DE1467833A1

DE1467833A1 - Verfahren zur Herstellung von Demethyltetracyclin

Info

Publication number: DE1467833A1
Application number: DE19641467833
Authority: DE
Inventors: Jarai Dr Miklos
Original assignee: Chinoin Gyogyszer es Vegyeszeti Termekek Gyara Zrt
Current assignee: Chinoin Private Co Ltd
Priority date: 1963-11-05
Filing date: 1964-11-04
Publication date: 1968-11-28
Also published as: AT264710B; DE1467833C3; DK129243B; GB1091046A; GB1091045A; DE1467833B2; DK129243C

Description

Dr. LOTTER[ICS, Dr.-Ing. LOTTERHOS _

6C00 Frankfurt a. M. Anncnircijo 19 ^i%

Ohinoin GySgyseer- &s VegySszeti Teralkek GySra HT. Budapest IV Τδ utca 1-5

Verfahren zur Herstellung von Demethy!tetracyclin

Für die Herstellung von Demethyltetraoyclinen wurden bisher zwecks P&rmentation gewisse Streptomyceo-Aureöfaciens Stämme (Bioohem.Biophis.Actä 58,635,1962) verwendet, welche einen gewiesen Anteil an Demethyltetracyclin produzieren, oder es wurde ein Streptomyoes Stamm welcher Chlortetracyclin produzierte in Gegenwart einer chemischen Verbindung fermentiert, welche die Methylierung verhindert.

Es wurde nun gefunden, dass man sehr vorteilhaft· Demethyltetracycline durch Fermentation eines Streptomyoes Stammes herstellen kann« wenn man für die Fermentation einen durch Gon-ilekombination von in der Methionin-

biosynth6se deffizienten Stämmen hergestellten prototrophen Stamm fermentiert, bzw. dessen Hereditäre, Varianten oder Mutante verwendet.

Grundlage der Erfindung ist die Erkenntnis, dass aus geeigneten biochemischen Mutanten durch Gen-Rekombination prototrophe Stämme hergestellt werden können, bei welchen die Einführung einer Methylgruppe in das Kohlenstoffatom Cg genetisch verhindert wird. Hiebei wird jedooh der Stoffwechsel des Gg (Methionin-, Glyein-Stoffwechsel, Biosynthese des Aktivformaldehyds) nicht gestört, sondern ist ähnlich wie bei den anderen Streptoayoes Stämmen. Dies kann z.B. durch Messen der ungestörten Proteinsynthese festgestellt werden,

Pur die Herstellung des neuen Stammes ist es nötig biochemische Mutanten herzustellen, deren Methylierungsaktivität geringer ist, also der C,-Stoffwechsel in irgendwelcher Phase durch einon genetischen Block gehindert ist. Es ist bekannt, dass bei gewissen raethionindeffizienten, chemischen Mutanten die Einführung d6r Methylgruppe in Stellung Cg des Tetracyklinmol6küles weniger aktiv verläuft, so dass z.B. neben 7-Chlortetr^acyö:lin auch e-Demethyl-T-Chlortetracyolin entsteht.· (Biochem. Biophis.Acta j>8, 635, 1961). Im Laufe unserer Versuche haben wir eine Anzahl biochemischer Mutante hergestellt (Acta Microbiol.Aoad.Soifcns.Hung.8,73,1961), deren De- «ethyltetracyalinproduktion untersucht wurde. Die Ergebniese haben gezeigt _t dass sich darunter mehrere befinden, welche in höherem, oder geringerem Anteil Demethylehlor-

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tetracyclin produzieren» Die Stämme H-4, N-6, H-Il, N-16 bzw. ΙΓ-18 sind der Reihenfolge nach methionindefiziente, cisteinargiaindefiziente, methionin-aminostioketoffdefiziente, methionin-asparagin-defiziente und oistein-

asparagin-defizicnte chemische Mutanten.

