DE1234930B

DE1234930B - Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes

Info

Publication number: DE1234930B
Application number: DEC34512A
Authority: DE
Inventors: Frans Cleon Goble
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1963-12-06
Filing date: 1964-12-01
Publication date: 1967-02-23

Description

Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen immunologischen Stoffes zum Schutze gegen die Chagaskrankheit, welche über 7 Millionen Menschen der westlichen Hemisphäre zwischen den Vereinigten Staaten von Amerika und Argentinien befällt. Im besonderen betrifft die Erfindung die zur Herstellung von Impfpräparaten notwendige Verwendung von gewissen physikalischen Methoden zur Zerstörung und Tötung der die Krankheit erregenden Organismen.
Der die Chagaskrankheit auslösende pathogene Organismus ist der Parasit Trypanosoma cruzi, welcher sich in drei verschiedenen Formen äußert, die je nach der gegebenen Umgebung vorkommen, die er zu verschiedenen Perioden seines Lebenszyklus einnimmt. Im Vertebratenwirt, d. h. im Menschen und im submenschlichen, gezähmten oder wilden Säugetier, kommt der Organismus in Kugelform in verschiedenen Zellen und Geweben, besonders im Herzmuskel, im Nervengewebe und im retikuloendothelialen System vor. In dieser sogenannten Leishmanienform vermehrt er sich durch wiederholte binäre Teilung, wobei er die von ihm bewohnte Zelle verletzt und dann zerstört, und als Resultat seine Nachkommenschaft in die Blutbahn entläßt, in welcher der Organismus in einer anderen Form auftritt, nämlich als Trypanosomform, welche spindelförmig und mit Geißeln versehen ist. Die Trypanosomen zirkulieren im Blut und dringen in neue Zellen ein, wo sie in die Leishmanienform zurückverwandelt werden und sich weitervermehren.
Der Parasit wird von Mensch zu Mensch, von Tier zu Tier, von Tier zu Mensch und von Mensch zu Tier durch das Einschalten eines Insektenvektors übertragen, nämlich durch Insekten (Hemiptera) der Familie der Reduviidae und Unterfamilie der Triatominae, bekannt im Englischen als »kissing bug«, im Spanischen als )>vichucas« und im Portugiesischen als »barbeiros«. Im Verdauungstrakt dieser Insekten kommt der Organismus in einer dritten, der Crithidia-Form vor, welche ebenfalls spindelförmig und mit Geißeln versehen ist; im Gegensatz zur Blutform kann die Crithidia-Form im künstlichen Medium kultiviert werden, wächst und vermehrt sich außerhalb des tierischen Wirtes bei einer Temperatur, welche derjenigen des Insektenkörpers und dessen Lebensumgebung entspricht. Durch parenterale Verabreichung an Vertebraten sind die aus Kulturen gewonnenen Crithidia-Formen in der Lage, Infektionen hervorzurufen, die mit jenen, welche mit den Crithidia-Formen aus dem Verdauungskanal der Insekten produziert werden, verglichen werden können.
Als ein Resultat von durch Inokulierung von lebenden Crithidia-Formen (entweder aus Kulturmedien oder aus Triatominae) oder von Blutformen aus infizierten Tieren haben Laboratoriumstiere, wie Mäuse und Hunde, die Entwicklung einer Immunität gegen spätere Infektionen gezeigt. Es ist allerdings bis jetzt ausgeschlossen, die Pathogenese im Menschen vorauszusagen, welche möglicherweise als Resultat einer Inokulation mit T.cruzi-Stämmen auftreten könnte, die für Tiere avirulent sind; dies hat die Möglichkeit einer Verwendung von lebenden Organismen im Menschen ausgeschlossen.
Eine Reihe von Forschern haben mitgeteilt, daß Experimente mit abgetöteten Parasiten als Impfstoff keine schützende Immunität erzeugen. M u n j z et al., Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 44, S. 529 (1946), beschreibt eine Vaccine, hergestellt aus Kulturorganismen, die in einer Lösung des Quecksilber(II)-salzes von Thiosalicylsäureäthylester in einer physiologischen Kochsalzlösung (1:10000) suspendiert waren. Der Versuch, Affen mit einem solchen Präparat gegen spätere Infektionen mit Parasiten aus dem Verdauungstrakt zu immunisieren, schlug fehl; die Autoren erzeugten Serumagglutinintiter, aber keine Schutzwirkung.
