DE1568452A1

DE1568452A1 - Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit geschuetzten Aminogruppen

Info

Publication number: DE1568452A1
Application number: DE19661568452
Authority: DE
Inventors: Chamberlin James Wesley
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1965-05-12
Filing date: 1966-05-04
Publication date: 1972-03-09
Also published as: DE1793698C2; BR6679455D0; BE680797A; DE1568452B2; DE1793698B1; US3467690A; DE1568452C3; GB1085692A; CH462191A

Description

Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit geschützten Aminogruppen

Die·Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Von neuen Verbindungen mit geschützten Aminogruppen.

Peptide werden gewöhnlich hergestellt, indem grundsätzlich zwei oder mehr Aminosäuren in solcher Weise miteinander verknüpft werden, daß zwischen den Molekülen eine Amidbrücke gebildet wird. Da Aminosäuren wenigstens bi-' funktionell sind, ist es erforderlieh, in einer gegebenen Aminosäure alle funktioneilen Gruppen, die nicht direkt an der Amidverknüpfungsreaktion beteiligt sind, vor diesem Verknüpfungsschritt in einen inaktiven Zustand überzuführen. Wenn man zuläßt, daß solche reaktionsfähigen funktioneilen Gruppen zugegen bleiben, weren infolge des Vorliegens großer Mengen unerwünschter Nebenprodukte aus der Wechselwirkung dieser, funktioneilen Gruppen die Ausbeuten erniedrigt und Reinigungsschritte erschwert. Es sind bereits verschiedene Möglichkeiten bekannt, um die funktioneilen Gruppen einfacher Aminosäuren durch Schutzgruppen in solcher Welse in einen inaktiven Zustand überzuführen, daß nur die gewünschte

209811/1823

UnUiruigtiM f" ' * " · . ;· Μι. ι Sau 3 de» "<■.,^runosg-.·;,. v. 4,9.196.?,

funktionelle Gruppe für die Umsetzung bei der Ausbildung der Amidbindung zur Verfügung steht. Es ist erforderlich, daß die sogenannte "Schutzgruppe" vor der Araidbildung leicht mit der Aminosäure verknüpft und aus dem gebildeten Peptid nach erfolgter Kondensation ohne gleichzeitige Spaltung der neugebildeten Amidbindung leicht entfernt werden kann. Als N-ständige Schutzgruppen also Gruppen, die eine Beteiligung des Arainoanteils an der Reaktion verhindern, werden bereits beispielsweise Benzyloxycarbonyl-, Trityl-, Allyloxy- und ähnliche Gruppen angewandt.

Beispielhaft für die bekannten N-ständigen Schutzgruppen ist die Benzyloxycarbonylgruppe. Diese Gruppe bildet mit dem Stickstoffatom eine Carbamatbindung und läßt sich leicht nach bekannten Arbeitsweisen mit der Aminosäure verknüpfen. Die durch die Benzyloxycarbonylgruppe geschützte Aminosäure wird dann zur Herstellung eines Dipeptids, d.h. eines aus zwei Aminosäureanteilen aufgebauten Moleküls verwendet. Nachdem die geschützte Aminosäure unter Bildung der gewünschten Peptidbindung reagiert hat, wird die Benzyloxycarbonylgruppe durch Hydrogenolyse oder Hydrolyse entfernt. Diese Reaktionen begünstigen die Spaltung der Carbamatbindung, die die Schutzgruppe bildet, und lassen die Peptidbindung unversehrt. · Die beteiligten Reaktionen sind jedoch Gleichgewichtsreaktionen und verursachen gewöhnlich eine gewisse Spaltung der Amidbindung.

überraschenderweise wurde nun ein Verfahren zur Herstellung neuer geschützter Aminoverbindungen gefunden, mit dem endständige Aminogruppen von Aminosäuren geschützt werden können, wodurch die Verwendung solcher geschützter Aminosäuren zur Herstellung von Peptiden und ähnlichen Verbindungen ermöglicht wird. Die Aminoschutzgruppe kann nach

209811/1823

dem erfindungsgemäßen Verfahren leicht hergestellt und mit der Aminosäure verknüpft werden und anschließend wieder fast quantitativ und ohne Zugabe von Säure und Base aus dieser entfernt werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel

OR R¹ 0 tt t t Il

CH₅ - O -· C - N. - C - O - OH

in der R für sich allein ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, R₁ für sich allein ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit 1 bis 4 · Kohlenstoffatomen, einen hydroxysubstitulerten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einen carboxysubstituierten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einen durch eine niedere Alkylmercaptogruppe substituierten"Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einen guanidinsubstituierten Alkylrest mit 1 bis 4-Kohlenstoffatomen, einen guanidinoxysubstituierten Alkylrest .mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Imidazolylmethylgruppe, eine Indolylmethylgruppe, einen Thienylrest, einen Purylrest, einen Phenylrest oder einen Benzylrest oder R und R zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen Piperidin- oder Pyrrolidinring bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel

209811/1823

If

CH₂-O-C-R²

ρ
in der R ein Halogenatom, eine Azidogruppe oder einen p-Nitrophenoxyrest bedeutet, mit einer Verbindung der Formel

R R¹ 0

t IM.