Es war unsere Hypothese, dass bei der Gren-Rekombination dieser biochemisoher Hutante unter Beibehaltung spezieller Bedingungen Rekombinante erhalten werden könnten, bei welchen neben der normalen Cysteinmethionin-Biosynthese die Methylisrung in der Stellung Og des Tetracyolinskelettes genetisch gehindert ist. Dieser genetische Block setzt nun voraus, dass die Methylierung in Stellung Cg des Tetracyclinsklelettes nicht durch dieselben Enzyme durchgeführt wird, die allgemein im C-, Stoffwechsel eine Rolle spielen. Da die Methylierung im allgemeinen Stoffwechsel und allgemein der C-. Stoffwechsel bei den Prototrophen unberührt bleibt, könnte man annehmen, dass bei den hergestellten Stämmen der genetische Block nicht zu der ausschliessuchen Biosynthese von Tetracyclines führt. In Stellung Cg des Tetraeycrlinmolektils kann die Methlygruppe euch durch andere konstitutionelle Enzyme eingeführt werden - wenn auch mit einer kleineren Geschwindigkeit - als durch jene, welche die Biosynthese des Tetracycclin-Skelettes bewirken.

Unsere - ganz originelle - Hypothese wurde von unseren Ergebnissen bestätigt. Unter den hergestellten prototrophen Rekömbinanten wurden solche gefunden,w6lche

in auffallend hohem Prozentsatz Demethy!tetracycline produzieren, ,

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PUr die Herstellung der prototrophen Rekombinanten und zwecks Erzielung der Gen-Rekombination wurden spezielle Bedingungen gesichert· Die Gen-Rekombination selbst als Erscheinung ist bei Streptomyceten allgemein bekannt. Bei der Ausarbeitung des Verfahrens nach der Erfindung wurde eine von uns früher beschriebene Methode weiterentwiekelt (Acta Microbiol.Acad.Soi.Hung.8, 73» 1961), wobei solche Bedingungen gesichert werden, dass die Stämme welche Demethyltetracyrlin produzieren praktisch sicher entstehen. Pur diesen Zweck werden bei der Gen-Rekombination FoI-säureantagonisten verwendet, wie z.B. Aminopterin (4-Aminopteroyl-glutaminsäure) und Ametopterin (4-Amino-10-methy 1-steroyl-glutaminsäure) vorteilhaft in einer Quantität von 5-500 gamma/ml, wobei in den Nährboden auch ^-^Lfonamide gegeben werden.

Als £"-.7.:-onamid6 können nach der Erfindung Verbindungen der Formel

^HN "~ J ~ ^s02 "" ^m " ^{R I#}

verwendet werden, wo in der Formel R ein organisohes Radikal bedeutet. Diese Verbindungen können in einer Quantität von 5-5000 gamma/ml verwendet werden. Man kann z.B. 50-5000 gamma/ml p-Amino-benzolsulfonylguanidin und/oder 5-500 gamma/ml 2-(p-Aminobenzolsulfonyl)-4-methylthiazol und/oder 10-1000 gamma/ml 2-(p-Aminobenzolsulfonyl)- ~4|6-dimethylpyrimidin und/oder 10-1000 gamma/ml 2-(p-Aminobenzolsulfonyl)-6-methoxypyridazin verwenden·

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Einer der nach der Erfindung hergestellten prototrophen Rekombinanten (der Stamm DN-2114) wurde folgendermassen hergestellt:

N - 4 (meth~) H - 6 (arg""cys~)

Gen-Rekombination (auf einem "minimalen" Nährboden von Beispiel 6 welcher 100 gamma/ml Ametopterin enthält und welchem 10" M 1-Methionin,

wurden.)

thionin, 10~ M 1-Arginin und 5x10 M 1-Cistein zugesetzt

DM - 14

(isoliert auf dem festen Nährboden von Beispiel 6)

4.
Röntgenbestrahlung der wässerigen Sporensuspension

des DM-14 Stammes (4000Or)

Verbreitung der bestrahlten Sporensuspension auf einem festen Nährboden, welcher 75 gamma/ml 2-p-Aminobenzolsulfonamido-4-methylthiazol und 50 gamma/ml Aminopterin enthält |,

CDM 2114
(Züchtung auf festem Nährboden nach Beispiel 6).

