Verfahren zur Herstellung von epimeren a-Amino-benzylpenicillinen Im Hauptpatent Nr. 387 63.5 sind Penicillin- derivate mit wertvollen antibiotischen Eigenschaften beschrieben, welche erhalten wurden durch Ein führung einer Aminoacyl-Substituentengruppe in die
EMI0001.0008
worin Ph einen Phenylrest bedeutet.
Das Vorkommen eines asymmetrischen Kohlen stoffatoms (gekennzeichnet durch den Stern) in der Seitenkette dieser Verbindung zeigt an, dass sie in zwei optisch aktiven isomeren Formen vorkommen kann. Diese isomeren Formen sind Epimere und nicht enantiomorph im Hinblick auf die Tatsache, dass die bei der Synthese verwendete 6-Amino-penicillansäure ihrerseits eine optisch aktive Verbindung ist.
Der Ausgangsstoff, der zur Herstellung von a-Amino- benzylpenicillin bisher verwendet worden ist, war die optisch inaktive DL-Form der a-Amino-phenylessig- säure mit dem Ergebnis, d'ass das erhaltene Penicillin aus einem Gemisch der beiden Epimeren bestund. Die Isolierung, Reinigung und Prüfung eines solchen Pro duktes stellen schwierige Probleme und es ist als Handelspräparat wenig erwünscht, insofern als seine Zusammensetzung von Ansatz zu Ansatz variieren kann.
Die DL-a-Amino-phenylessigsäure wurde nun mehr zerlegt und ausgehend von den Zerlegungspro dukten zwei epimere Formen eines a-Amino-benzyl- penicillins hergestellt.
Das Patent betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 6-[D()a - Amino - phenylacetamido] - penicillan- Aminogruppe von 6-Amino-penicillansäure. Eine dieser Verbindungen ist ein a-Amino-benzylpenicillin mit der Strukturformel säure und 6-[L(-i-)a-Amino-phenylacetamido]-peni- cillansäure, welches dadurch gekennzeichnet ist,
dass 6-Amino-penicillansäure gekuppelt wird mit der D- oder L-Form einer a-Amino-phenylessigsäure, deren Aminogruppe geschützt ist, bzw. einem Salz einer sol chen Säure, worauf die schützende Gruppe unter mil den Reaktionsbedingungen abgespalten wird.
Die DL-a-Amino-phenylessigsäure wurde nach bekannten Verfahren zerlegt [Betei and Meyer, Ber. (l908) 41,<B>2073:</B> Ingersoll und Adams, J. Amer. Chem. Soc. (1925) 47, 1168]. Die beiden epimeren Formen wurden aus der D- und L-Form der Säure hergestellt (vg1. Schweizer Patent Nr. 387 635).
Zur Vermeidung einer Racemisi'erung werden zweckmässig während des ganzen Verfahrens milde Reaktionsbedingungen angewendet. Bei der Abspal tung der schützenden Gruppe müssen milde Reak tionsbedingungen eingehalten werden, damit eine Zer störung des Penicillin-Kerns unterbleibt. Die beiden verschiedenen Formen des a-Amino-benzylpenicillins wurden isoliert und in analytisch reiner Form erhal ten.
Die 6-[D(-)a-Amino-phenylacetamido]-penicil- lansäure erwies sich sowohl als besser wasserlöslich beim iso-elektrischen Punkt, wie auch als stärker aktiv gegenüber verschiedenen Arten von Bakterien in vitro als die 6-[L(--,)a-Amino-phenylacetamido]- penicillansäure.
<I>Beispiel 1</I> D(-)a - (Carbobenzyloxyamino)-phenylessigsäure Smp. 130-130,5 [a]D = 119,4 (C=3 in Äthanol) wurde hergestellt durch Einwirkung von Benzyl- chlorcarbonat auf eine eiskalte Lösung von D(-)a- Amino-phenylessigsäure in einem Äquivalent norma ler wässriger Natronlauge, wobei weitere Natronlauge zugesetzt wurde, um während der Dauer der Reak tion den pH-Wert zwischen 8 und 9 zuhalten.
