DE1242935B

DE1242935B - Verfahren zur Herstellung biologischer Insektizide

Info

Publication number: DE1242935B
Application number: DEJ17834A
Authority: DE
Inventors: Antoine Bonnefol
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1959-03-20
Filing date: 1960-03-16
Publication date: 1967-06-22
Also published as: FR1225179A; GB942462A; CH391373A; MC202A1; NL113053C; NL249632A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES #!# PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. σ.:

Deutsche Kl.:

AOIn

AOiN

O3/0

Nummer: 1 242 935

Aktenzeichen: J 17834IV a/451

Anmeldetag: 16. März 1960

Auslegetag: 22. Juni 1967

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologischen Insektiziden für die Bekämpfung von Insekten, die Pflanzenkulturen und Wälder befallen, wobei gegenüber Insekten pathogene Bazillus-Thuringiensis-Stämme bis zur Sporenbildung in einem belüfteten Medium gezüchtet und die gezüchteten Sporen und Toxine durch Zentrifugieren oder Filtrieren, vorzugsweise in Gegenwart von inerten Füllstoffen, abgetrennt werden. Dieses Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß ein Kulturmedium verwendet wird, das 1 bis 2 Vo Zucker und 0,6 bis lVooAminostickstoff enthält.

Es ist bereits bekannt, durch Sporen von pathogenen Bazillus-Thuringiniensis-Stämmen für die Land- und Forstwirtschaft schädliche Insekten zu bekämpfen. Es ist auch nicht mehr neu, derartige Sporen in einem Nährmedium zu züchten und zusammen mit den Toxinen von der verwendeten Nährlösung abzutrennen. Allerdings war es bisher nicht möglich, gleichzeitig sowohl die Sporen wie auch die Toxine von Bazillus-Thuringiensis-Stämmen in einer quantitativen Ausbeute zu gewinnen.

Dies wird erfindungsgemäß in überraschender Weise dadurch erzielt, daß ein Kulturmedium verwendet wird, das, wie vorstehend bereits erwähnt, etwa 1 bis 2°/o Zucker und etwa 0,6 bis 1 %>o AminostickstofT enthält. Diese Tatsache ist insofern besonders überraschend, als die optimalen Ausbeuten nur mit den angegebenen Aminostickstoff- und Zuckermengen erzielt werden, während sie, wie im folgenden noch gezeigt wird, bei kleineren bzw. größeren Mengen in merklicher Weise verschlechtert werden. Durch dieses erfindungsgemäße Verfahren wird also eine wirtschaftliche Herstellung von Sporen und Toxinen von Bazillus-Thuringiensis-Stämmen ermöglicht, die in Form der üblichen Suspensionen und Puder auf die zu schützenden Pflanzen aufgebracht werden können. Von den beiden Komponenten wirken bei der Insektenbekämpfung die Toxine durch unmittelbare Vergiftung und die Sporen durch Erzeugung einer Art von Blutvergiftung.

Die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht aus einer Kombination mehrerer Arbeitsgänge. Zunächst wird ein Stamm von gegenüber der zu bekämpfenden Insektenart pathogenen Bakterien in einem belüfteten oder nicht belüfteten flüssigen Medium, gegebenenfalls unter Rühren, vermehrt. Diese Nährflüssigkeit enthält Aminostickstoff und wenigstens einen Zucker. Sie kann außerdem gegebenenfalls Kationen enthalten, die von Spuren mineralischer Elemente abstammen. Die in dem Nährmedium gezüchteten Sporen und Verfahren zur Herstellung biologischer
Insektizide

Anmelder:

Institut Pasteur, Paris
Vertreter:

Dipl.-Ing. R. H. Bahr und DipL-Phys. E. Betzier,
Patentanwälte,
München 13, Alter St. Georgs Platz 9

Als Erfinder benannt:

Antoine Bonnefol, Bievres, Seine-et-Oise
(Frankreich)

Beanspruchte Priorität:

Frankreich vom 20. März 1959 (789944)

Toxine werden nach Beendigung des Züchtungsvorganges durch Zentrifugieren oder Filtrieren von der Nährflussigkeit abgetrennt. Das aus den Sporen und Toxinen bestehende Produkt wird getrocknet und entweder als solches oder m Form von Suspensionen oder Pudern verwendet.