Die entstandenen prototrophen Rekombinanten wurden auf ihre Fähigkeit, Demethy!tetracyclin zu produzieren, geprüft. Es wurde festgestellt, dass bei einigen Rekombinanten neben einer hohen Gesamttetracyc.linproduktion auch ein hoher Prozent Demethylanaloge von Tetraoyclinen entstehen (Der Stamm CDM-2114 produziert 50-60 % Demethylohlortetracyiilin und 40-50 fo Chlortetracyolin sowie Spuren von Tetracyclin). Die Gesamtproduktion an Tetracyclin beträgt etwa 4000 E/ml₀

Der für die Fermentation angewendete Nährboden enthält als Quelle von Kohlenstoff Stärke, Maismehl, ale Quelle von organischem Stickstoff Corn-steep Idquor, extrahierten Sonnenblumengriess, Maismehl, Haselnussmehl, und/oder Hefenextrakte. Es können ausserdem noch Ammoniumsalze, vorteilhaft Chloride, Sulfate oder Nitrate sowie Kaliumsalse, Kalziumsalze und Magnesiurasalze vorteilhaft Kaliumchlorid, Kalciumkarbonat, Magnesiumchlorid, oder Magnesiumsulfat in den Nährboden gegeben werden. Die Fermentation wird etwa bei 25-3O⁰C zweckmässig bei 27⁰C durchgeführt. Man kann auch verfahren, indem man anfangs bei 25-26⁰C fermentiert und anschliessend die Temperatur auf 30^37⁰C hebt. Die Dauer der Fermentation beträgt 45-75, vorteilhaft 50-60 Stunden.

Die weitere Grundlage unserer Erfindung ist die Erkenntnis, dass die Biosynthese der Tetracycline bzw. der Beginn der aktiven Methylierung erst nach einem gewissen Zeitpunkt der Fermentation eintrifft. Bei den bisher bekannten Fermentationsmethoden wurden die Inhibitoren zu Beginn der Fermentation gleichzeitig zugegeben, was unter anderem auf den Proteinstoffwechsel von Nachteil war I Hieraus folgt z.B. eine verhältnismässig niedere Gesamtproduktion an Tetracyclin. (j.3acteriol.82.615,196l)·

Es ist also ferner Gegenstand der vorliegenden Erfindung Demethyltetracybline in Gegenwert von Methylierungsinhibitoren zu fermentieren, wobei der Methylierungsinhibitor allmählich in die Fermentation gegeben wirdtuw. so, dass das Verhältnis der entstandenen Protein- und Nukleinsäuren

- 6 onöq 1 η / 1 324

und des zugegebenen Inhibitors auf einem ständigen Wert gehalten wird»

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform, des Verfahrens nach der Erfindung werden die Inhibitoren der Formel

H₂N - / N-SO₂-NH-R I.

(wo die Bedeutung von R ein organisches Radikal ist) in den ersten 24 Stunden der Fermentation dreistundenweise dosiert, so dass das Verhältnis der Quantitäten von entstandenen Protein- und Nukleinsäuren und der zugegebenen Inhibitoren unverändert bleiben soll·

Als Sulfonamide der Formel I kann p-Amino-benzol-Bulphonylguanidin 400-4000 gamma/ml, und/oder 50-500 g na/ml 2· > ρ Arninobenzolsulfonyl)-4-methylthiazol und/oder 100-1000 gamma/ml 2-p-Aminobenzolsulphonyl-4>6~ -dimethylpyrimidin und/oder loo-lOOO gamma/ml 2-(p-Aminobenzol-sulphonyl)-6-methoxy-pyridazin verwendet werden·

Wir haben bei den angewandten Stämmen die Biosynthese-Geschwindigkeit des Proteins und der Nukleinsäuren bei Fermentationen bestimmt, wo keine Inhibitoren verwendet wurden. Unter den Fermentationsbedingungen des Beispiels 1 wurden folgende Ergebnisse erhalten:

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Stunde: 5 6 9 12 15 18 24

NS: 110 270 420 870 1190 1700 2420

NSt 10 20 40 . 70 110 230 380

Insges: 470 1260 2380 4820 7510 10370 15340

(Die Daten wurden in gamma/ml berechnet auf das Volumen des Nährbodens angegeb&n).

Auf Grund der oben angegebenen Tabelle wird p-Aminobenzolsulfonylguanidin in das Fermentationsmedium in der 3»6,9»12,15,18,24 Stunde in solcher Quantität zugesetzt, dass die zugegebene Quantität - berechnet auf das Volumen des Nährbodens - 50, 75, 125, 250, 250, 2Γ0_? b"zw, JOO, insgesamt 1500 gamma/ral beträgt, Dies bedeutet, dass die Quantität der Protein-Ribonukleinsäure-Desoxyribonukleinsäure und die Quantität des verwendeten Methylierungsinhibitors im Laufe der Fermentation im stabilen Verhältnis 10:1 sind.

