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Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin mit Hilfe von Tetracyclin und Chlortetracyclin erzeugenden Stämmen von Streptomyces aureofaciens.
Chlortetracyclin und Tetracyclin können bekanntlich von dem gleichen Streptomyces aureofaciensOrganismus je nach den Fermentdtionsbedingungen erzeugt werden. So wird insbesondere dann Chlorte- tracyclin als das vorherrschende Antibiotikum erzeugt, wenn das Nährmedium reichlich verfügbare Chlorionen enthält. Gemäss einem älteren Verfahren wird Tetracyclin als vorherrschendes Antibiotikum gebildet, wenn man ein Medium mit einem gesteuerten und begrenzten Chloridgehalt verwendet. Dieses Verfahren zur Tetracyclingewinnung hat sich trotz der erhöhten Herstellungskosten, die sich aus der sorg- fältigen Auswahl und der Vorbehandlung der Bestandteile des Fermentationsmediums zur Entfernung der Chlorionen aus demselben ergeben, als in hervorragender Weise erfolgreich und technisch anwendbar erwiesen.
Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Erhöhung der Tetracyclinausbeute bei verminderter Chlortetracyclinbildung, ohne dass dabei die erhöhten Kosten für die Entfernung der Chloride aus den Fermentationsmedien anfallen.
Das erfinduhgsgemässe Verfahren besteht in der Züchtung von Tetracyclin und Chlortetracyclin erzeugenden Stämmen von Streptomyces aureofaciens in Fermentationsmedien, die mehr als 50 Teile/ Million Chlorionen und von 10 bis 500, vorzugsweise von 10 bis 350 Teile/Million Bromionen enthalten, wodurch das Verhältnis von Tetracyclin zu Chlortetracyclin im Gemisch der gebildeten Antibiotika erhöht wird. Diese Konzentrationen sind in Gewicht/Gewicht angegeben ; das gleiche gilt für alle folgenden Konzentrationen, wenn nichts anderes angegeben ist.
Falls das Medium praktisch chloridfrei ist oder nur eine sehr geringe Konzentration an Chloriden, beispielsweise weniger als 50 Teile/Million, enthält, dann ist keine oder nur eine unwesentliche inhibierende Wirkung auf die Chlortetracyclinerzeugung vorhanden und andere Erscheinungen, z. B. eine Steigerung der Bromtetracyclinerzeugung, treten dann in den Vordergrund.
Bromion kann den Fermentati0nsmedjen auf beliebige Weise zugesetzt werden, vorzugsweise wird es als Alkali-, Erdalkalimetall- oder Ammoniumbromid zugegeben, beispielsweise als Kaliumbromid, Natriumbromid, CalciumDromid, Magnesiumbromid usw.
Die zuzugebende Bromidmenge hängt in einigem Ausmasse von den Eigenschaften des verwendeten besonderen Stammes oder Mutanten von Streptomyces aureofaciens, sowie von der Chlorionenkonzentration im Fermentationsmedium und schliesslich von der Art und den Eigenschaften der andern Bestandteile des Fermentationsmediums ab.
Die gewünschte lenkende Wirkung wurde bei allen untersuchten Stämmen und Mutanten von Streptomyces aureofaciens beobachtet und ist offensichtlich nicht auf irgendeinen besonderen Stamm oder Mutanten begrenzt, jedoch individuell verschieden, wobei insbesondere zwei verschiedene Gattungen des Streptomyces aureofaciens, u. zw. die chloridverwertenden bzw. nichtverwertenden Stämme oder Mutanten zu beobachten sind. Die erstgenannten haben die Eigenschaft, verfügbare Chlorionen des Nährmediums in hohem Masse zu verwerten, selbst dann, wenn sie nur in niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, die andern dagegen nicht oder nur in geringem Ausmass. Es wurde gefunden, dass die lenkende Wirkung bei dem chloridnichtverwertenden Typ ebenfalls noch deutlich vorhanden ist.
Das jeweilige zur Verwendung gelangende Nährmedium beeinflusst in einigem Ausmasse den Grad der beabsichtigten Selektivität des Verfahrens, ändert jedoch den Grundcharakter dieser Wirkungswei-
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se nicht wesentlich ; ein bevorzugtes Fermentationsmedium besteht aus 1 - 3 % Maisquellwasser (Penicillinqualität, 50 % Feststoffe), 2-5 % Saccharose, 0, 1 - 0, 6 % Ammoniumsulfat und 0, 2 - 0, 70/0 Calciumcarbonat, dem noch als Spurenelemente ausreichende Mengen von Salze,} des Mangans, Kupfers und Zinks in Form der Chloride, Sulfate, Nitrate usw. zugesetzt werden können.
