DE1445488A1

DE1445488A1 - Verfahren zur Herstellung von 6-Amino-penicillansaeure

Info

Publication number: DE1445488A1
Application number: DE1963B0070633
Authority: DE
Inventors: Brandl Dr Ernst; Steiner Dr Helmut; Alfred Schmid
Original assignee: Biochemie GmbH
Current assignee: Sandoz GmbH
Priority date: 1962-02-14
Filing date: 1963-02-05
Publication date: 1968-11-14
Also published as: SE323077B; DK131500B; AT233739B; GB961517A; DE1445488B2; DK131500C; US3337415A

Description

j Gesellschaft mit bescnränkter i.iaftun&· in .uundl (.L'irol, Österreich)

Vorfahren zur Herstellung von 6■►üIaiJ■^lopL·--xlicillansäure

■ Die vorliegende iirfinclung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aininopenicillansäure durch enzymatisch^ Spaltung von Phenoxymethylpenicillin oder dussen Salzen mit iaikro-Mellen Snzymträgern.

Zur Herstellung von o-iküiinopenicillansäure ist bereits eine Anzahl von Verfahren bekannt geworden. So gelingt es nach der sogenannten ^wprecursorlosen Fermentation" unter Anwendung der für die Penicilliabildung gebräuchlichen ülze in einem Kulturmedium üblicher Zusammensetzung 6-Aminopenicillansäure zu erzeugen. Man kann, aber auch - und das Verfahren gemäß der vorliegenden SärfiB&ung atellt eine weitere Entwicklung dieser Art von Herstellungsverfahren für 6-Aminopenicillansäure dar - von vorgebildeten Penicillinen ausgehen und in diesen Penicillinen auf enzymatisch.®» Wege eine Abspaltung der Seitenkette bewirken. Die

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Spaltung von Phenoxymethylpenicillin ist bisher insbesondere mittels Penicillinaiaidasen aus Pilzen durchgeführt worden und es v/urde aucii schon eine Anzahl von Pilzen für die enzymatisch^ Spaltung von Phenoxyaetiiylpenicillin eingesetzt. !.lan hat bereits versucht, durch Zusatz von Phenylessigsäure oder deren Derivaten bei der Vermehrung eines zur Spaltung von Penicillin G- geeigneten Stromes von E. coli die Ausbeuten an 6-Aiiiinopenicillansäure bei aer Spaltung von Penicillin G- zu erhöhen.

Bei Anwendung der zur Spaltung" des Phenoxymethylpenicillins in ö-Aminopenicillansäure bekannten Pilze tritt stets eine mehr oder weniger lange Lagphase auf. 7.ährend dies&r Lagphase wird in Gegenwart des zu spaltenden Penicillins (Substrat) keine Enzymtatigkeit beobachtet; hingegen kommt es dabei zu einer unerwünschten Zerstörung des zu spaltenden Penicillins.

Versuche _y die Spaltung von Phenoxymethylpenicillin unter Anwendung von Actinoiayceten und Pilzen dadurch zu beeinflussen, daß Man Phenoxyessigsäure oder ö-Aminopenicillansäure gleichzei-' tig mit dem Substrat zugibt, zeigten, daß ein Zusatz von Phenoxyessigsäure ohne Wirkung ist, während ein solcher von 6-Aminopenicillansäure eine Ausbeut everminderun^· nach sich zieht /~Proc. of the Boy.al Soc, Bd. 154-, Seiten 522 - 531 (1961 )_7. ferner zeigte es sich, daß Phen0x3ruiethylpenieillin.-spalten.de Pilze, die in einem durch Zugabe von Phenylessigsäure modifizierten iaedium herangezüchtet worden waren, beim nachfolgenden Spaltungsverfahren keine erhöhte Ausbeute lieferten.

Es wurde nun gefunden., daß es bei bestimmten, zur Phenoxyaethylpeniciliittspaltung geeigneten Mikroorganismen, nämlich Fusarien. und Hefen, gelingt, die beobachtete Lagphase (inner-

halb der keine Enzyiatätigkeit zu beobachten ist) dadurch abzukürzen, daß man wahrend einer vorher nahenden .«aclis turns phase ge-. ringe Liengen von ühenoxyessigsäure, 6-x^uinopenicillansäure oder deren Salzen zusetzt. Jriledurch koiiiiat es scheinbar während des V.achstums zu einer adaptiven Ausbildung ein^s aktiven Enzyms. Bei Anwendung dieser i/iaßnalune setzt also die enzymatisch^ Spalttätigkeit nach der auf die Heranführung des Eiizyürbrägers folgenden Spaltungsperiode sofort nach Zufügung des Substrates ein und man erhält in kürzerer Zeit höhere Ausbeuten an 6-Aminopenicillansäure .

Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht somit darin, daß man als mikrobielle Enzymträger für die Spaltung Fusarien oder hefen verwendet, diese Enzymträger vor der Einwirkung auf das zu spaltende lenicillin unter Zusatz geringe!· kengen von Phenoxyessigsäure, 6-Aminopenicillansäure, oder deren Salzen, einzeln oder zu mehreren, wachsen läßt und die Enzymträger nach dieser Vorbereitungsperiode auf das Penicillin enthaltende Substrat zur Einwirkung bringt.

Bei dieser bei der Heranführung des Enzymträgers erfolgenden adaptiven Bildung der zur Spaltung des Phenoxyiaethylpenicillins geeigneten Aktivatoren durch Zusatz von 6-Aminopenicillansäure' und bzw. oder Phenoxyessigsäure handelt es sich, wie Versuche gezeigt haben, nicht um ein allgemein anwendbares Prinzip, da bei anderen, Phenoxymethy !penicillin - spaltenden Mikroorganismen durch diese i,Iaßnahme eine Abkürzung der Lagphase bzw. Abkürzung und Erhöhung der Spaltung nicht beobachtet werden kann.

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Die für die Adaptierung der Enzymträger geeigneten Verbindungen, nämlich Phenoxyessigsäure und bzw. oder 6-Aminopenicillansäure oder Salze dieser Verbindungen, werden vorzugsweise in Konzentrationen von ^O,001 bis 2,0 ■%, insbesondere von etwa 0,2 %, verwendet, wobei man die günstigste Konzentration je . nach dem verwendeten Mikroorganismus variieren kann. Die Adaptierung kann man vorteilhaft während aufeinanderfolgender Passagen durchführen,-in welchen die zugesetzte Menge an 6-Aminopenicillansäure und bzw. oder Phenoxyessigsäure erhöht wird; man kann aber auch eine einmalige Adaptierung z.B. während der der Spaltung unmittelbar vorangehenden Wachstumsphase vornehmen.

In den nachfolgenden Beispielen ist das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert. Die Zahlenwerte, die in den im Rahmen der Beispiele angegebenen Tabellen enthalten, sind, bedeuten Einheiten pro ml.
Beispiel 1:

a) Pus. anguiöides wurde in*.500 ml-Erlenmeyerkolben gezüchtet, die mit 100 ml einer sterilen nährlösung der folgenden Zusammensetzung gefüllt waren; die Züchtung erfolgte auf einer Schüttelmaschine mit 40 mm Hub bei 200 Umdr/min und einer Temperatur von 25° 0.

Bierhefeautolysat-Stickstoff ' 0,15%

Glukose 4,0 %

OaGO₂ 1,0 % pH-uerii 6,0

., b) Unter gleichen Bedingungen wurde eine weitere Kultur mit der Abänderung angesetzt, daß 1,1 % 6-Aminopenicillansäure 'zur Nährlösung hinzugefügt wurden. Nach 40-stündiger ffermentationszeit wurden zum Ansatz a) und zum Ansatz b) je 15.000 E/ml

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Kalium-Penicillin V zugesetzt} dann wurde unter den oben genannten Bedingungen weiterfermentiert. 12, 24 und 36 stunden nach dem Penicillinzusatz wurde auf jοdometrisehern Wege die gebildete 6-Aminopenicillansäure und das verbliebene .Restpenicillin bestimmt. Hiebei wurde so vorgegangen, daß das Penicillin in der üblichen Weise bei saurem pH mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und nach Überführung in einer Pufferlösung getestet wurde; die 6-Aminopenicillansäure wurde nach Neutralisation in der wässerigen Phase direkt bestimmt. Die erhaltenen .Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Fermentations zeit in Stunden:	vorhandene Menge an:	Ansatz	Ansatz D)
12	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	1060 13820	364ü 9600
24	6-Aminop eni- cillansäure Penicillin	2700 11450	5740 8200
. 36	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	4100 8380	9320 4100

Beispiel 2:

a) Auf folgender steriler Nährlösung, die in Mengen zu 200 ml in 2 1-Erlenmeyerkolben abgefüllt war, wurde Fus. culmorum herengezüchtet.