Die angegebenen Quantitäten können auch geändert werden. Die kontinuierliche Zusetzung der Inhibitoren sichert eine bedeutend höhere Gesamtproduktion an Tetracyclin und einen höheren Anteil der Demethylanalogen.

Die Isolierung der Demethyltetracycline aus dem Fermentationsmedium kann mit an sich bekannten Methoden geschehen.

Mit dem neuen Streptomycee Aureofaciens CDM-2114 Stamm, welcher nach unserer Erfindung hergestellt wurde, und welcher unter der Nr.631 008/25 im Staatlichen Institut fürHygienie (Budapest) deponiert wurde, sowie mit Hereditären dieses Stammes konnten z.B. bei 4000 gamma/ml

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Gesamtproduktion etwa 80 $> 6-Deme thy ltetracyclin-Analoge erhalten werden. Dieser Anteil ist bedeutend höher als im Falle von vorbekannten Streptomyces-aureofaciens Stämmen.

Weitere Einzelheiten des Verfahrens sind in den Beispielen zu finden, es S6i jedoch bemerkt, dass sich der Kreis der Erfindung nicht auf die Beispiele beschränkt.

Beispiel 1;

In einem 500 ml Erlenmeyer-KoIben wird ein IOC ml Inocuium-Nfehrboden (stärke 2,0 ^, Cornsteep Liquor trocken 2»0 $>i CaCO, 0,4 $>, Palmehöl 0,2 #, pH - 6,8) steril mit 2 ml einer wässerigen Sporensuspension (lO /ml Sporen) des Streptomyces Aureofaciens Stammes B-28 beimpft. Hierauf wird auf einem Schütteltisch (200 υ/ΪΏ-η) bei 27⁰C 40 Stungen geschüttelt. Hierauf wird 80 ml eines Fermenta tionsnährbodens (Stärke 3,5 ^, Gornsteep Liquor 0,6 ^, extrahierter Sonnenblumengriess 0,7 %> NH.NO, 0,6 5^, KUO₅ 0,2 #, KCl 0,2 <?o, CaCO, 0,6 f°> Paliaenöl 0,5 9^) in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 2 ml des Impfstoffes beimpft. Der pH-Wert beträgt steril 6,2. Hierauf wird bei 27°C 72 Stunden geschüttelt. In der 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24. Stunde der Fermentation wird aus einer Stammlösung, von p-Aminobenzol8ulfοguanidin steril so viel in die Fermentation gegeben, dr.ss in den entsprechenden Zeitpunkten die Konzentration des Methylierungsinhibitors berechnet aus d6m Volumen des Nährmedium 50, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 gamma/ml beträgt, also das Verhältnis der

Protein-Nukleinsäuren zu der Quantität des Inhibitors dem stabilen Wert von 10:1 entspricht* Zum Schluss dor Fermentation enthält das Fermentationsmedium 670 gamma/ml Demethylchlortetracyclin, 1240 gamma/ml Chlor tetracyclin und 100 gamma/ml Tetracyclin.

Beispiel 2:

6 1 eines Fermentationsnährmediumewerden in einem 12 1 Grlasfermentor mit 300 ml des nach Beispiel 1 hergestellten Impfstoffes beimpft» Zusammensetzung des Nährbodens: Stärke 2,0 r>, Maismehl 4,0 #, Cornsteep Liquor 1_#2 # (trocken), extrahierter Sonn&nblumengriess 0,8 #, NH₄NO₅ 0,8 % INO₅ 0,3 #_f KGl 0,2 $S, CaCO₅ 0,8 #, Palmenöl 0,5 $-, pH · = 6,2.

Es wird bei 27⁰C und Umrühren (640 U/Min) 60 Stunden fermentiert, und gelüftet (6 l/Min.) In der 3, 6, 9> 12, 15, 18, 24· Stunde der Fermentation wird 2-(p-Aminobenzolsülphonyl)-4-mö4yhl-thiazol in die Fermentation gegeben uzw. in einer Quantität, dass dia Menge des Inhibitors berechnet auf das Volumen des Fermentationsmediums in den entsprechenden Zeitpunkten 6, 13, 30, 55, 80, 110, 165 gamma/ml beträgt. Dies bedeutet, dass das Verhältnis der Protein-Nukleinsr.urequantitr.t und der InhibitorquantitHt ständig 100:1 entspricht.