4,8 ml Äthyl-chlorcarbonat wurden zu einer eis kalten Lösung von 14,3 g des vorstehend erwähnten Ca'rbobenzyloxy-derivats und 8,3 ml Triäthylamin in 420 ml trockenem Aceton hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei 0 5 Minuten lang gerührt, wobei Triäthyl- amin-hydrochlorid ausfiel und sich in der Lösung ein Mischanhydrid bildete.
Die Suspension wurde auf -50 abgekühlt und zu derselben unter kräftigem Rühren so schnell als möglich eine eiskalte Lösung von 13 g 6-Amino-penicillansäure in 420 ml 3 % iger wässriger Natriumbicarbonatlösung hinzugegeben, wo bei dafür gesorgt wurde, dass die Temperatur der Mischung nie über 0 C ansteigen konnte. Die er haltene klare Lösung wurde 30 Minuten lang bei 0 C gerührt, das Rühren weitere 30 Minuten lang fortgesetzt, während welcher Zeit die Temperatur der Lösung auf Raumtemperatur anstieg, wonach die Lösung schliesslich mit dreimal 400 ml Äther extra hiert und lediglich die wässrige Phase zurückbehalten wurde.
Die wässrige Lösung wurde auf einen pH-Wert von 2 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt und die dabei freigesetzte 6-[D(-)a-(Carbobenzyloxyamino)- phenylacetamido]-penicillansäure mit dreimal 150 ml Äther extrahiert.
Eine partielle Reinigung dieses Zwi schenproduktes wurde durchgeführt, indem es inForm des Natriumsalzes in wässriger Natriumbicarbonat- lösung reextrahiert wurde, worauf nach erneuter Einstellung des pH-Wertes auf 2 eine Extraktion der freien Säure mit Äther angeschlossen wurde. Schliess lich wurde das Produkt wieder in das Natriumsalz übergeführt, indem man die ätherische Lösung mit so viel 3 % iger Natriumbicarbonatlösung schüttelte,
um eine neutrale wässrige Phase zu erhalten. Die letztere wurde abgetrennt und bei niedriger Tempe ratur und niedrigem Druck verdampft. Das erhaltene Präparat wurde schliesslich über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet und stellte verhältnismässig reines Natrium - 6 - [D(-)a - (Carbobenzyloxyamino)- phenylacetamido]-penicillanat im Gewicht von 13 g dar. Das Präparat ergab bei der Papierchromato- graphie nur eine einzelne Zone antibiotischer Aktivi tät.
Eine Suspension von 125 ml, enthaltend 38 g Palladium (30; ö) auf Bariumcarbonat, wurde in einer Wasserstoffatmosphäre bei Zimmertemperatur und atmosphärischem Druck während einer Stunde ge schüttelt. Eine neutrale Lösung von 20,4 g Natrium- 6-[D(-)a-(Carbobenzyloxyamino) - phenylacetamido] - penicillanat in 250 ml Wasser wurde hiernach zuge geben und das Schütteln unter Wasserstoff eine wei tere Stunde lang fortgesetzt.
Die Suspension wurde filtriert und die vereinigten Filtrate und wässrigen Waschlösungen mit n-Salzsäure behandelt, um den pH-Wert auf 2 einzustellen, wonach dreimal mit 100 ml Äther gewaschen wurde. Die wässrige Phase wurde auf pH 4,65 vermittels 3%iger Natriumbicar- bonatlösung eingestellt und hierauf bei niedriger Tem peratur und niedrigerem Druck auf ein Volumen von ungefähr 5,0 ml eingeengt, wonach feine farblose Na deln sich abschieden.
