DE1248041B

DE1248041B - Verfahren zur Herstellung von 11alpha-Hydroxy-4-conenin-3-on bzw. Saeureadditionssalzoder quaternaeren Ammoniumverbindungen desselben

Info

Publication number: DE1248041B
Application number: DEK55357A
Authority: DE
Original assignee: Koninklijke Nederlandsche Gist en Spiritusfabriek BV
Current assignee: DSM Delft BV
Priority date: 1964-03-03
Filing date: 1965-02-22
Publication date: 1967-08-24
Also published as: FR4918M; BE660414A; NL6402112A; CH460011A; FR1438316A; US3472736A; NL126232C

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

»EUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

ÖL

Int. Cl.:

C07c

Deutsche Kl.: 12 ο-25/01

Nummer: 1248041

Aktenzeichen: K 55357 IV b/12 ο

Anmeldetag: 22. Februar 1965

Auslegetag; 24. August 1967

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von lla-Hydroxy-4-conenin-3-on bzw. von Säureadditionssalzen und quaternären Ammoniumverbindungen desselben unter Verwendung von Conessin als Ausgangsmaterial.

Es wurde gefunden, daß Conessin praktisch quantitativ in 11 a-Hydroxy-4-conenin-3-on umgewandelt werden kann, und zwar durch Inkubieren von Conessin in Gegenwart von Sauerstoff mit Enzymen, die durch Züchten von Stacbybotrys parvispora (Hughes) in einem Medium mit einem pH-Wert von mindestens 5, das mindestens 20 g eines assimilierbaren Kohlehydrats pro Liter enthält, gebildet worden sind.

Diese Umwandlung kann durch das folgende Schema wiedergegeben werden:

CH₃

H₃C

Conessin

CH₃

HO

1 la-Hydroxy-4-conenin-3-on

Gewünschtenfalls kann die so erhaltene Verbindung zwecks Herstellung von Salzen nach an sich bekannten Methoden mit Säuren oder zwecks Herstellung von quaternären Ammoniumverbindungen mit Estern aus starken Sauren und Alkoholen umgesetzt werden. Die Salze können zur Isolierung und/oder Reinigung des Reaktionsproduktes benutzt werden, da sie nach an sich bekannten Methoden wieder in die freie Verbindung übergeführt werden können.

Es war aus Tetrahedron Letters, Nr. 26, S. 1257 bis 1259 (1962), bekannt, daß die /|5-3-Dimethyl-Verfahren zur Herstellung von lla-Hydroxy-4-conenin-3-on bzw. Säureadditionssalzen oder
quaternären Ammoniumverbindungen desselben

Anmelder:

Koninklijke Nederlandsche
Gist- & Spiritusfabriek N. V.,
Delft (Niederlande)

Vertreter:

Dr. phil. Dr. rer. pol. K. Köhler, Patentanwalt,
München 2, Amalienstr. 15

Beanspruchte Priorität:

Niederlande vom 3. März 1964 (6 402 112)

aminogruppierung des Conessins mit Hilfe von Enzymen aus Gloeosporium cyclaminis oder Hypomyces haematococcus in die J⁴-3-Oxogruppierung umgewandelt werden kann, wenn die Mikroorganismen aerob in einem einfachen Medium, bestehend aus 5 g Glukose pro Liter und einer Menge Maisquellwasser, entsprechend 5 g Trockensubstanz pro Liter, gezüchtet werden. Dabei wird in guter Ausbeute 4-Conenin-3-on erhalten.

Auch sind 11-Hydroxylierungen von Steroidverbindungen auf mikrobiologischem Wege aus der Literatur hinreichend bekannt (s. zum Beispiel Fieser und Fieser, »Steroids«, ί 959, S. 672 bis 675). Die gleichzeitige Einführung einer Ha-Hydroxygruppe in Conessin und Umwandlung der . l⁵-3-Dimethylaminogruppierung in die <l⁴-3-Oxogruppierung gelingt aber nicht mit Hilfe von Enzymen aus Gloeosporium cyclaminis oder Hypomyces haematococcus, auch nicht, falls die Mikroorganismen in einem erfind ungsgemäßen Medium mit einem pH-Wert von mindestens 5, das mindestens 20 g eines assimilierbaren Kohlehydrats pro Liter enthält, gezüchtet werden. Die Reaktion ist also spezifisch für Stachybotrys parvispora.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr vorteilhaft, weil man das wertvolle neue llu-Hydroxy-4-conenin-3-on in einer einzigen Stufe aus Conessin herstellen kann.