Am Ende der Fermentation enthält das Fermentationsmedium 950 gamma/ml Demethylchlortetracyclin, 17IO gamma/ml Chlortetracyclin und etwa 200 gamma/ml Tetracyclin.

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οπΓίπιη / 1 *3 O I.

Beispiel 3:

80 ml eines synthetischen Permentationsnährbodens

(Stärke 4,5 %, NH₄NO₃ 0,8 #, KNO₃ 0,2 #, MgSO₄ 0,1 #, KH₂PO₄ 0,05 96, CaCO₃ 0,6 ^, MnSO₄ 0,003 £, ZnSO₄ 0,01 5&, PeSOi 0,001 #> Glutaminsäure 0,1 £, Palmenöl 0,3 ^, ionfreies Wasser, pH = 6,2) wird mit 2 ml des nach Beispiel 1 hergestellten Impfstoffes beimpft. Es wird wie in Beispiel 1 fermentiert, wobei in der 3,6, ,12,15,18,24·. Stunde der Fermentation 2-(p-s-Aminc-benzolsulfonyl)-4»6- -dimethylpyrimidin in einer solchen Quantität zugesetzt wird, dass die Menge des Inhibitors in dem entsprechenden Zeitpunkt 15, 25, 50, 100, 150, 200, 270 gamma/ml baträgt. berechnet auf das Fermentationsmedium. Dies bedeutet, dass das Verhältnis der Quantität von Protein-Nuklein-Sf.-ren zu der Quantität des Inhibitors stabil 50:1 entspricht·

Die Fermentation wird 72 Stunden fortgesetzt. Es werden 310 gamma/ml Domethyltetracyolin, 670 gamma/ml Tetracyclin und etwa 50 gamma/ml Chlortetracyclin produziert.

Beispiel 4:

6 Liter eines Nährbodens nach Beispiel 2 wer ilen mit 300 ml eines Impfstoffes aus dem Streptomyoes Aureofaciens CDSD 314 Stamm nach Beispiel 1 hergestellt, beimpft, worauf wie in Beispiel 2 beschrieben die Fermentation durchgeführt wird. In der 3,6,9,12,15,18,24. Stunde der Fermentation wird in das Fermentationsmedium 2-(p-

-Amino-benzoisulfonyl)~f-methoxy-pyridazin gegeben, uzw. 809810/1324 - 11 -

in einer Quantität, dass in den betreffenden Zeitpunkten die Menge des Inhibitors 12,' "25, 60, 120, 180, 250, 350 gamma/ml beträgt, berechnet auf das Volumen des Nährbodens* Dies bedeutet ein stabiles Verhältnis von 50:1. Die Fermentation wird 60 Stunden fortgesetzt, wobei 1150 gamma/ml Demethyltetracyclin und 2520 gamma/ml Tetracyclin fermentiert werden. Dem synthetischen Nährboden von Beispiel 3 werden 0,6 ^ KBr zugesetzt, worauf mit 2 ml des nach Beispiel 1 hergestellten Impfstoffes beimpft wird. Die Ferm". tation wird wie in Beispiel 3 beschrieben, bei Zusetzung desselben Inhibitors fortgeführt. Es werden 290 gamma/ml Demethylbromtetracyclin und 250 gamma/ml Bromtetracyclin hergestellt.

Beispiel 6;

Es wird ein "minimaler" fester Nährboden hergey fre¹*!. t -

7 ft — f\

welchem 10 M 1-Methionin, 10 M 1-Arginin lind ρχΙΟ Μ 1-Cistein, sowie 100 gamma/ml Amt topterin zugesetzt werden» Dieser Nährboden wird auf 2-2 ml (2x10^ Sporen in destilliertem Wasser) einer Sporensuspension geimpft, welche aus einer auf festem Näiirboden erhaltenen Zucht von N-4 Methi onin-, sowie N-6 arginin-cistein-deficienten biochemischen Mutanten erhalten wurde. Nach einer 14 tägigen Incubation bei 27⁰C werden die erhaltenen prototrophen Recombinanten auf einen festen Nährboden geimpft, welcher ebenfalls 150 gamma/ml Ametopterin und 500 gamma/ml p-Amino-benzo1-

eulfonyl-guanidin enthält· Die Zusammensetzung des "minimalen" festen Nährbodens ist die 'olgende: Saccharose 15,0 g, Ca(N0₃)₂ 3,5 g_r K₂HPO₄ 1,0 g, MgSO₄^H₂O 0,5 g,