Nach 30 Minuten wurden die Kristalle abgetrennt, mit ein wenig kaltem Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet. Man erhielt reines ö-[D(-)a-Amino- phenylacetamido]-penicillansäure-monohydrat im Ge wicht von 5,5 g, [a]D = -:- 281 (C = 1 in Was ser) Zersetzung bei etwa 202 C. Umkristallisieren aus Wasser veränderte die optische Drehung nicht.
EMI0002.0072
Analyse:
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 52,5 <SEP> % <SEP> H <SEP> 5,7 <SEP> % <SEP> N <SEP> 11,9
<tb> S <SEP> 8,9
<tb> Berechnet <SEP> für: <SEP> CICHi9N304S.HNO:
<tb> C <SEP> <B>52,3%</B> <SEP> H <SEP> <B>5,8%</B> <SEP> N <SEP> <B>11,9%</B>
<tb> S <SEP> 8,7 Weitere 9@ g weniger reinen Produktes wurden durch Konzentrieren des wässrigen Filtrates erhalten. Wie die erste Menge, gab dieses Produkt lediglich eine einzige Zone antibiotischer Aktivität bei der Papierchromatographie, welche sich von derjenigen unterschied, die mit dem nicht reduzierten Carbo- benzyloxy-Zwischenprodukt erhalten wurde.
<I>Beispiel 2</I> Die L(+)a-(Carbobenzyloxyamino) - phenylessib säure, Smp. 130-130,5 , [a]D = + 117 (C = 3 in Äthanol), wurde aus L(+)cc-Amino-phenylessig- säure nach der für sein Enantiomorphes beschrie benen Methode hergestellt.
Das erhaltene Produkt im Gewicht von 14,3g wurde in das Mischanhydrid mit Äthylchlorcarbonat übergeführt, wie dies vor stehend geschrieben worden ist und gekuppelt mit 6- Amino-penicillansäure (13 g), wobei 17,6 g eines ver hältnismässig reinen Natrium-6-[L(+)a-(Carboben- zyloxyamino)-phenylacetamido]-penicillanates erhal ten wurden. Das Produkt ergab eine einzelne Zone antibiotischer Aktivität bei der Papierchromatogra- phie.
Die Hydrierung dieses Zwischenproduktes wurde in derselben Art und Weise durchgeführt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben worden ist. Die erste Kristall menge im Gewicht von 6,2 g bestund aus reiner wasserfreier 6-[L(+)a-Amino-phenylacetamido]-pe- nicillansäure, [a]D = @ 209 (C = 0,2 in Wasser), Zersetzung bei etwa 205 C. Umkristallisieren aus Wasser änderte die optische Drehung nicht.
EMI0003.0001
Analyse:
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 54,9,% <SEP> H <SEP> 5,6% <SEP> N <SEP> 11,8
<tb> S <SEP> <B>9,2%</B>
<tb> Berechnet <SEP> für <SEP> C1r,H19N30=S:
<tb> C <SEP> 55,0 <SEP> % <SEP> H <SEP> 5,5 <SEP> % <SEP> N <SEP> 12,0
<tb> S <SEP> <B>9,2%</B> Weitere 6 g weniger reinen Produktes wurden erhalten durch Konzentrieren des wässrigen Filtrates. Wie die erste Menge, ergab dieses Produkt lediglich eine einzelne Zone antibiotischer Aktivität bei der Papierchromatographie, welche sich von derjenigen unterschied, die mit dem nichtreduzierten Carbo- benzyloxy-Zwischenprodukt erhalten wurde.
<I>Beispiel 3</I> Eine Menge von 7,25 g = 0,0256 Mol D(-)ia- (Carbobenzyloxyamino)-phenylessigsäure (Smp.128 bis 129 C), [a ]D =-116,5 [C = 1 in Alkohol] und 4,25 ml Triäthylamin wurden in 210 ml Aceton ge löst und bei 0 C 5 Minuten lang gerührt. Zum Ge misch wurden 2,4 ml = 0,0255 Mol Äthylchlor- formiat hinzugefügt und das Gemenge sofort in ein Trockeneis-Aceton-Bad von -510 C gesetzt.