Hauschka et al., Am. J. Trop. Med., 30, S. 1 (1950), stellten Impfstoffe durch Behandeln entweder von Blutformen oder Kulturformen mit 0,3 0/ger Formalinlösung (0,12 01o Formaldehyd) in Ringer- Locke-Lösung, Zentrifugieren, Waschen und erneutem Suspendieren her. Solche Präparate waren zum Schutz von mit virulenten Blutformen behandelten Mäusen unwirksam.
K a g a n et al., J. Infect. Dis., 180, S. 213 (1961), gebrauchten eine Lösung von Quecksilber(II)-salz des Thiosalicylsäureäthylesters in physiologischer Kochsalzlösung (1:10000) mit Kulturorganismen des FH 5-Stammes und vermochte an Mäusen keinen Schutz gegen Blutformen des Tulahuenstammes zu erzeugen, obschon Kreuzimmunisierung zwischen diesen beiden Stämmen demonstriert werden konnte, wenn die Immunität durch aktive Infektion hervorgerufen wurde. H a u s c h k a et al. vertrat daher die allgemein gehaltene Ansicht, daß der wirksame Schutz nur von Antikörpern abhängt, welche durch eine aktive T.cruzi-Infektion produziert werden.
Zusätzliche, vom Erfinder selber ausgeführte Experimente, in welchen T.cruzi-Kulturorganismen auf chemischem Wege, z. B. durch Behandeln mit Benzalkoniumchlorid, Äthylenoxyd, Hydroxylamin, Phenol-Natriumazid oder Natriumsalze von Höheralkylsulfaten, sowie durch Hitzeeinwirkung abgetötet wurden, führte ebenfalls nicht zur Produktion von Impfstoffen, welche den Ablauf einer späteren experimentellen Chagaskrankheit beeinflußt hätten.
Es wurde nun gefunden, daß ein als Impfstoff mit ausgezeichneten immunisierenden Eigenschaften zum Schutz gegen Trypanosoma cruzi-Infektionen verwendbares Präparat dadurch hergestellt werden kann, daß man eine Suspension von aus Kulturmedien gewonnenen T.cruzi-Organismen in ihrer Crithidia-Form mit die Zerstörung der Zellstruktur herbeiführenden mechanischen Mitteln behandelt.
Das obige Verfahren kann z. B. so durchgeführt werden, daß man eine Suspension der Mikroorganismen in an sich bekannter Weise der Schallvibration (E d e b o, Acta Path. Microb. Scand., 52, S. 384 [1962]), dem Schütteln in Gegenwart von geometrischen Körpern aus verschiedenem festem Material, insbesondere aus Glas, und verschiedener Größe (wie z. B. von S h o c k m a n e t al., Biochem. Biophys.
Acta, 24, S. 203 [1957], beschrieben), oder dem Druck, mit nachfolgender Druckentspannung durch Freilassung der Suspension durch eine kleine Öffnung (wie z. B. von Milner et al., Science, 111, S.633 [1950], beschrieben) ausgesetzt.
In der Ausführung des Verfahrens der Erfindung geht man so vor, daß man als Mikroorganismen die Crithidia-Formen eines Trypanosoma cruzi-Stammes benutzt, die nach an sich bekannten Verfahren in einem die verschiedenen Nährstoffe enthaltenden Kulturmedium gezüchtet worden sind. Die zur Züchtung von T. cruzi-Organismen verwendeten Nährmedien sind bekannt; es scheint wesentlich zu sein, daß sie Substanzen enthalten, die im Blut von Säugetieren vorkommen. Quellen solcher Substanzen sind etwa Blut sowie Blutpräparate, z. B. entfibriniertes Blut, mit Zitronensäure oder Heparin behandeltes Blut, welche dem Nährmedium zugegeben werden und unter anderem das Hämin, sowie die Fettsäuren liefern.