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NaCl 1,0 g, PeSO₄^H₂O 0,05 g, destilliertes Wasser 1000 ml-Agar 20,0 g, pH =6,8. Zusammensetzung des festen Nährbodens: Saccharose 15,0 g, Ca(N0₃)₂ 3,0 g, (NH^)₂HPO₄ 1,0 g, K₂HPO₄ 1,0 g, MgSO₄.7H₂O 0,5 g, NaCl 1,0 g, PeSQ₄.7H₂O 0,05 g, 1,0 g 1-Asparagih, destilliertes Y/asser 1000 ml, Agar 20,0 g* pH = 6,8.

Nach einer Inkubation von 16-20 Tagen wurde mit den Fermentationsmethoden der Beispiele 11-16 die Poröuktion der hergestellten Rekorabinanten ermittelt. Es wurde z.B. festgestellt, dass die Rekombinante DM-14 45 f» "Demethyltetracyclin produziert,

Beispiel 1%

Es wird ein "minimaler" fester Nährboden hergestellt welchem 5xlO"⁷ M !-Methionin, 10"⁴ NH₄Cl, 10~⁷ M 1-Cistein, 5xlO~ M 1-Asparagin, sowie 100 gamma/ml Aminopterin zugesetzt werden· Dieser Nährboden wird auf 1-1 gamma/ml Proben (lO Sporen in destilliertem Wasser) einer Sporensuspension geimpft, welohe aus einer auf festem Nährboden erhaltenen Zucht von N--11 m'ethionin-aminostickstoff-, sowie N-18 oistein-asparagin-defizienten biochemischen Mutanten erhalten wurden. Nach einer 14-tägigen Inkubation bei den Bedingungen von Beispiel 6, wird auf den Nährboden von Beispiel 6 umgeimpft, welcher ebenfalls 150 gamma/ml Aminopterin, sowie 50 gamma/ml 2-Cp-Aminobenzol-sulfonyl)- -4-methyl-thiazol enthält.

Nach 16-20 tägiger Inkubation wurde die Demethylchloi tetracyclin-Produktion des Rekombinnnten DM-4I als 40-45 $ gefunden.

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Beispiel 8;

Eb wird ein minimaler fester Nährboden hergestellt, welchem 10~⁶ M 1-Hethionin, 10"⁷ M 1-Asparagin, 10~⁸ Μ 1-Arginin und 5x10 M 1-Cistein, sowie 100 gamma/ml Aminoptsrin und 150 gamma/ml 2-(p-Aminobenzol-sulfonyl)~ -4,6-dimethylpyrimidin zugesetzt werden. Dieser Nähboden wird auf 1-1 ml Proben (lO Sporen in destilliertem Wasser) einer Sporonsuspension geimpft, welche aus einer auf festem Nährboden erhaltenen Zucht N-16 "Xethionyn-üsparagin-, sowie N-6 iirginin-cistein-defizienter biochemischer Mutanteierhalten wurden. Nach einer 11-tägigen Inkubation werden die erhaltenen prototrophen Rekombinanten auf den festen Nährboden von Beispiel 6 umgeimpft, welcher 150 gamma/ml Ametopterin und 100 gamrea/ml 2-(-Aminobenzolsulfonyl)-6- -methoxy-pyridasin enthält.

Nach einer Inkubation von 16-20 Tagen wurde festgestellt, dass z.B. die Rekombinante DM-I6 30 $ Demethylohlortetracyclin produziert.

Beispiel 9:

Eine Sporensuspension des Stammes DM-16 in destilliertem Wasser ClO /ml Sporen) wird in an sich bekannter

T/eise einer UV Bestrahlung von 3500 erg/mm unterworfen. Die überlebenden Sporen werden wie in Beispiel 6 beschrieben auf einem festen Nährboden, welcher 500 gamma/ml p-Aminobenzolsulfonylguanidin und 50 gamma/ml Ametopterin enthält, gezüchtet. Bei mehreren Hereditären wurde eine erhöhte Demethylchlortetracyclin-Produktion beobachtet,

z.B. 40 io bei dem Stamm BDM-2816. _

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Beispiel 10:

in Eine Sporensuspension des Stammes DM-14/destilliertsm

Wasser (10^/x&l Sporen) wird in nn sich bekannter Weise mit einer 40.000 r Dose von Röntgenstrahlen bestrahlt. Die überlebenden Sporen werden, wie in Beispiel 6 auf einem festen Nährboden gezüchtet, weloher 75 gamma/ml 2-(p-Aminobenzol-3ulfonyl)-4-mtthyl-thiazol und 50 gamma/ml Aminopterin enthält. Hehrere Hereditäre weißen eine erhöhte Demethylchlortetracyolin-Produktion auf, z.B. beträgt dieser Anteil bei dem Stamm CM-2114 etwa 35 $>·