Eine Lö sung 6,5 g = 0,030 Mol 6-Amino-penicillansäure und 16g Natriumbicarbonat in 210 ml Wasser wurden auf einmal hinzugefügt und das Gemisch vom Trok- keneis-Aceton-Bad entfernt, wonach eine halbe Stunde lang zwischen -10 und 0 und schliesslich eine weitere halbe Stunde lang bei Zimmertempera tur gerührt wurde. Die Lösung wurde mit einem Liter Äther verdünnt und die abgeschiedene wüssrige Schicht abgetrennt. Der pH-Wert wurde durch Zu gabe von konzentrierter Salzsäure auf 2 erniedrigt, und das Penicillin mit zweimal 3-00 ml Äther extra hiert.
Der Äther wurde mit Wasser und schliesslich mit 75 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung ge waschen. Die wässrige Bicarbonatlösung wurde mit 8 g 5 % igem Palladium auf Strontiumcarbonat (Engel- hard) versetzt und bei 3,5 kg/cm2 in einem Nieder druckreduktor nach Parr eine Stunde lang hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, und der pH-Wert des Filtrates durch Zugabe von konzentrierter Salz säure auf 2 erniedrigt,
wonach mit Äther extrahiert wurde. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 4,65 durch Zugabe von festem Natriumbicarbonat einge stellt und die Lösung unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe) bei 32 auf ein Volumen von 20 ml eingeengt. Es schied sich eine feste kristalline Substanz ab, die abfiltriert wurde und 2,85g wog.
Ein Gramm derselben wurde aus 1'0 ml Wasser um kristallisiert, indem der pH-Wert durch Zugabe weni ger Tropfen konzentrierter Salzsäure auf 2 erniedrigt wurde und hiernach wieder auf 4,65 vermittels festem Natriumbicarbonat erhöht wurde. Man erhielt 0,25 g des reinen 6-[D(-)a-Amino-phenylacetamid'o]-peni- cillansäure-monohydrates. Das Produkt schmolz bei 2010 C unter Zersetzung.
EMI0003.0054
Analyse <SEP> für <SEP> C1sH19N304S.H20: <SEP> N <SEP> 11,4 <SEP> %.
<tb> Gefunden: <SEP> N <SEP> 11,14%.
Spezifische Drehung [a]25 = + 287 C (C = 0,1 in Wasser).
Zu 5,5 g = 0,0193 Mol D()a-(Carbobenzyloxy- amino)-phenylessigsäure und 2,6 g = 0,0243 Mol <I>Beispiel 4</I> 2,6-Lutidin in 25 ml p-Dioxan und 25 ml trockenem Aceton wurden bei 0 C 1,83 ml<B>=O,0193</B> Mol Äthylchlorformiat hinzugegeben. Es entstund eine weisse Fällung und das Gemisch wurde 20 Minuten lang gerührt. Eine Lösung von 4,9 g 6-Arnino-peni- cillansäure in 50 ml Wasser und 15 ml 2,6-Lutidin wurde auf einmal hinzugefügt.
Die klare Lösung wurde eine halbe Stunde lang gerührt und mit 500 ml Äther verdünnt. Die wässrige Schicht wurde abge trennt und festes Natriumbicarbonat hinzugefügt zur Einstellung des pH-Wertes auf B. Der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde auf 2 erniedrigt durch Zu gabe von konzentrierter Salzsäure, wonach das Peni cillin mit Äther extrahiert wurde.
Die ätherische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und extrahiert mit 25 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung. Die Natriumbicarbonatlösung, welche das Penicillin ent hielt, wurde zu 10 g eines 5 % igen Palladium-Kata- lysators auf Diatomeenerde (Engelhard) hinzuge geben, wonach durch Zugabe von weiteren 15 ml Wasser eine Paste erzeugt wurde.