Der Mikroorganismus Stachybotrys parvispora (Hughes) wird vom Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, aufbewahrt.

709 iM/577

Vorzugsweise wird eine Submerskultur von Stachybotrys parvispora (Hughes) unter aeroben Bedingungen auf das Ausgangsmaterial zur Einwirkung gebracht. Das Gemisch kann geschüttelt oder gerührt werden. Zu der Kultur wird das Conessin als Lösung oder in feindispergierter Form zugegeben. Nach Vollendung der Umwandlung zu lla-Hydroxy-4-conenin-3-on — die vorzugsweise mittels Dünnschichtchromatographie geprüft wird — wird das Endprodukt aus der Kultur isoliert, vorzugsweise durch Alkalisieren und Extrahieren. Mittels bekannter Methoden, z. B. durch Kristallisation, Chromatographie oder Umwandlung in Salze, kann das Endprodukt in reinem Zustand erhalten werden.

Die quaternären Ammonium derivate des 1 Ia-Hydroxy-4-conenin-3-ons werden durch Umsetzung der letztgenannten, nicht quaternisierten Verbindung mit den üblichen Estern aus aliphatischen und araliphatischen Alkoholen und starken Säuren erhalten. Als Beispiele von geeigneten Quaternisierungsmitteln seien aliphatische und araliphatische Ester von Schwefelsäure. Halogenwasserstoffsäure, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure oder JodwasserstofF-säure, und insbesondere die Jodide und Bromide genannt. Die Quaternisierungsmitte) leiten sich insbesondere von niederen Alkoholen, niederen Alkenolen, Phenyl-nicdrig-alkanolen und Cycloalkylniedrig-alkanolen ab. Die quaternisierenden Ester sind vorzugsweise Äthyljodid, Methyljodid, Äthylbromid, Methylbromid, Methylsulfat, Allylbromid, Benzylbromid oder Cyclohexylmethylbroinid.

Die Quatemisierungsreaktion wird in üblicher Weise durchgeführt, z. B. durch Kochen des erhaltenen lla-Hydroxy-4-conenin-3-ons in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Acetonitril, Alkoholen. Gemischen aus Alkoholen und Wasser, Benzol, oder Aceton, mit dem Quatcrnisierungsmittel.

Das nach dem Verfahren der Erfindung erhaltene llu-Hydroxy-4-conenin-3-on bzw. Säureadditionssalze oder quaternäre Ammoniumverbindungen desselben sind in der Literatur bisher nicht beschrieben. Die Verfahrensproduktc zeigen eine bemerkenswerte antiphlogistische Wirksamkeit und niedrige Toxizität. Darüber hinaus sind die neuen Verbindungen als Zwischenprodukte für die Herstellung anderer therapeutisch wirksamer Verbindungen von Wert.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Verfahrensgemäß können auch andere konzentrierte Kulturmedien verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie einen pH-Wert von nicht mehr als 5 aufweisen und während des Züchtens des Mikroorganismus und der verfahrensgemäßen Umwandlung mindestens 20 g eines assimilierbaren Kohlehydrates pro Liter enthalten.

Beispiel 1

Ein 40 g Glukose, 3 g Natriumnitrat, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,5 g Magnesiumsulfat · 7 H₂O, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat und 0,01 g Eisen(ll)-sulfat 7 H₂O pro Liter Wasser enthaltendes Medium wurde durch einige Tropfen von konzentrierter Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 5 gebracht. 151 dieser Lösung wurden in ein Fermentierungsgefäß aus rostfreiem Stahl, ausgerüstet mit Belüfter und Rührer, eingebracht, wonach das Medium mit Dampf während 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert wurde.

Nach dem Kühlen wurde das Animpfen mit 500 ml einer 48 Stunden alten Schüttelkultur (Umdrehungsgeschwindigkeit 250 Umdr./Min., Schüttelweg 2,5 cm) von Stachybotrys parvispora (Hughes) vorgenommen. Das Medium dieser Schüttelkultur enthielt 20 g Glukose und 20 g Maisquellwasser (berechnet auf Trockensubstanz) pro Liter.

Die Kultur wurde in dem Fermentierungsgefäß bei einer Temperatur von 26⁰C gehalten, während

ίο 10 1 sterile Luft pro Minute durchgeführt wurden und mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdr./Min. gerührt wurde.