Im einzelnen wird das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt:

1. Züchtung der Kulturen

Die Kulturen werden dadurch gezüchtet, daß ein Bazillus eines Thuringiensisstammes in einem flüssigen Nährmedium, das gegebenenfalls belüftet und/ oder gerührt werden kann, vermehrt wird. Das flüssige Medium enthält Aminostickstoff in einer Mengje von 0,6 bis lVoo, der aus Fleisch- oder Fleischpeptonen, Hydrolisaten von Blut, Casein, Milchserum, Soja- und Erdnußkuchen oder Maisabkochungen abstammen kann, wobei die vorstehend genannten Aminostickstoff liefernden Verbindungen allein oder in Mischung verwendet werden können. Daiiiber hinaus enthält das Nährmedium 1 bis 2°/o eines Zuckers; es kann Saccharose, Glucose, Maltose oder Dextrin verwendet werden. Außerdem sind in dem Nährmedium Spuren mineralischer Elemente, wie

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beispielsweise Calcium, Zink, Mangan und Magne- det werden. Die nach dem Trocknen und Mahlen

sium, enthalten. erhaltenen Produkte werden entsprechend den Nor-

Die Züchtung der Bazillen erfolgt in sogenannten men des »Laboratoire de lutte Biologjque et de Bice-Tiefbottichen. Das gegebenenfalls belüftete und/oder notique de la Miniere (I. N. R. A.)« standardisiert, gerührte Nährmedium wird bei einer Temperatur 5 Es wurden in geeigneten flüssigen, gegebenenfalls von 30° C gehalten, wobei sein pH-Wert zwischen belüfteten und/oder gerührten Nährmedien bei Tem-5,5 und 8,5 beträgt. Die Züchtung wird so lange peraturen um etwa 30° C Kulturen von Bazillusfortgesetzt, bis Sporen frei werden. Thuringiensis-Stämmen erzeugt.

Die Medien unterscheiden sich im wesentlichen

2. Abtrennung der gezüchteten Sporen und Toxine i° durch ihren Gehalt an Stickstoff sowie an Zucker, wie

dies in den nachstehenden Tabellen I und II im ein-

Die Abtrennung der gezüchteten Sporen und To- zelnen angegeben ist.

xine kann nach einer der im folgenden angegebenen Es wurden dabei die nachstehend angegebenen

Methoden durchgeführt werden: Medien eingesetzt:

a) mittels einer schnellaufenden Zentrifuge vom '⁵ „ ,. ,. , , _ „ _, Sharples-Typ, wobei ein halbfester Kuchen er- Kulturmedium auf der Grundlage von Käsern

zeugt wird; ^{uod Blut}

b) durch Abzentrifugieren in einer Abrahmzentri- Hydrolysat von trockenem Kasein .. 0,615 %o .v'.>fuge vom Alfa-Laval-Typ, wobei eine aus Spo- _aq Proteolysat von Blut in Pastenform.. 0,26 %>o

?: «ςπ und Toxinen bestehende konzentrierte Sus- Glucose io/

Ί pension erhalten wird; _x, , ,'. ''"" '.'" _Λ _°,

Vj t γ·, · · ι ,,ι T^ i_ Monokaliumphosphat 0,5%

c>di|fch Filtrieren mittels eines Vakuum-Dreh- iav r\ V c η

filters mit einer Filterschicht aus Diatomeen- Cau₂14tt₂U 1,5 mg/1

erde. *5 ^(SOA 0,2mg/l

, ^ . U-H₂SO₄ 0,01 mg/1

3. Trocknung MgSO₄-TH₂O l,23mg/l

Die Trocknung kann nach einem der nachstehend MnSO₄ · 4H₂0 0,0223 mg/1

beschriebenen Verfahren durchgeführt werden: ZnSO₄-7HO 0,14mg/1

1. durch Mischen des durch Zentrifugieren mittels ausreichende Menge Pottasche zur Einstellung eines einer schnellaufenden Zentrifuge vom Sharpies- pH-Wertes von pH = 7,2.

Typ erhaltenen Kuchens mit Bentonit-Tonen.

Das dabei in feinverteiltem Zustand erhaltene Kulturmedium auf der Grundlage von Maismaische

Produkt wird dann in einem Drehtrockner oder _JS p,^ _{Maismaische mit 50}._{/o Trocken}.

in einem belüfteten Trockenschrank getrocknet; substanz 4°/

2. durch unmittelbare Erhitzung des bei dem Zen- Glucose 1°/

trifugieren erhaltenen Kuchens in einer Vakuum- , . , ,· ■ V \ „ „ „,

Trocknungsvorrichtung, in der ein mechanisches Monokaliumphosphat 0,1 Vo

Rühren der zu erhitzenden Masse möglich ist; *° Mineralien und so viel Pottasche, daß ein

3. durch Einsprühen der beim Zentrifugieren in pH-Wert von 7,2 erreicht wurde.

einer Abrahmzentrifuge vom Alfa-Laval-Typ In den nachstehenden Tabellen I und Π bedeutet: erhaltenen konzentrierten Suspension in eine

gegebenenfalls unter Vakuum stehende Trock- N — «/o-Gehalt an Aminostickstoff

neigevorrichtung mit umlaufenden Trommeln; ⁴⁵ (nach Kjeldahl) im Nähnnediurn,

4. durch feine Zerstäubung der vorstehend erwähn- G — % an Glucose im Nährmedium,

ten Suspension; _{A = M des} ^_{6 m den vorstehenden}

5. durch Einfüllen des bei der Filtration mittels Beispielen beschrieben zentrifugierten eines Vakuum-Drehfilters mit einer Filterschicht _{50 und} getrockneten Kuchens, der die aus Diatomeenerde erhaltenen Produktes in _{s n und die Toxinkrista]le enthält)} einen umlaufenden oder pneumatischen Trock- _{m Gramm; diese} Gewichtsangabe ist auf ^ner· 1000 ml der Nährflüssigkeit bezogen;

4. Mahlen und Sieben _{B = die ZeU in Stunden>
nach deren Ablauf}

Die bei den vorstehend unter den Ziffern 1, 2 der Kuchen gesammelt wurde;

oder 5 beschriebenen Trocknungsverfahren anfallen- q = _d;_e z_{ert m} stunden, die vergeht, bis

den Produkte werden zunächst gemahlen und dann Sporen frei werden;

mittels eines Siebes, dessen Feinheit wenigstens der ,, . „ _ , , _ .._it. , _Λ ....