Andere, zur Herstellung eines Nährmediums verwendbaren Nährstoffquellen sind solche, die üblicherweise in mikrobiologischen Verfahren verwendet werden; sie können natürlicher oder synthetischer Herkunft sein. Solche natürlichen Typs sind Fleischextrakte, besonders Extrakte aus Organen, wie Gehirn- oder Herz-, z. B. Herzmuskelextrakte von Säugetieren, sowie Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Sojabohnenmehl oder wasserlösliche Anteile von Maiskörnern. Synthetische Stoffe sind z. B. Nitrate oder Ammoniumverbindungen. Kohlenstoff enthaltende, als Energiequellen dienende Materialien können Lipoide, wie z. B. Stearin- oder Behensäure, welche auch durch die Blutpräparate geliefert werden, sein, oder andere, diese Fettsäuren oder ihre Ester enthaltende Fettquellen. Einfachere organische Materialien, wie Zucker (z. B. Glukose, Fructose, Saccharose oder Lactose) oder Glycerin, sowie Dextrine, Stärken oder Molken können ebenfalls verwendet werden. Selbstverständlich können Gemische dieser Stoffe, die entweder in reiner oder angereicherter Form vorliegen können, angewendet werden. Dem Kulturmedium können auch gewisse Spurenelemente, wie Phosphor (z. B. als Dinatriumphosphat), Magnesium oder Eisen, zugefügt werden.
Das Nährmedium wird durch Vereinigen und Mischen der Bestandteile hergestellt und durch Zugabe von Wasser auf das erwünschte Volumen gebracht; gewöhnlich wird das Gemisch erhitzt und zu einer einheitlichen Lösung filtriert.
Letztere wird dann mit den Crithidia-Formen von in gleicher Weise gezüchteten, lebenden T. cruzi-Organismen inokuliert; gewöhnlich werden etwa 30000000 bis etwa 100000000 Organismen pro Milliliter zu Inokulationszwecken verwendet. Die Züchtung erfolgt bei Zimmertemperatur, d. h. zwischen etwa 20 und 25"C. Ein besseres Wachstum kann erhalten werden, indem man die Kulturen schüttelt anstatt stehen läßt. Dies kann durch eine Rotationsmaschine (mit einer Umdrehungszahl von etwa 60 Umdrehungen pro Minute) oder in einer Schüttelmaschine (bei etwa 60 Bewegungen pro Minute) oder einem ähnlichen Apparat erreicht werden.
Die beste Ausbeute erhält man in 9 bis 11 Tagen.
Die Organismen werden nach an sich bekannten Verfahren, z. B. durch Zentrifugieren, geerntet und normalerweise gewaschen, z. B. mit einer physiologischen Lösung, wie Lockes Lösung (G a d d u m, Pharmacology, S. 15, dritte Auflage, 1949, Oxford Press), oder irgendeiner anderen, z. B. physiologischen Kochsalzlösung.
Das Ausgangsmaterial, welches zur Zerstörung der Zellstruktur der Organismen mit geeigneten mechanischen Mitteln behandelt wird, wird so hergestellt, daß die in Crithidia-Form aus dem Kulturmedium gewonnenen T. cruzi-Organismen erneut suspendiert werden, vorzugsweise in einer physiologischen Lösung, wobei eine geringere Menge der flüssigen Phase, z. B. etwa ein Zehntel des ursprünglichen Kulturvolumens, verwendet wird. Die Suspension enthalt ungefähr 200000000 bis etwa 600000000 T. cruzi-Organismen in ihrer Crithidia-Form pro Milliliter und kann zusätzlich ein die Oxydation verhinderndes Mittel enthalten. Bevorzugte Antioxydationsmittel sind Thiolverbindungen, wie Glutathion, Mercaptoäthanol oder Cystein; die zur physiologischen Lösung gegebene Menge Antioxydationsmittel ergibt eine etwa 0,01- bis molare, insbesondere eine etwa 0,1molare Lösung.
Die so erhaltene Suspension wird dann der Behandlung mit einem zur Zerstörung der Zellstruktur geeigneten mechanischen Mittel, z. B. Schallvibration, Schütteln mit geometrischen Körpern oder Druck, gefolgt von nachfolgender Druckentspannung durch Freilassung der Suspension durch eine kleine Öffnung, unterworfen.
Das erhaltene Homogenat toter Organismen wird auf Sterilität geprüft (entweder mikroskopisch oder durch Züchtung) und wird direkt als Impfstoff mit immunisierenden Eigenschaften gegen Infektionen mit Trypanosoma cruzi (Chagaskrankheit) angewendet. Es kann für nachträgliche Verwendung bei tiefen Temperaturen, vorzugsweise bei -70°C oder darunter gelagert werden.