Selbstverständlich können in diesem Nährmedium einzelne Bestandteile durch andere gleichwertige ersetzt werden oder es kann das in der USA-Patentschrift Nr.2.482.055 beschriebene und im folgenden als "N - Medium" bezeichnete Produkt Verwendung finden. Diesem Medium wird Bromid je nach Erfordernis in den angegebenen Mengen zugesetzt.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. In diesen Beispielen wird mit dem Ausdruck"chloridreiches"Medium ein Nährmedium bezeichnet, das mehr Chlorionen enthält als der verwendete Stamm zur Bildung der normalen Menge an Chlortetracyclin benötigt, wohingegen mit dem Ausdruck"chloridarmes"Medium ein solches bezeichnet, wird, das weniger Chlorionen enthält, als zur vollständigen Ausnützung der Fähigkeit des verwendeten Stammes, Chlortetracyclin zu bilden, erforderlich ist.
Zur näheren Erläuterung dieser Definition und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Anwesenheit von ein Teil1illion Chlorionen die Bildung von etwa 14 y Chlortetracyclin je cm3 ermöglicht, wenn ein spezieller Stamm die Fähigkeit besitzt, 2800 y Chlortetracyclin je cm3 zu erzeugen, wird ein Gehalt von mehr als 200 Teile/Million Chlorionen als chloridreich und weniger als 200 Teile/Million bis herab zu 50 Teile/Million als chloridarm bezeichnet.
Beispiel1 :ImfolgendenwirddieWirkungvonKaliumbromidaufdieBildungvonChlortetracyclin und Tetracyclin durch Streptomyces aureofaciens Stamm A-377. NNRL-2209 im N-Medium wiedergegeben, das 2 % Maisquellwasser (Penicillinqualität, 50 % Feststoffe), 3 % Saccharose, 0, 7 % Calciumcarbonat und 0, 20/0 Ammoniumsulfat enthält und durch Auswahl von Salzen der oben genannten Spurenelemente auf einen Chlorionengehalt von etwa 100 Teile/Million eingestellt wurde.
EMI2.1
<tb>
<tb>
KBr <SEP> Br <SEP> CTC <SEP> TC
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 375 <SEP> 0
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 328 <SEP> 47
<tb> 300 <SEP> 200 <SEP> 248 <SEP> 127
<tb> 500 <SEP> 333 <SEP> 210 <SEP> 165
<tb> KBr <SEP> Br <SEP> CTC <SEP> TC
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 182 <SEP> 0
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 148 <SEP> 34
<tb> 300 <SEP> 200 <SEP> 115 <SEP> 67
<tb> 500 <SEP> 333 <SEP> 95 <SEP> 87
<tb>
Kaliumbromid und Br sind in Einheiten von Teilen/Million (T/M) angegeben und die Ausbeuten an Chlortetracyclin (CTC) und Tetracyclin (TC) in y cm3.
Beispiel 2 : Im folgenden wird die Wirkung von Kaliumbromid auf die Bildung von Chlortetracyclin und Tetracyclin durch Streptomyces aureofaciens Stamm S580, einem chloridnichtverwertenden Stamm in einem chloridreichen Medium wiedergegeben, das 25 g/l Maisquellwasser, 50 g/ Maisstärke, 7 g/l Calciumcarbonat, 1,5 g/l Ammoniumchlorid, 50 mg/l Mangansulfat, 5 g/l Ammoniumsulfat und etwa 1000 T/M Chlorid enthält.
EMI2.2
<tb>
<tb>
Chemische <SEP> Bestimmung
<tb> KBr <SEP> Br <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 2230 <SEP> 900 <SEP> 3130
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 440 <SEP> 3050 <SEP> 3490
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 410 <SEP> 3110 <SEP> 3520
<tb>
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CTC wurde durch Fluoreszenzmessung bestimmt.
EMI3.1
<tb>
<tb>
Biologische <SEP> Bestimmung <SEP> (E. <SEP> Coli) <SEP>
<tb> KBr <SEP> Br-CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 2430 <SEP> 910 <SEP> 3140
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 440 <SEP> 2940 <SEP> 3380
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 410 <SEP> 2210 <SEP> 2620
<tb>
Beispiel 3 : Im folgenden wird die Wirkung von Kaliumbromid auf die Bildung von Chlortetra- cyclin und Tetracyclin durch Streptomyces aureofaciens Stamm S 580 in einem auf 90 TeileAlillion Chlorid beschränkten Medium (N-Medium ohne absichtlich zugesetzte Chloride mit unbehandeltem Maisquellwasser) wiedergegeben.
EMI3.2
<tb>
<tb>
Chemische <SEP> Bestimmung
<tb> KBr <SEP> Br <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 645 <SEP> 3620 <SEP> 4270
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 160 <SEP> 3810 <SEP> 3970
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 180 <SEP> 3840 <SEP> 4020
<tb>
CTC wurde durch Fluoreszenzmessung mit einem Photomultiplier bestimmt. Ein "Photomultiplier" ist ein Gerät, das auf sichtbare und nicht sichtbare Lichtstrahlen anspricht und die Lichtenergie in elektrische Energie umwandelt, deren Intensität in einfacher Weise gemessen werden kann.
