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Verfahren zur Herstellung von Diphterie-Toxoid Diese Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Diphtherie-Toxoid aus gereinigten Toxinen bakteriellen
Ursprungs.
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Der Schutz gegenüber verschiedenem bakteriellem Befall, wie Diphtherie
bei Menschen und Enterotoxaemia bei Schafen, kann durch Immunisierung des Wirtes
mit Toxoiden erreicht werden, welche aus den Toxinen herrühren, die durch pathogene
Bakterien erzeugt werden. Die Toxoide können durch Behandeln der Toxine mit Formaldehyd
hergestellt werden. Toxoide, welche auf diese Weise aus rohen Toxin-Zubereitungen
hergestellt werden, haben den Nachteil, daß sie nicht einheitlich antigen sind;
so kann die antigene Wirkung löslicher Toxoide gering sein, und sie werden gewöhnlich
mit einem Hilfsmittel, wie einer Aluminiumverbindung, kombiniert, um ein wirksames
Vakzin zu ergeben. Andererseits ist die Behandlung gereinigten Diphtherie-Toxins
mit Formaldehyd allein nicht zufriedenstellend, weil trotz der möglichen vollständigen
Umwandlung zu Toxoid nach Entfernen des Formaldehyd-Überschusses das Toxoid bei
Verdünnung und Lagerung Umkehrung zu einem toxischen Status zeigen kann.
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So ist in der USA.-Patentschrift 2 719 102 ein Verfahren zur Herstellung
eines Toxoids beschrieben, wobei von einem rohen Toxin ausgegangen wird und dieses
einer mehrtägigen Formaldehydbehandlung unterworfen wird. Ist es jedoch im Sinn
einer Standardisierung der Präparate zur Erzielung einwandfrei reproduzierbarer
Werte erforderlich, von einem gereinigten bakteriellen Toxin auszugehen, so ist
eine solche Verfahrensweise nicht anwendbar. Behandelt man nämlich solche gereinigten
Toxine mit Formaldehyd, erhält man tatsächlich Produkte, die nach kurzer Zeit wieder
toxisch werden und nur geringe Antigenwirkungen zeigen (British Journal of Experimental
Pathologie, 1963, S. 177, 178).
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Durch die vorliegende Erfindung gelingt es nun, Toxoide aus gereinigten
bakteriellen Toxinen herzustellen. wobei diese Toxoide in hohem Maß als lösliche
Toxoide antigen und relativ stabil sind, sie sind als Vakzide verwendbar.
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Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung
von Diphtherie-Toxoid aus gereinigtem bakteriellem Diphtherie-Toxin durch Behandlung
mit Formaldehyd, wobei die Formaldehydbehandlung in Gegenwart von Lysin erfolgt.
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Es ist zwar aus Nature, London, 174, 407 (1954), bekannt, vor der
Toxoidierung von gereinigtem Diphtherietoxin Glycin zuzusetzen. Es hat sich indessen
überraschenderweise gezeigt, daß z. B. bei der erfindungsgemäßen Verwendung von
Lysin im Antigen-
Wirksamkeitstest die so hergestellten Produkte einen Antitoxingehalt
von 17,3 pro Millimeter aufweisen, gegenüber nur <0,055 pro Millimeter bei mit
Glycin hergestellten Produkten. Ähnlich liegen die Verhältnisse bei Bestimmung des
geometrischen Mittels des Antitoxintiters bei Reihenversuchen mit Meerschweinchen.
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Zur Durchführung der Erfindung wird es vorgezogen, gereinigte bakterielle
Toxin-Zubereitungen zu verwenden, welche wenig oder kein stickstoffhaltiges Material
niederen Molgewichts, das von Anfang an in den rohen Toxinzubereitungen vorhanden
sein kann, enthalten. Die Gegenwart einiger anderer Amine beeinflußt die Ausbeute
an Toxoid in nachteiligem Sinn. Zufriedenstellende Ergebnisse können jedoch in Gegenwart
von dibasischen, aliphatischen Aminen mit einer primären oder sekundären Aminogruppe
erzielt werden, beispielsweise mit Gemischen von Lysin und Alanin.
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Die Mengenverhältnisse von Formaldehyd und Lysin können nach den
Umständen verschieden sein. Die Molkonzentration des Amins'sollte vorzugsweise nicht
größer als die des Formaldehyds sein; sie kann beispielsweise zwischen 20 und 1000/o,
bezogen auf Formaldehyd, liegen.
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Die Wirkungsweise ist nicht eindeutig geklärt. Man nimmt jedoch an,
daß das Formaldehyd das zugegebene Lysin mit dem Toxinmolekül (in der folgenden
Formel als [Tj H bezeichnet) durch Reaktion mit einem aktiven Wasserstoffatom an
einer Amino- oder anderen
mit Formaldehyd reaktionsfähigen Gruppe
verbindet.