Unter sterilen Bedingungen wurde 24 Stunden nach dem Animpfen eine Lösung von 4,5 g Conessin in 250 ml verdünnter Schwefelsäure (0,5⁽⁾/o) zugegeben und das Rühren weitere 75 Stunden bei der gleichen Temperatur fortgesetzt. Eine chromatographische Analyse ergab, daß das Conessin nach dieser Zeit in lla-Hydroxy-4-conenin-3-on umgewandelt war.

Das Reaictionsgemisch wurde mit 6 n-Schwefelsäure auf pH 3 angesäuert und filtriert. Das Filtrat wurde mit 11 n-Natriumhydroxydlösung alkalisiert (pH — 10) und danach dreimal mit 0,3 Volumteilen Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zweimal extrahiert mit 0,15 Volumteilen einer 0,05 n-Schwefclsäure. Der pH-Wert des sauren Extraktes wurde mit 11 n-Natriumhydroxydlösung auf 10 eingestellt, der Extrakt wurde danach dreimal mit 0,15 Volumteilen Methylisobulylketon extrahiert. Dieser Extrakt wurde endlich unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das erhaltene rohe lla-Hydroxy-4-conenin-3-on hatte ein Gewicht von 3,4 g. Es wurde in einem Gemisch von 2,5 ml Essigsäure und 241 Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,6 g Kaliumiodid, gelöst in 4,5 ml Wasser, zugegeben. Unmittelbar nach dieser Zugabe begann die Kristallisation des Hydrojodids des lla-Hydroxy-4-conenin-3-ons. Nach Stehenlassen während einiger Zeit bei 2"C wurde die kristalline Fällung abfiltriert und getrocknet. Die Ausbeute betrug 4,9 g Durch Kristallisation aus einem Gemisch von Methanol und Äther wurden 3,43 g des reinen Produktes erhalten mit einem Schmelzpunkt von 229,5 bis 230,5' C (unter Zersetzen). Die Dünnschichtchromatographie zeigte, daß das Produkt keine Verunreinigungen mehr enthielt.

Elementaranalyse:

Berechnet... C 57,78, H 7,44, N 3,06, J 27,88%; gefunden ... C 57,85, H 7,68, N 3,08, J 27,54%.

Durch Lösen des Hydrojodids von ll«-Hydroxy-4-conenin-3-on in Wasser, Alkalisieren, Schütteln mit Methylisobutylketon und Eindampfen des Extraktes zur Trockne wurde die freie Base erhalten. Sie hatte die folgenden physikalischen Eigenschaften:

IR-Spektrum: Absorption maximal bei 3600, 1665 und 1610 cm ^x (Hydroxylgruppe und a,ß~ungesättigte Ketongruppierung).

UV-Spektrum: Absorptionsmaximum bei 241 ΐτίμ (, = Η 600).

[«]₀ = +138° (c = 1, in Chloroform).

Die Oxydation des Verfahrensprodukts mit Chromtrioxyd zur Identifizierung ergab4-Conenin-3,11 -dion, das auf Grund seines Rf-Wertes bei der Papier-Chromatographie und der Dünnschichtchromatographie sowie des Schmelzpunkts und des Mischschmelzpunkts und des IR-Spektrums mit einem synthetischen Produkt als identisch festgestellt wurde

(J. F. K e r w i η und Mitarbeiter, J. Org. Chem., 27, 3628 [1962]). Das Oxydationsprodukt schmolz bei 162^C1C; [α]₀ = +270' (c ^ 1, in Chloroform). Das IR-Spektrum zeigte kein Absorptionsmaximum bei 3600 cm"¹, jedoch ein Maximum bei 1703 cm"¹ (Oxo-Gruppe im Cyclohcxanring). Das UV-Spektrum zeigte ein Absorptionsmaximum bei 239 πΐμ (t = 16 100).

Das lla-Hydroxy-4-conenin-3-on ließ sich leicht bei Raumtemperatur mittels eines Gemisches von Essigsäureanhydrid und Pyridin acetylieren, was in Verbindung mit dem Wert der Molekulardrehung auf eine 11 a-Hydroxyverbindung schließen läßt.

An Stelle des Hydrojodids kann auch das Salicylat von 11 a-Hydroxy-4-conenin-3-on mit Erfolg für die Isolierung und Reinigung der Verbindung verwendet werden.

Das Salicylat hat folgende physikalischen Eigenschaften :

Schmelzpunkt: 247 bis 249"C (unter Zersetzen).