H-N -C - C - OH

H
in der R und R wie oben definiert sind, umsetzt.

Zu den oben genannten Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen gehören beispielsweise Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropy1-, n-Butyl-, Isobutyl-, see. Butyl- und tert.-Butylreste. Beispiele für niedere Alkylgruppen sind die Methyl-, Äthyl-, n-Propyl- und Isopropylgruppen; niedere Alkoxygruppen sind beispielsweise die Methoxy-, Äthoxy-, n-Propoxy- und Isopropoxygruppe. Halogenatome sind beispielsweise Fluor, Chlor und Brom und niedere Alkylmercaptogruppen die Methylthio-, Äthylthio-, n-Propylthio- und Isopropylthiogruppe.

Die erfindungsgemäß als Ausgangsstoffe verwendeten oder als Produkte erhältlichen Verbindungen, wie sie oben definiert wurden, enthalten zwar allgemein bekannte

209811/1823

■■-· 5 -*■'·■■

organische Reste oder Substituenten, wobei insbesondere R¹ beispielsweise einen Phenyl- oder Benzylrest oder bestimmte heterocyclische Reste bedeuten kann, es sei jedoch darauf hingewiesen, daß solche Reste einen oder meh- ' rere Substituenten aufweisen können. Beispiele für solche aus Einzelatomen oder Gruppen bestehende Substituenten sind Phenyl-, Halogen-, niedere Alkyl-, niedere Perhalogenalkyl-, niedere Alkoxy-, niedere Alkylmercapto-, Cyan, Acetyl—j, Acetamido-, Hydroxy-j,- Hydroxymethyl-, ß-Hydroxyäthylsubstituenten und ähnliche Gruppen.

Als Beispiele für erfindungsgemäß erhältliche Verbindungen seien folgende Einzelverbindungen genannt: N-3,5-Dimethoxybenzoxycarbonyl-L-tyrosin, N-3,5-Dimethoxybenzoxycarbonylalalin, NO^-Dimethoxybenzoxycarbonyl-phenylalanin, N-3,5-Dimethoxybenzoxycarbonyl- ölamin^n-buttersäure, N-3>5-Dimethoxybenzoxycarbonyl-D-valin, N-3,5-Dimethoxybenzoxycarbonyl-2,4-dichlorpheny!alanin und N-3,5-Dimethoxy.benzoxycarbonylod." amino-adipinsäure.

Die geschützten Aminosäuren werden folgendermaßen hergestellt: 3j5-Dimethoxybenzylalkohol wird mit Phosgen in Gegenwart eines Säureaczeptors, zum Beispiel Dimethylanilin, Pyridin oder dergleichen, zu 3>5-Dimethoxybenzylchlorcarbonat umgesetzt. Um die geschützte Aminosäure zu erhalten, kann man das Chlorcarbonat direkt mit der Aminosäure umsetzen. Man kann es aber auch zunächst nach bekannten Arbeitsweisen in das Azid überführen, beispielsweise durch Umsetzung mit Hydrazin und anschließende Diazotierung mit einem anorganischen Nitrit. Das Azid wird dann mit der Aminosäure nach bekannten Verfahren für die Umsetzung

2 09811/182 3 BAD ORIGINAL

von Aziden mit Aminoverbindungen umgesetzt. Ferner kann man den 3,5-Dimethoxybenzylalkohol zunächst durch Behandlung mit p-Nitrophenylchlorcarbonat in Gegenwart eines Säureaczeptors, zum Beispiel von Pyridin, Dimethylanilin oder dergleichen, in das p-Nitrophenylcarbonatderivat überführen und anschließend mit der Aminosäure in Gegenwart eines basischen Mittels, zum Beispiel wäßriger Natriumhydroxydlösung, umsetzen.

Die geschützte Aminosäure wird zur Herstellung von Peptiden nach einem der verschiedenen für die Herstellung solcher Verbindungen bekannten Verfahren verwendet. So kann man beispielsweise die geschützte Aminosäure in ihr Acylhalogenid überführen, das mit einer Aminosäure zu einem Dipeptid oder mit einem Polypeptid zu einem davon verschiedenen Polypeptid umgesetzt werden kann. Dann wird die Schutzgruppe von der Aminogruppe entfernt, um diese weiterer Umsetzung zugänglich zu machen.