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Die Reaktion kann wie folgt ablaufen: [T] H t CHO t H2N. CH(CO2H)
[CH2], NH2 [Tj CH2 NH. CH(CO2H). [CH2]4. NR2 + H2O Die hohe antigene Wirkung und
die relative Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten Toxoide kann mit so eingeführten
basischen Seitenketten in Verbindung stehen. Möglicherweise ist das beim Behandeln
gereinigter Toxine mit Formaldehyd allein gewonnene Toxoid wegen der umkehrbaren
Bildung von reaktionsfähigen Hydroxy-methylgruppen und der Bindung mit den Toxinmolekülen
nicht zufriedenstellend.
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[T].H + CH2O # [T]. CH2CH 2 [T] H + CH2O + [T] CH2 [T] + H2O Bei
den erfindungsgemäß hergestellten Produkten dürfte es sich also um neue Toxoide
der Formel [T] CH2Y handeln, worin [T] den Rest darstellt, der durch den Verlust
eines Wasserstoffatoms an einer mit Formaldehyd reaktionsfähigen Gruppe eines bakteriellen
Toxinmoleküls gebildet wird, während Y den Lysin-Rest, der unter Verlust eines Wasserstoffatoms
der Aminogruppe gebunden ist, darstellt.
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Das Toxinmolekül kann, insbesondere als Eiweißmolekül, viele aktive
Wasserstoffatome haben und wird besser durch die Formel [t] (R)n dargestellt. Die
erfindungsgemäßen Toxoide können daher verschiedene Aminomethylreste CH2Y pro Toxoidmolekül
enthalten und durch die Formel [t] (CH2 Y)n wiedergegeben werden. In diesen Formeln
stellt [t] den Rest dar, der von einem bakteriellen Toxinmolekül gebildet wird durch
den Verlust von einem oder mehreren Wasserstoffatomen an mit Formaldehyd reaktion
fähigen Gruppen, und n ist eine positive ganze Zahl.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
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Beispiel 1 Eine Lösung von 27 g L-Lysin-Monohydrochlorid (0,15 Mol),
(das 2°/o D-Enantiomeres enthielt) in 2000 ml destilliertem Wasser wurde nach und
nach behandelt mit 15 g Natriumbikarbonat, 15 ml 36°/Oiger Gew./Vol. Formaldehyd-Lösung
(0,18 Mol) und 200ml einer Lösung von gereinigtem Diphtherie-Toxin, welches annähernd
3000 Lf Einheiten pro Milliliter und mindestens 2200 Lf Einheiten pro Milligramm
Proteinstickstoff, bestimmt nach internationalem Standard (Flockenbildung) Antitoxin
enthielt. Das Gemisch wurde auf 3000 ml aufgefüllt, auf pH 7,6 gebracht und
durch
Filtrierung sterilisiert; es enthielt dann 570 Lf Einheiten pro Milliliter.
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Das Gemisch wurde 3 Wochen lang bei 18 bis 200 C belassen und war
dann bei pH 7,1 und enthielt 560 Lf Einheiten pro Milliliter. Eine 10flach verdünnte
Probe in Boratpuffer war gegenüber Meerschweinchen und Kaninchen in intracutaner
Injektion nicht toxisch. Um die Umwandlung des Toxins zu einem Toxoid zu vervollständigen,
wurde das Gemisch 3 Wochen lang bei 32° C bebrütet, hatte dann einen pH-Wert bei
7,25 und enthielt 540 Lf Einheiten pro Milliliter, ein Abfall ohne Bedeutung.
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Ein kleiner Volumteil der toxischen Lösung wurde gegenüber destilliertem
Wasser, welches 0,01 0/o Natrium-ortho-(äthyl-Quecksilber-thio)-benzoat enthielt
dialysiert und dann intracutan bei Kaninchen ausprobiert, wobei festgestellt wurde,
daß das Produkt nach Entfernen des Formaldehyds vollkommen ohne toxische Wirkung
war. Die Hauptmenge der Toxoidlösung wurde mit Ammoniumsulfat und Natriumbikarbonat
in einem Verhältnis von 44 g Ammoniumsulfat und 0,5 g Natriumbikarbonat pro 100
ml Lösung behandelt und über Nacht stehen gelassen. Das ausgefällte Toxoid wurde
abgefiltert und in annähernd 600 ml 0,010/,iger Natriumbikarbonatlösung wieder gelöst
und bis zum Freisein von Sulfat dialysiert.
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Beispiel 2 Nach dem Verfahren vom Beispiel 1 wurde ein Toxoid hergestellt
aus gereinigtem Diphtherie-Toxin in Gegenwart von 0,05 M-L-Lysin, 0,05 M-L-Alanin
und 0,06 M-Formaldehyd.
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Beispiel 3 Nach dem Verfahren vom Beispiel 1 wurde ein Toxoid hergestellt
aus gereinigtem Diphtherie-Toxin in Gegenwart von 0,025 M-L-Lysin, 0,075 M-L-Alanin
und 0,06 M-Formaldehyd.