Öomsteepliquor-Stickstoff Bierhefeautolysat-Stickatoff Glukose

OaGOj

pH-Wert 6,5

0,15 % 0,1 % 1,0 % 0*7 $ (getrennt

sterilisiert)

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to ach 48 Stunden Schütteln "bei 28 G auf einer £undschüttelmaschine mit 250 ümdr/min und 40 mm. HuTd wurde der Inhalt von je 2 .Kolben als Impf gut für 10 1 Ifirosta-Fermenter mit Vortexsystem verwendet. Mach einer 36-stündigen Viiachstumsphase wurden diesen Fermentern 40.000 iil/ml Kalium-Penicillin 7 zugesetzt; 12, 36 und 48 Stunden nach dem Penicillinzusatz wurden die gebildete 6-Aminopenicillansäure und das Hestpenicillin (nach Extraktion) jodometrisch bestimmt.

b) Bei der Durchführung eines Parallelversuches wurde wie unter a) vorgegangen, jedoch wurden am Beginn der jeweiligen ■^achstumsphase im 3?ermenter je 0,3 % Phenoxyessigsäure zugefügt. Die Bestimmung der gebildeten 6-Aminopenicillansäure und des . Restpenicillins erfolgte wie unter a) angegeben.

l'ermentations- zext in Stunden:	vorhandene Menge an:	Ansatz a) -	Ansatz D)
12	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	1800 34960	2680 33Ο9Ο
36	6-Aminoρeni- cillansäure Penicillin	2320 3249Ο	4940 3OI7O
48	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	3140 3Ο53Ο	12830 232ΟΟ

Beispiel- 3:

a) Fus. oxysporum wurde auf folgender steriler Nährlösung in der unter 2a) beschriebenen Weise gezüchtet:

0,5 % ■

0,5 % 0,1 fa

Ammoniumac etat Ammoniumlaktat Ammoniumsulfat

- 6 - .
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Kupfer, Eisen, Mn, Mg, Zn GaCO,

pH-Wert 7,0

in Spuren 1,0 % (getrennt

sterilisiert)

2 1 eines auf diese Weise erhaltenen, 97 Stunden alten Kulturbreies wurden als Impfgut für ein mit Schikanensystem ausgestattetes Submersfermentationsgefäß verwendet, das mit 15 1 Nährlösung der obigen Zusammensetzung gefüllt v/ar. Nach einer 36-stündigen Fermentation wurden 30.000 E/ml zu spaltendes Kalium-Penicillin V zugesetzt und 6-Aminopenicillansäure und Penicillin wie oben analytisch bestimmt.

b) Parallelversuche wurden wie unter a), Jedoch unter Zusatz von 0,05 % Phenoxyessigsäure zur 1. Stufe und 0,1 % Phenoxyessigsäure zur 2. Stufe, durchgeführt.

Fermentations- zeit in Stunden:	vorhandene Menge an:	Ansatz a)	Ansatz b)
10	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	3020 23930	24280 3150
24	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	6730 20140	22060 2200
36	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	13640 10460	20430 1940

Beispiel4:

a) Torulopsis albida wurde auf einer sterilen Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung

Bierhefeautolysat-Stickstoff 0,05 %

Asparagin Glukose OaOO, pH-ftert

0,1 % 1,5 % 0,5 %

5,5

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herangeführt, wobei 60 ml in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben gefüllt und auf einer Rundschüttelmaschine mit 250 Umdr/min und 30 mm Hub bei 30° 0 fermentiert wurden.

Nach 24 Stunden wurde der Inhalt der Kolben nach Filtration dreimal mit je 60 ml sterilem HpO gewaschen und in der gleichen Vnassermenge suspendiert, worauf man 28.000 E/ml Kalium-Penicillin Y zusetzt und nach weiteren 10, 20 und 30 Stunden die gebildete 6-Aminopenicillansäure und das verbliebene Restpenicillin durch jodometrischen Test bestimmt.

b) Bei Parallelversuchen wurden nach 12 Stunden Fermentationsdauer 0,15 % Phenoxyessigsäure zugesetzt und im übrigen wie unter a) verfahren.