Das Penicillin wurde bei 3,5 kg/cm2 Druck in einem Niederdruck reduktor nach Parr während einer Stunde bei Zim mertemperatur hydriert. Infolge der Bildung eines Kolloids wurde das Gemenge durch Seitz-Filter fil triert. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von kon zentrierter Salzsäure auf 2 erniedrigt, wonach mit Äther extrahiert wurde, um das Ausgangspenicillin zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und ihr pH-Wert durch Zugabe von festem Natrium- bicarbonat auf 4,65 eingestellt.
Durch Verdampfen unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe), bei 32 C wurde das Volumen der Lösung auf 20 ml eingeengt. Das 6 - [D()a - Amino-phenylacetamido]- penicillansäure-monohydrat kristallisierte aus und wurde abfiltriert.
EMI0003.0104
Analyse <SEP> für <SEP> C1OH19N304S.H20: <SEP> N <SEP> 11,4 <SEP> %.
<tb> Gefunden: <SEP> N <SEP> 11,34%.
<I>Beispiel 5</I> Die in Beispiel 4 beschriebene Verfahrensweise wurde nachgearbeitet unter Verwendung von L('-, )ri- (Carbobenzyloxyamino) - phenylessigsäure [a125 = +g5,5' <B>(C=l</B> in Alkohol) anstelle von D(-)a- (Carbobenzyloxyamino)-phenylessigsäure. Anstatt von 5 % Palladium auf Diatomeenerde gemäss Beispiel 4,
wurde jedoch 5 % Palladium auf Strontiumcarbonat verwendet. Das 6-[L(+)a-Amino-phenylacetamido]- penicillansäure-monohydrat, welches hierbei erhalten wurde, wies folgende spezifische Drehung und Ele mentaranalyse auf: [a]25 = 2011 C (C = 0,197 in Wasser).
EMI0004.0001
Analyse <SEP> für <SEP> C16H13N204S.H20:
<tb> C <SEP> 52,3 <SEP> ö <SEP> H <SEP> 5,7 <SEP> ö <SEP> N <SEP> 11,4 <SEP> %.
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 52,44% <SEP> H <SEP> <B>5,69%</B> <SEP> N <SEP> <B>11,26%.</B> Die minimale inhibitorische Konzentration (M.
I. C.). in mg/ml in vitro gegenüber einer Anzahl von gram-negativen Mikroorganismen wurde be stimmt durch Verdünnungsreihen in Agar, wobei ein direkter Vergleich der Aktivität gegenüber diesen Organismen gemacht wurde zwischen 6 - [D()a - Amino - phenylacetamido] - penicillansäure (A),
6 - [L(+)a-Amino-phenylacetamido]-penicillansäure (B) und Penicillin G.
Die dabei erhaltenen Resultate befinden sich in der nachfolgenden Tabelle:
EMI0004.0024
M. <SEP> I. <SEP> C. <SEP> mg/ml
<tb> A <SEP> B <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb> <B>(710/"</B> <SEP> rein) <SEP> (93 <SEP> % <SEP> rein)
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 25,0
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 12,5 <SEP> 12,5 <SEP> 50,0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 25,0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 2,5 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0,5 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0,5 <SEP> 1,25 <SEP> 2,5
<tb> Salm. <SEP> typhi <SEP> 0,6 <SEP> 2,5 <SEP> 2,5
<tb> Salm. <SEP> typhimurium <SEP> 0,5 <SEP> 5,0 <SEP> 0,6
<tb> Salm. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 6,25
<tb> Sahn. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 5,0
<tb> Salm.
<SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 6,25
<tb> Salm. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 5,0 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb> Shigella <SEP> shigae <SEP> 1,25 <SEP> 5,0 <SEP> 5,0
<tb> Shigella <SEP> schmitzi <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 6,25
<tb> Shigella <SEP> Bonnei <SEP> 6,25 <SEP> 25,0 <SEP> 50,0
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 2,5 <SEP> 5,0 <SEP> 5,0