EMI3.3
<tb>
<tb>
Biologische <SEP> Bestimmung
<tb> KBr <SEP> Br <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 570 <SEP> 3180 <SEP> 3650
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 210 <SEP> 3320 <SEP> 3530
<tb> 250. <SEP> 167 <SEP> 160 <SEP> 3260 <SEP> 3420
<tb>
Beispiel 4 : Im folgenden wird die Wirkung von Kaliumbromid auf die Bildung von Chlortetracyclin und Tetracyclin durch Streptomyces aureofaciens Stamm S-77, einem chloridverwertenden Typ, in einem 1000 T/M enthaltenden chloridreichen N-Medium wiedergegeben.
EMI3.4
<tb>
<tb>
Chemische <SEP> Bestimmung <SEP>
<tb> KBr <SEP> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 5180 <SEP> 500 <SEP> 5680
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 4700 <SEP> 850 <SEP> 5550
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 4800 <SEP> 860 <SEP> 5600
<tb> 300 <SEP> 200 <SEP> 4450 <SEP> 1000 <SEP> 5450
<tb>
CTC wurde durch Fluoreszenzmessung bestimmt.
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EMI4.1
<tb>
<tb> KBr <SEP> Er- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 5400 <SEP> 490 <SEP> 5890
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 5100 <SEP> 680 <SEP> 5780
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 5200 <SEP> 840 <SEP> 6040
<tb>
Beispiel 5 :
Im folgenden wird die Wirkung von bestimmten Mengen Kaliumbromid auf die Bildung von Chlortetracyclin und Tetracyclin durch Streptomyces aureofaciens Stamm S-77 in einem chlo-
EMI4.2
wiedergegeben.
EMI4.3
<tb>
<tb> KBr <SEP> Br <SEP> - <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 5100 <SEP> 470 <SEP> 5570
<tb> 50 <SEP> 33 <SEP> 5100 <SEP> 525 <SEP> 5630
<tb> 100 <SEP> 67 <SEP> 4800 <SEP> 545 <SEP> 5350
<tb> 150 <SEP> 100 <SEP> 4650 <SEP> 580 <SEP> 5230
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 4750 <SEP> 650 <SEP> 5400
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 4350 <SEP> 610 <SEP> 4960
<tb> 300 <SEP> 200 <SEP> 4400 <SEP> 625 <SEP> 5130
<tb> 350 <SEP> 233 <SEP> 4450 <SEP> 680 <SEP> 5130
<tb> 400 <SEP> 267 <SEP> 4100 <SEP> 680 <SEP> 4780
<tb> 500 <SEP> 333 <SEP> 4350 <SEP> 820 <SEP> 5170
<tb>
CTC wurde durch Fluoreszenzmessung mit einem Photomultiplier bestimmt.
Beispiel 6 : Die Wirkung bestimmter Mengen Kaliumbromid auf die Chlortetracyclin-TetracyclinErzeugung von Streptomyces aureofaciens Stamm S-77 in einem chloridarmen Medium, das durch Einführung anderer Anionen (besonders von Sulfaten) an Stelle der im N-Medium verwendeten Chloride und unter Verwendung von ausgesuchtem Maisquellwasser erhalten wurde, wodurch etwa 90 T/M Chlorid vorliegen, wird im folgenden wiedergegeben.
EMI4.4
<tb>
<tb>
KBr <SEP> Br <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> 0 <SEP> 645 <SEP> 3620 <SEP> 4270
<tb> 50 <SEP> 33 <SEP> 245 <SEP> 3890 <SEP> 4140
<tb> 100 <SEP> 67 <SEP> 210 <SEP> 3950 <SEP> 4160
<tb> 150 <SEP> 100 <SEP> 210 <SEP> 3920 <SEP> 4130
<tb> 200 <SEP> 133 <SEP> 166 <SEP> 3810 <SEP> 3970
<tb> 250 <SEP> 167 <SEP> 180 <SEP> 3840 <SEP> 4020
<tb> 300 <SEP> 200 <SEP> 160 <SEP> 3630 <SEP> 3790
<tb> 350 <SEP> 233 <SEP> 90 <SEP> 3670 <SEP> 3760
<tb> 400 <SEP> 267 <SEP> 130 <SEP> 3810 <SEP> 3940
<tb> 500 <SEP> 333 <SEP> 165 <SEP> 3770 <SEP> 3940
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CTC wurde durch Fluoreszenzmessung mit einem Photomultiplier bestimmt.
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Beispiel 7 : Bei einer Tieftankfermentat10ll wurden unter Verwendung von N-Medium, das 20 Teile Maisquellwasser, 30 Teile Saccharose, 7 Teile Calciumcarbonat und 2 Teile Ammoniumsulfat in.
1000 Teilen des Fermentationsmediums enthielt und auf einen Gehalt von 1000 T/M Chlorionen einge- stellt war, bei Verwendung eines chloridverwertenden Stammes von Streptomyces aureofaciens S-77 folgende Produktionsergebnisse erzielt ;
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<tb> Br- <SEP> CTC <SEP> TC <SEP> Summe
<tb> 0 <SEP> MM <SEP> 300 <SEP> 6750
<tb> 500 <SEP> 4650 <SEP> 1230 <SEP> 5880
<tb>