Fermentations zeit in Stunden:	vorhandene Menge an:	Ansatz a)	Ansatz b)
10	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	213O 24720	6890 19680
20	» 6-Aminopeni cillansäure Penicillin	355O 22000	11420 13270
30	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	5204 19770	16600 952O

Beispiel 5 !

a) In 2 1-Erlenmeyerkolben wurden je 200 ml folgender steriler Nährlösung gefüllt:

Oornsteepliquor-Stickstoff 0,05 %

Bierhefeautolysat-Stickstoff 0,05 %

Asparagin 0,05 %

Glukose . 1,0 %

übliche Spurenelemente, OaOO, 0,5' % pH-^ert 6,0 ⁵

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und mit einer von Schrägagar gewonnenen 3j)orensuspension einer· Fus. semitectum-Kultur beimpft.

Hach 24-stündigein \,'achstum bei 28 G unter (Schütteln auf' einer Längs Schüttelmaschine mit 100 Ausschlägen/min und einem iiub von 25 m wurde mit 5 % dieses iiycelbreies ein mit Rühreinrichtung und Luftzufuhr ausgestattetes Submers.gefäß von 80 Inhalt, das mit 4-0 1 einer sterilen nährlösung der oben angegebenen Zusammensetzung gefüllt war, beimpft. iTach einer 36 Stunden dauernden Fermentation wurde der erhaltene Kulturbrei filtriert und der Mycelrückstand mit wasser auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt. Nach Zusatz von 50.000 ü/ml Kalium-Penicillin V wurde die Suspension stehen gelassen und nach 8, 16 und 24 Stunden auf den Gehalt an 6-Aminopenicillansäure und Penicillin getestet.

b) Ein Parallelversuch wurde wie unter a), jedoch unter Zusatz von 0,2 % Phenoxyessigsäure zur Impfgutnährlösung, durchgeführt.

Fermentations - zeit in Stunden:	vorhandene Menge an;	Ansatz a)	Ansatz To)
8	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	1200 27080	23360 4450
16	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	1800 26100	26270 2100
	6-Aminopeni cillansäure Penicillin	2300 25650	26680 1100

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Glukose Laktose OaOO,

Beispiel6:

a) Fusarium lycopersici wurde auf einer sterilen Nährlösung der folgenden Zusammensetzung nach der unter 5&) beschriebenen Methode gezüchtet:

Sojabohnenmehl-N 0,1 %

0,2 %

0,5 % 0,5 %

1,0% (getrennt steripMert 7,0 . ' lieiert)

Mit den 40 1 des nach 36 Stunden Fermentationsdauer im Submersgefäß wie im Beispiel 5a) erhaltenen Mycelbreies wurden 200 1 der oben angeführten sterilen Nährlösung eines größeren,, ähnlich ausgestatteten Rührgefäßes beimpft und durch 48 Stunden hindurch kultiviert, worauf 20.000 E/ml Kalium-Penicillin V zugesetzt wurden. Nach 8, 16 und 24 Stunden wurde der Gehalt an 6-Aminopenicillansäure und Penicillin bestimmt.

b) Ein Parallelversuch wurde wie unter a), jedoch mit Zusatz von 0,1 % Phenoxyessigsäure und 0,1 % 6-Aminopenicillansäure zur Impfgutnährlösung durchgeführt.

Fermentations- zeit in Stunden:	vorhandene Menge an:	Ansatz a)	Ansatz b)
8	ö-Äminopeni- cillansäure Penicillin	670 18130	5840 14070
16	6-Aminopenicil !ansäure Penicillin	- 2200 16870	8730 11410
• 24	6-Aminopeni- cillanaäure .Penicillin	3980 15460	11690 7780

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatisch^ Spaltung von Phenoxymethylpenicillin oder dessen Salzen mit mikrobiellen Enzymträgern, dadurch gekennzeichnet, daß man als mikrobielle Enzymträger für die Spaltung Fusarien oder Hefen verwendet, diese Enzymträger vor der Einwirkung auf das zu spaltende Penicillin zwecks Adaptierung in Gegenwart geringer Mengen Phenoxyessigsäure, 6-Aminopenicillansäure, oder deren Salzen, einzeln oder zu mehreren, wachsen läßt und die Enzymträger nach dieser Vorbereitungsperiode auf das Phenoxymethylpenicillin enthaltende Substrat zur Einwirkung bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzymträger Fusarium anguioides, Fusarium Oulmorum, Fusarium oxysporum oder Fusarium semitectum verwendet.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzymträger Torolopsis albida verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß man die Adaptierung in mehreren aufeinanderfolgenden Passagen bei zunehmenden Mengen von 6-Aminopenicillansäure .und bzw. oder Phenoxyessigsäure vornimmt.

Dr.EM/GS 25-1.1963.

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