Beispiel 11;

2 ml einer wässerigen Sporensuspension des Streptomyces Aureofaciens Stammes CDM-2114 ClO'/ml Sporen) werden in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu 100 ml eines Inokulum na'L jodens folgender Zusammensetzung geimpft: Stärke 2,0 ^, Cornsteep Liquor 2,0 $> (Trockengehalt), CaCO, 0,4 ^, Palmöl 0,2 <fo. Der pH-Wert beträgt nach erfolgter Steriliserung 6,8. Hierauf wird auf einem Schütteltisch mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 200/fain bei 27⁰C 40 Stunden lang gezüchtet. Mit 2 ml Impfstoff werden in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben 80 ml eines Permentationsnährbodens folgender Zusammensetzung beimpft: Stärke 3,5 $, Cornsteep Liquor 0,6 i> (Trockensubstanz), extrahierter Sonnenblumengriess 0,7 #, NH₄NO₃ 0,6 #, KHO₃ 0,2 $, KCl 0,2 #, CaCO, 0,6 $, Palmenöl 0,5 $>. Der pH-Wert beträgt steril 6,2. Hierauf wird bei 24⁰C 72 Stunden geschüttelt. Das erhaltene Permentationsmedium enthält 1310 garama/ml Demethylohlortetracyclin 730-gamma/ml Chlortetracyclin und 180 gamma/ml Tetracyclin.

Beispiel 12^;

Mit 300 ml des nach Beispiel 11 hergestellten Impfstoffes werden in einem 12 1 G-lasfermentor 6 1 eines Nährbodens folgender Zusammensetzung beimpft: Stärke 2,8 ^, Maismehl 4,0 £, Cornsteep-Liquor 1,2 #, extrahierter Sonnenblumengriess 0,8 f,_t UH₄NO₃ 0,8 $>, KNO₃ 0,3 ^, KCl 0,2 $₉ CaCO, 0,8 #, Pr.lmenöl 0,5 5*; pH steril 6,2. Hierauf wird bei 27⁰C, 640 U/Min und 6 l/Min Lüftung 60 Stunden lang fermentiert. Es werden 90 gamma/ml Demethy!chlortetraoyelin I77O gamma/ml ChIortetracyelin und etwa 250 gamma/ml Tetracyclin produziert.

Beispiel 13:

300 ml des nach Beispiel 11 hergestellten Impfstoffes werden auf den 6 Liter Nährboden von Beispiel 12 geimpft. Hierauf wird in der 3,6,9,12,15,18 bzw. 24. Stunde der Fermentation steril je 50, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500' gamma/ml, insgesamt also 9,8 g p-Aminobenzolsulfonylguanidin zugesetzt. Die Fermentationsbedinungen entsprechen denen von Beispiel 12. Nach 60 Stunden werden 2810 gamma/ml Demethylchlortetracycün, 740 gamma/ml Chlortetracyclin und 100 gamma/ml Tetracyclin hergestellt.

Beispiel 14:

300 ml des nach Beispiel 11 hergestellten Impfstoffes werden auf 6 Liter dea Nährbodens von Beispiel 12 geimpft. Hierauf wird in der 3,6,9,12,15,18,bzw. 24. Stunde der Fermentation steril 6, 13, 30, 55, 80, 110, 165 gamma/ml also insgesamt 990 mg 2-(p-Amino-benzo!sulfonyl)-4-methy1-thiazol zugesetzt. Die Fermentationsbedingungen entsprechen

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d6n6n von Beispiel 12. Nach 60 Stunden werden 210 gamma/ml Demethylchlortetracyelin, 680 ganma/ml Chlortetracyelin und etwa 100 ganma/ml Tetracyclin produziert ι