Nr. 180 entspricht, gesiebt. Die nach den unter den _6o ^Knstalle = Bestimmung der Quantität und Qualität

Ziffern 3 und 4 beschriebenen Trockenverfahren ^der ToxinknstaUe, die in der Nahr-

gewonnenen Produkte können in der Form, in der l°sung zum Zeitpunkt der Gewinnung

sie beim Trocknen anfallen, aufbewahrt und kon- Jj-It ^{vorha n sm} '^unter

ditioniert und später in einem in Wasser feinverteilten Mikroskop;

Zustand verwendet werden. Sie können jedoch auch 65 Toxizität — der Wert, wie er gemäß der Methode

ebenso wie die nach einem der unter den Ziffern 1, 2 des Institut National de la Recherche

oder 5 beschriebenen Trocknungsverfahren anfallen- Agronomique bestimmt wurde, ausge-

den Produkte mit oder ohne Füllstoffzusatz verwen- drückt in mg einer Normzubereitung.

Tabelle I

	0	0,04Vo	1	2	0	0,07Vo	2
G	2,05 70	1	3,5 59	4,5 70	1	6,2 90
A	64	3,5 64	47	63	5,25 70	72
B	3	47	2	4	63	+ + +
C	5		10	5
Kristalle
Toxizität

	0	Tabelle	I (Fortsetzung)	2	0	0,14Vo	2
	2,75 88	0,1V»	1	7,8 90	3,2 88	1	11,5 100
G	71	1	75	71	7 88	88
A		6,5 88	+ + + ■f		72
B	5	75	10	5		1
C				2
Kristalle	10
Toxizität

Tabelle II
Glucose 2,5%

	0,04Vo	0,07 «/o	IVo	1,4Vo
A	3,5 70 64	6,5 90 72 +	7,5 90 75 +	14 100 90
B	0	2	1	0
C
Kristalle
Toxizität

geringfügige Erhöhung des Glucosegehaltes von 2 auf 2,5% ergibt bei dem gleichen Stickstoffgehalt von 0,1 °/o einen um das 1Ofache geringeren Wert für die »Toxizität« (vgl. die entsprechenden Werte in den Tabellen I und II).

Diese experimentellen Werte aus den Tabellen I und II zeigen deutlich, daß die optimalen Resultate beim erfindungsgemäßen Verfahren nur dann erhalten werden, wenn die Nährmedien einen Aminostickstoffgehalt von 0,6 bis l°/oo und einen Zuckergehalt von 1 bis 2°/o aufweisen.

Aus der Tabelle I ersieht man, daß die für die gewerbliche Verwertung interessanten Resultate, d. h. diejenigen, bei denen die Toxizität bei nennenswertem Kuchengewicht (mehr als 5 g) höher als 5 liegt und die mit einer genügenden Menge gut ausgebildeter Kristalle gewonnen wurden (+ + +), in den Spalten 3 und 4 der Tabelle I zu finden sind, d. h. unter solchen Versuchsbedingungen gewonnen wurden, bei denen der Stickstoffgehalt 0,07 oder 0,1% betrug. Es ist überraschend zu sehen, wie die Resultate abfallen, wenn der Stickstoffgehalt auf 0,04% erniedrigt oder auf 0,14% erhöht wird. Die letztgenannten Bedingungen entsprechen etwa denen des bisherigen Standes der Technik.

Aus Tabellen erkennt man die ungünstige Wirkung eines zu hohen Glucosegehaltes. Hierbei kann man sehr gut die überraschende Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens erkennen: Eine relativ

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung biologischer Insektizide für die Bekämpfung von Insekten, die Pflanzen und Forstkulturen befallen, durch Züchten von gegenüber Insekten pathogenen Bazillus-Thuringiensis-Stämmen bis zur Sporenbildung in einem belüfteten Medium und Abtrennen der gezüchteten Sporen und Toxine durch Zentrifugieren oder Filtrieren, vorzugsweise in Gegenwart von inerten Füllstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kulturmedium verwendet wird, das 1 bis 2% Zucker und 0,6 bis l%o Aminostickstoff enthält.

In Betracht gezogene Druckschriften:
»Nachrichten aus Chemie und Technik«, Januar 1959, S. 21;
»Der Chemie-Markt«, Januar 1959, H. 1, S. 2.

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