pro Äquivalent 3-Phosphoglycerinsäure ein- Reaktion durch kurzzeitiges Erhitzen der Lösung gesetzt werden. auf 70 bis 100° C abstoppt und das gebildete Crea

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, da- 20 tinphosphat daraus in an sich bekannter Weise iso durch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis liert.

Adenosintriphosphat zu Creatin etwa 1:60 bis Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es

1:100 beträgt. überraschenderweise möglich, die oben geschilder

ten Schwierigkeiten zu beseitigen und auf äußerst »5 einfache Weise hervorragende Ausbeuten zu erzic-

len.

Es ist weiterhin überraschend, daß die enzymatische Reaktion durch Erhitzen auf die angegebene Temperatur abgestoppt werden kann, da aus der

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel- 30 Vorschrift von Zeile et al. auf eine ausgeprägte lung von Creatinphosphat, welches sich zur Durch- Temperatureinpfindlichkeit von Creatinphosphat geführung in industriellem Maßstab eignet. schlossen werden muß und die chemische Synthese Es ist bereits bekannt, Creatinphosphat chemisch bei niedriger Temperatur, allenfalls Zimmertemperaherzustellen. Eines dieser Verfahren besteht in der tür, ausgeführt wird. Die Säureempfindlichkeit des Phosphorylierung von Creatin mit Phosphoroxy- 35 Phosphocreatins verbietet auch die üblichen Isoliechlorid (K. Zeile und G. Fawaz, Hoppe-Seyler's rungsmethoden für organische Phosphorsäureverbin-Zeitschrift für physiologische Chemie 256, 193 düngen, wie sie z. B. für Nucleotide oder Zucker-[1938]). Die hauptsächlichen Nachteile dieses be- phosphate möglich sind. Ein noch so kurzes Ankannten Verfahrens sind säuern sowie eine Austauscherchromatographie oder

al schlechte Ausbeute ⁴° ^KohleP^assag^{e sind n5cht ohne} erhebliche Verluste

aj scmecnte Ausbeute, durchführbar.

b) die Reaktionsbedingungen müssen ziemlich, ge- Tatsächlich hält Creatinphosphat jedoch, wie nunnau eingehalten werden, um wenigstens, diese mehr gefunden wurde, im schwach-alkalischen Begerivige Ausbeute zu erzielen, und reich sogar ein lOminütiges Erhitzen auf 80 bis

c) die Methode eignet sich nicht zur Durchführung ^{45 90}° ^{C aus}: ohne daß merkliche Verluste entstehen.

in größerem Maßstab, da sich der entstehende , ^OcTJ^e]^m, erfindungsgemaßen Verfahren yerwen-

Na.,PCyBrei weder rühren noch kühlen läßt. ^dete Muskelextrakt kann einfach durch Extrakten

·' von frischem Fleisch, z. B. Kalbfleisch, mit Wasser

Auch das aus der USA.-Patentschrift 3 036 087 und Abfiltrieren der unlöslichen Bestandteile herge-

bekannte chemische Verfahren stellt eine vielstufige 50 stellt werden. An Stelle von Kalbfleischextrakt

Synthese dar, welches sich für die großtechnische können natürlich auch Extrakte aus Muskeln ande-

Durchführung nicht eignet und sich nicht in die rer Herkunft mit gleichem Erfolg verwendet werden.

Praxis eingeführt hat. Wichtig ist, daß der MuskelextrcV.t eine gewisse

Eine enzymatische Phosphorylierung von Creatin Menge Creatinphosphokinase enthält, die jedoch

zur analytischen Bestimmung von Creatin im Ge- 55 sehr viel geringer sein kann, als sie entsprechend

webe war bereits bekannt (H. U. Bergmeyeir, Me- der analytischen Vorschrift benötigt wird. Für einen

thoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, befriedigenden Ablauf des erfindungsgemaßen Ver-

Academic Press, 1963, S. 407). Dieses Verfahren fahrens genügt eine Einheit Creatinphosphokinase

war jedoch zu einer präparativen Herstellung un- für je 1 bis 10 mg Creatin. Es können natürlich auch

brauchbar, da hierzu teures Phosphoenolpyruvat und 60 größere Enzymmengen eingesetzt werden, wodurch

hochgercinigte Creatinphosphokinase notwendig sind zwar die Reaktionsdaucr etwas verkürzt wird, dar-

und überdies die Reaktion durch Serumbestandteile über hinaus aber keine besonderen Vorteile entste-

gehemmt wird. AußerJ.m wäre bei den einzuhalten- hen.

den Konzentrationen die Isolierung von gebildetem Auch die Verwendung eines Puffers ist nicht er-

Creatinphosphat sehr aufwendig. 65 forderlich. Von Vorteil ist ein Zusatz von Magne-

Aus Biochem. J. 70 (1958) S. 633 bis 641 ist es sium und Kaliumionen, falls im Muskclrohextrakt

bekannt, daß Creatin und 3-Phosphoglycerinsäure die Konzentration dieser Ionen wesentlich unter 1

in Gegenwart von Adenosindiphosphat bei pH 7,4 bis 2 · 10~ⁿ M liegt. Eine Erhöhung der Konzen-