Elementaranalysc:

Berechnet ... C 72,35, H 8,30, N 2,91%;
gefunden ... C 72,31, H 8,30, N 2,91%.

B e i s ρ i e 1 2

Eine Mischung von 400 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen lla-Hydroxy-4-conenin-3-ons, 2 ml Methyljodid und 5 ml Methanol wurde 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Dann wurde noch 1 ml Methyljodid zugefügt und noch 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das Reaklionsgemisch wurde anschließend unter erniedrigtem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand in wenig Methanol gelöst. Nach Zusatz von Aceton kristallisierte das Produkt aus. Es wurde ablfitriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Es wurden 370 mg lla-Hydroxy-4-conenin-3-on-methyljodid erhalten. Umkristallisieren aus Methanol—Aceton lieferte ein Produkt mit F. 293,5 bis 294,5⁰C.

Analyse für C23H30O2NJ:

Berechnet... C 56,91, H 9,48, N 2,89, J 26,19%; gefunden ... C 57,12, H 9,63, N 2,63, .125,85%.

Beispiel 3

1670,1613; kein N — CE₃. NMR-Spektrum (CDCL₃; ό in ppm): 1,30 (C_i9 — H₃), 1,49 (C₂, — H₃; doublet), 2,99 (N· — CH₃), 3,32 (N® — CH₂), 3,70 (OH), 4,25 (Cn-H), 5,61 (C₄-H).

Analyse für C₂₄H₃₈NC^J:

Berechnet... C 57,72, H 7,62, N 2,81, J 25,45%; gefunden ... C 57,54, H 7,52, N 2,73, J 25,63% 57,50, 7,49, 2,70, 25,59%.

Beispiel 4

In analoger Weise wurde das nach Beispiel 1 erhaltene lln-Hydroxy-4-conenin-3-on mit Allylbroinid unter Bildung von lla-Hydroxy^-conenin-S-on-allylbromid umgesetzt; das Produkt stellt einen amorphen festen Stoff dar, der die folgenden physikalischen Eigenschaften besitzt: [a]„ — --98° (c =- 1% in Methanol); /._max (Methanol) = 241 ma; E}?_m = 292. IR-Spektrum (KBr; v_mil._r in cm"¹): 3325, 1667, 1612; kein N-CH₈. NMR-Spektrum [(CDi)₂SO; A in ppm]: 1,30 (C,9 — H₃), 1,50 (doublet; C₁ — H₃), 3,09 (NS-CH₃), 3,40 (N'--CH-), 3,60 (OH), 4,3 (Cn — H), 5,5 bis 6,2 (d — H und 3-Vinylprotone).

Analyse für C₂₅H₃₈NO₂Br:

Berechnet... C 64,66, H 8,19, N3,02, Br 17,24%; gefunden ... C 64,46, H 8,33, N 2,88, Br 17,32% 64,40, 8,30, 2,85, 17,29%.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung von llu-Hydroxy-

45

Eine Lösung von 1 g des nach Beispiel 1 erhaltenen llo-Hydroxy-4-conenin-3-ons in 20 ml Acetonitril wurde mit 4 ml Äthyljodid 5 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und anschließend unter erniedrigtem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol— Aceton umkristallisiert. Es wurden 540 mg 11 u-Hydroxy-4-conenin-3-on-äthy!jodid mit F. 248 bis 25O⁰C erhalten; [_a]„ = -i-93^o (c =- 1% in Methanol); kmax (Methanol) = 224 und 237m_(Jt; EJl - 398 bzw. 337. IR-Spektrum (KBr; v_mar in cm"¹): 3365, 4-conenin-3-on der Formel

HO

CH₃

CH₃

bzw. von Säureadditionssalzen oder quaternären Ammoniumverbindungen desselben, insbesondere seines Hydrojodids oder Salicylats, dadurch gekennzeichnet, daß man Conessin in Gegenwart von Sauerstoff der Wirkung von durch Züchten von Stachybotrys parvispora (Hughes) in einem Medium mit einem pH-Wert von mindestens 5 und einem Gehalt von mindestens 20 g eines assimilierbaren Kohlehydrats pro Liter gebildeten Enzymen aussetzt und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung nach an sich bekannten Methoden in ein Salz oder eine quatcrnäre Ammoniumverbindung umwandelt und gegebenenfalls das erhaltene Salz nach an sich bekannten Methoden in die freie Verbindung überführt.

709 638/577 (. 67 Q Bundesdruckerei Berlin