Nachdem sich'die geschützte Aminoverbindung mit einer anderen Aminosäure oder einem Peptid oder einer ähnlichen Verbindung verbunden hat, kann man die Schutzgruppe leicht entfernen, indem man die gebildete Verbindung einer UV-Lichtquelle, zum Beispiel einer Quecksilberdampflampe ' aussetzt. Die Verbindung, aus der die Schutzgruppe entfernt werden soll, wird vor Bestrahlung in einem wäßrigen Medium oder in einem wäßrig-organischen Medium gelöst. Die Verbindung, aus der die Schutzgruppe entfernt ist, wird dann nach einer beliebigen zweckmäßigen Methode gewonnen.

209811/1823

BAD ORIGINAL

3,5-Dimethoxybenzyl-p-nitrophenylcarbonat, das erfindungsgemäß zum Schutz von Aminogruppen verwendet werden kann, läßt sich folgendermaßen herstellen: eine eiskalte Lösung aus 28,0 g (0,167 Mol). 3,5-Dimethoxybenzylalkohol und 5,90 g (0,150 Mol) Pyridin in 100 ml Aceton wird unter Rühren mit 30,4 g (0,150 Mol),p-Nitrophenylchlorformiat versetzt. Die gebildete Aufschlämmung gibt man zu 700 ml Wasser, filtriert den Peststoff ab, wäscht mehrere Male mit Wasser und kristallisiert aus 2500 ml Methanol um. Man erhält 30,7 g (6l %) 3,5-Dimethoxybenzyl-p-nitrophenylcarbonat, F. 114 bis 115°C.

Beispiel 1 N-3,5~Diniethoxybenzyloxycarbonyl-D~phenylglycin

Eine Mischung aus 3,66 g (0,024 Mol) D-Phenylglycin, 10,0 g (0,030 Mol) 3,5-Dimethoxybenzyloxy-p-nitrophenylcarbonat, 24,0 ml 2n Natriumhydroxydlösung und 48 ml Tetrahydrofuran wird 21 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Abdampfen des Tetrahydrofurans unter vermindertem Druck wird der ausgefallene Peststoff abfiltriert und mehrere Male mit wäßriger 1 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Man stellt die vereinigten Filtrate mit 1 η Salzsäure auf pH 5,8 ein und extrahiert die. erhaltene Mischung dreimal zur Entfernung von p-Nitrophenol und nicht umgesetztem 3s5-Dimethoxybenzyl-p-nitrophenylcarbonat mit Äther. Die wäßrige Phase wird dann mit Äther überschichtet und auf pH 2,0 angesäuert. Die Ätherschicht wird abgezogen und die wäßrige Schicht wird noch zweimal

209811/182 3

mit Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte werden zweimal mit Wasser und einmal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Durch Eindampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren des Rückstands aus Methanol/Wasser erhält man 6,40 g (77 %) 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl-D-phenylglycin, P. 130 bis 132,5⁰C. Das geschützte D-Phenyl· 'glycin kann nach bekannten Verfahren mit anderen Aminosäuren oder Peptiden zu Dipeptiden bzw. Polypeptiden umgesetzt werden.

In Tabelle I sind nachstehend verschiedene physikalische Konstanten weiterer geschützter Aminosäuren, die nach der vorstehenden Arbeitsweise erhältlich sind, aufgeführt. Ferner können, wie oben beschrieben wurde, das Chlorcarbonat und das Acid ebenfalls nach bekannten Verfahren zur Herstellung geschützter Aminogruppen umgesetzt werden.

209811/1823

O	20981	Aminosäure
Z	—*	Glycin
	1823
! m		DL-Methionin
1*1 α		L-Serin
	C -Carbobenzoxy
	L-lysin

Tabelle I

3,5-Diinethoxybenzyloxycarbony !derivat

Ausbeute 71.Ji; P. 97 bis 98⁰C; Neutral-Äquivalent
ber.: 269; gef.: 26*1 ·

Ausbeute 68 %; F. 86 bis 88°C; Neutral-Äquivalent
ber.: 3^3; gef.: 337

Ausbeute 55 %; P. ¹^J bis 56°C;

+ 15",0

(C 1,02)Neutral-Äquivalent ber..: 299; gef,: 296

Ausbeute 7¹I %i P. 120,5 bis 121,5°C; fpCT ^⁷ + 11,7
.(CHCl₃, C 1,02); Neutralisationsäquivalent: ber.: *J75;
gef.:

* CD I OO

Beispiel 2 N-S^-Dimethoxybenzyloxycarbonyl-D-phenylglycylglycin

Eine Lösung von 1,38 g (0,004 Mol) 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl-D-phenylglycin in 20 ml Tetrahydrofuran wurde in einem Eis-Salz-Bad gekühlt, mit 0,56 ml Triäthylamin und anschließend mit 0,52 ml Isobutylchlorformiat versetzt und 15 Minuten lang gerührt. Dann wurde eine kalte Lösung von 0,300 g (0,004 Mol) Glycin und 0,56 ml Triethylamin in 20* ml Wasser/Tetrahydrofuran (1:1) tropfenweise zugegeben, und die Mischung wurde eine Stunde in der Kälte und eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Entfernen des Tetrahydrofurans unter vermindertem Druck wurde der Rückstand mit 20 ml Wasser verdünnt und einmal mit 20 ml Äthylacetat gewaschen. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt, mit ko ml Wasser verdünnt, mit ho ml Äthylacetat überschichtet und der pH-Wert wurde mit 10 #-iger Salzsäure auf 2,5 eingestellt. Dann wurde die wäßrige Phase noch einmal mit 40 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden einmal mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene feste Rückstand wurde mit Äther aufgeschlämmt und filtriert, wodurch man 1,16 g (72 %) 3^5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl-D-phenylglycylglycin, P. 156 bis 157⁰C erhielt.

Allgemeine Arbeitsweise und Vorrichtung für die Bestrahlung

Die Entfernung der Schutzgruppe durch Bestrahlung wurde mit einer Hanau ÖS^A-Sö-Quecksilberhochdrucklampe vorge-

209811/1823

- ii -

nommen, die mit einem Filtermantel aus Vycor-Glas (Coming Nr. 7910) versehen und in einen wassergekühlten Quarztauchkolben eingeschlossen war. Die zu bestrahlende Verbindung wird in 1 1 Dioxan/Wasser (1:1) aufgelöst. Während der Umsetzung wurde Stickstoff durch die Lösung geleitet/ Die Bestrahlungsdauer betrug 1,5 Stunden. Der Reaktionsverlauf wurde ρapierchromatographisch verfolgt.

Die Verbindung, aus der die Schutzgruppe entfernt worden war, zum Beispiel ein Peptid, wurde durch Eindampfen der Lösung zur Trockne, Behandeln des Rückstand mit einer kleinen Menge Aceton und Abfiltrieren des Produkts isoliert. Im .folgenden wird die zur Entfernung der Schutzgruppe angewandte Arbeitsweise an einem Beispiel erläutert.

Eine Lösung von 1,00 g (0,002^9 Mol) 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl-D-phenylglycylglycin in 1 1 Dioxan/ Wasser (1:1) wurde 1,5 Stunden lang, bestrahlt. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde mit einer kleinen Menge Aceton behandelt. Das in dem Rückstand enthaltene D-Phenylglycylglycin kristallisierte und wurde abfiltriert und luftgetrocknet. Die Ausbeute betrug 0,335 g (65 % der Theorie), P = 226 bis 228⁰C.

209811/1823

Claims

Patentansprüche

oder

2
CH₂-O-C-R

CH,0 * -

in der R für sich allein ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis ²J Kohlenstoffatomen, R₁ für sich allein ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einen hydroxysubstituierten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einen carboxysubstituierten Alkylrest mit 1 bis k Kohlenstoffatomen, einen durch eine niedere Alkylmercaptogruppe substituierten Alkylrest mit 1 bis H Kohlenstoffatomen, einen guanidlnsubstituierten Alkylrest mit 1 bis A Kohlenstoffatomen, einen guanidln-

209811/1823

INSPSCTED

. oxysubstituierten Alkylrest mit 1 bis k Kohlenstoffatomen, eine Imidazolylmethylgruppe, eine Indolylmethylgruppe, einen Thienylrest, einen Furylrest, einen Phenyl· rest oder einen Benzylrest oder R und R zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen Piperidin- oder Pyrrolidinring und Rg einen p-Nitrophenoxyrest bedeuten.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, nämlich N-(3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl)glycin; N-(3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl)-methionin; N-(3»5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl) phenylglycin; oder N-(3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl)-serin.
3. Verfahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung von Verbindungen: mit geschlitzter Aminogruppe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung mit geschützter Aminogruppe eine Verbindung der allgemeinen Formel

0 R R¹ 0

«It H

CH₉-O-C-N-C-C-OH

in der R und R wie in Anspruch 1 definiert sind, verwendet .

209811/1823