Beispiel 15t

6 Liter eines synthetischen Nährbodens folgender Zusammensetzung werden mit 30C ml eines nach Beispiel 11 hergestellten Impfstoffes "beimpft: Stärke 4,5 #, NH₄NO₅ 0,8 £_f KNO₃ 0,34 ft MgSO₄ 0,1 4, KH₂PO₄ 0,05 $_f CaCO₃ 0,6 £, MnSO. 0,003 $t ZnSO. 0,01 #, PeSO₄ 0,001 #, Glutaminsäure 0,1 ^, Palmenöl 0,3 $». Der Nährboden wird mit einem ionfreien Wasser hergestellt. Der pH-Wert beträgt steril 6,2. Es wird bei 27°C unter Umrühren (600 U/Min) und Lüftung (6 l/Min) fermentiert. In der 3,6,9,12,15,18, bzw. 24. Stunde der Fermentation wird auf die Periaentflüssigkeit berechnet 25, 50, 120, 240, 360, 500, 700 gamma/ml, also insgesamt 4,2 g p-Amino-sulfanylguanidin zugegeben. Nach

einer Fermentation von 60 Stunden wird 1210 gamma/ml Demethyltetracyolin, 350 gamma/ml Tetracyclin und etwa IOC gamma/ml Demethylchlortetracyolin hergestellt.

Beispiel 16:

6 Liter eines synthetischen Nährbodens welcher nach Beispiel 12 hergestellt wurde und welchem 0,6 $ KBr zugesetzt wurden, werden mit 3oo ml eines nach Beispiel 11 hergestellten Impfstoffes beimpft. Unter den Bedingungen vonBeispiel 7 wird 60 Stunden lang fermentiert. Es werden 980 gamma/ml Demethyltetracyclin und 490 gamma/ml Bromtetracyclin produziert·

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Claims

PATENTANSPRÜCHE:

Ii Verfahren zur Herstellung von Demethyltetracyclinen durch aerobe, submerse Fermentation von Streptomyceten in Gegenwart von Methylierungsinhibitoren, dadurch g e kennzeichnet, dass für die !Fermentation an prototropher Stamm, hergestellt durch Genrekombination in Gegenwart eines Polsäureantagonisten aus in der Methioninbiosynthese defizient6n Stämmen, bzw. Hereditäre, Varianten oder Mutant β dieses Stammes verwendet wird und/oder der Methylierungsinhibitor portionenweise in das Fermentationsmedium gegeben wird, so dass die Quantität der entstandenen Proteine und Nukleinsäuren mit der Quantität des zugesetzten Inhibitors einem praktisch unveränderten Verhältnis entspricht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekannzeichnet, dass als folsäureantagonistische Faktoren Aminopterin und/oder Ametopterin verwendet wird, zweckraässig in einer Quantität von 5-500 gamma/ml.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass als weiterer folsäureantagonistischer Faktor sowie als Hethylierungsinhibitor Verbindungen der allgemeinen Formel

^H2^N ~ \\ ,7 " ^S02 " ^NHR

(wo die Bedeutung von R ein organisch-chemisches Radikal ist) zweckmässig in einer Quantität von 5-5000 gamma/ml verwendet werden. -,„

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4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Sulfonamidverbindungen p-Amino-benzo1-Bulfonyl-guanidin und/oder 2-(p-Amino-benzolsulfonyl)-4- -thiazol und/oder 10-1000 gamme/ml 2-^5-Amino-benzolsü.lfonyl)- -4,6-dimethylpyrimidin und/oder 2-(p-Amino-benzolsulfonyl)- -6-methoxypyridazin verwendet werden.
5. Verfahren naoh Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation mit dem Streptomyces Aureofaciens Stamm CDM-2114 oder mit dessen Hereditären, Varianten oder Mutanten durchgeführt wird;
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation in Gegenwart der dort angeführten Verbindungen in einer Quantität von je 400-4000, 100-1000 bzw. 100-1000 gamma/ml durchgeführt wird.
7. Verfahren zur Herstellung von Demethylchlortetracyclin oder Demethylbromtetraoyclin nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm CDM-2114 in Gegenwart von mehr als 50 gamma/ml Chlorid oder Bromid-Ionen fermentiert wird.
8. Verfahren naoh Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass für die Herstellung von Demethyltetraoyclin der Stamm CDM-2114 auf einem Nährboden fermentiert wird, welcher weniger als 50 gnmma/ml Halogen enthalt, oder dass die Fermentation in Gegenwart von Chlorierungsinhibitoren durchgeführt wird.

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