Die immunisierenden Eigenschaften des erhaltenen Impfstoffes werden wie folgt geprüft: Das Homogenat wird Mäusen subkutan verabreicht, wobei 0,5 bis 1,0 ml des Präparates, welches die Produkte von 50 bis 600 Millionen Zellen enthält, verwendet wird.
Die Mäuse werden nachträglich mit einer intraperitonealen Inokulation von virulenten Blutformen von T. cruzi behandelt, welche man von früher infizierten Mäusen erhält; verschiedene Infektionsdosen mit 5000 bis 1 Million Trypanosomen werden verabreicht. Unbehandelte Kontrollmäuse sterben regelmäßig vom 15. Tag der Infektion an; die durchschnittliche Überlebenszeit beläuft sich in verschiedenen Experimenten auf 21 bis 37 Tage. Geimpfte Tiere haben eine stark verlängerte Überlebenszeit, und bis zu 1000/o überleben eine unbestimmte Experimentdauer, ohne Anzeichen der Krankheit zu zeigen, welche alle ungeimpften Kontrolltiere tötet.
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
Beispiel 1 Ein Kulturmedium wird durch Kombination der folgenden Bestandteile hergestellt.
Bestandteile (für 1000 ml Kulturbrühe) Extrakt aus Kalbsgehirn ........... 200,0 g Extrakt aus Rinderherz ............ 250,0 g Pepton .......................... 10,0 g Kochsalz ........................ 5,0 g Dinatriumphosphat ............... 2,5 g Dextrose ........................ 2,0 g Entfibriniertes Schafblut ........... 100,0 g Wasser bis zum Volumen von 1000,0 mi Das Gemisch der obengenannten Bestandteile wird gekocht und durch Filterpapier filtriert, um das beim Erhitzen entstandene Koagulat zu entfernen. Ein Kulturmedium kann auch durch Beifügen von 10°/o kommerziell erhältlichem entfibriniertem Schafblut zu einem dehydratisierten Gehirn-Herz-Extrakt (erhältlich aus verschiedenen kommerziellen Quellen) hergestellt werden. 250-ml-Portionen des Filtrats werden in Erlenmeyer-Flaschen (1000ml) abgefüllt und unter einem Druck von etwa einer Atmosphäre während 30 Minuten sterilisiert.
Nach dem Abkühlen wird jede Flasche mit etwa 125 Millionen Organismen aus einer 10 Tage alten T. cruzi-Kultur inokuliert. Die so behandelten Flaschen werden bei 22° C auf einer Rotationsmaschine bei etwa 60 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Nach 10 Tagen wird der Flascheninhalt bei 1500 Umdrehungen pro Minute während 20 Minuten und in der Kälte (-5°C) zentrifugiert, die überstehende Lösung wird abgegossen und verworfen, und die überbleibenden Zellen werden zweimal mit Lockes Lösung gewaschen und dann in einem Zehntel des flüssigen Originalvolumens suspendiert.
Zur so erhaltenen Suspension, die pro Milliliter etwa 300 Millionen Zellen der Crithidia-Form von T. cruzi enthalten, wird so viel Glutathion zugegeben, daß man eine 0,1molare Lösung des Antioxydationsmittels erhält. Das erhaltene Gemisch wird in die Kammer eines magnetorestriktiven Oszillators (Raytheon Model DF-101) gegeben und während 20 Minuten einer Frequenz von 10 kc pro Sekunde ausgesetzt. Die flüssige Phase wird dann mikroskopisch untersucht und enthält keine ganzen oder lebenden Zellen. Proben des erhaltenen Präparates werden auf Sterilität im oben beschriebenen Medium kultiviert. Diese Kulturen werden bei 22"C inkubiert und nach 2 und 4 Wochen auf Wachstum geprüft.
Die nach dem obigen Verfahren erhaltenen Präparate sind frei von lebenden Organismen.
Gruppen von 15 Mäusen werden mit 1-ml-Dosen des erhaltenen Homogenates injiziert, und 3 Wochen später werden alle Mäuse mit etwa 5000 virulenten Blutformen von T. cruzi behandelt, welche von einer vorher infizierten Maus stammen. Die Kontrollmäuse, welche zur Zeit der Impfstoffabgabe lediglich mit einer 0,1molaren Glutathionslösung in Lockes Lösung inokuliert wurden, sterben binnen 22 bis 40 Tagen (Durchschnitt: 31 Tage). Die Resultate der Impfung können wie folgt zusammengefaßt werden:

Überlebende

Gruppe Injektionspräparat nach

60 Tagen

1 T. cruzi-Homogenat 14/15

entsprechend

600 Millionen Zellen

2 Lockes Lösung mit 0/15

0,1 Mol Glutathion

Beispiel 2 Die Herstellung der T. cruzi-Kultur, die Isolierung und das Waschen der Zellen und deren Suspension in Lockes Lösung werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, vorgenommen, außer daß die Suspension der gewaschenen Zellen in einer 0,1molaren Lösung von Glutathion in Lockes Lösung ungefähr 1200 Millionen Organismen pro Milliliter enthält. Dieses Präparat wird in den Metallzylinder eines Shockman-Apparates (Shaker Head Nr. 6007) in einer gekühlten International Zentrifuge (PR 1) gebracht und wird während 10 Minuten mit Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 0,028 bis 0,038 cm (Ballotini) geschüttelt.
Die Lösung wird dann mikroskopisch untersucht und enthält keine ganzen oder lebenden Zellen. Proben des Präparates werden auf Sterilität, wie im Beispiel 1 angegeben, geprüft und sind frei von lebenden Organismen. Zur Entfernung des Homogenates von den Glaskügelchen wird eine dem Originalvolumen äquivalente Menge Lockes Lösung gebraucht, so daß das endgültige Präparat die zerstörten Produkte von etwa 600 Millionen Organismen pro Milliliter enthält.
Dieses Material wird dann in Dosen von 1 ml 15 Mäusen injiziert, und 15 Mäuse werden in gleicher Weise mit einer 0,1molaren Glutathionlösung in Lockes Lösung behandelt und als nicht geimpfte Kontrolltiere verwendet. Nach 3 Wochen werden den Mäusen durch intraperitoneale Injektion etwa 20000 virulente Blutformorganismen von T. cruzi von vorher injizierten Mäusen verabreicht. Die Kontrolltiere sterben binnen 20 bis 45 Tagen (Durchschnitt: 26 Tage); alle geimpften Mäuse überleben die 60 Tage der Testperiode.
Der oben beschriebene Shockman-Apparat kann durch andere zur Zerstörung der Zellstruktur von Organismen geeignete Apparattypen, wie solche mit kleinen Glaskugeln (z. B. der Mickle-Apparat, beschrieben von M i c k 1 e, J. Roy. Microscop. Soc., 68, S. 10 [1948], oder Mikromühlen, beschrieben von G a r v e r et al., Applied Microbiol., 7, S. 318 [1959], und O'C o n n o r et al., Canad. J. Microbiol., 6, S. 233 [1960]), oder solche mit größeren Kugeln (z. B. Kugelmühlen, wie von M u d d, J. Immun., 32, S. 483 [1937], beschrieben) und ähnliche Apparate ersetzt werden.
Beispiel 3 Die beiden vorher beschriebenen Methoden zur Zerstörung der Zellstruktur von T. cruzi-Organismen in ihrer Crithidia-Form, d. h. die Schallbehandlung nach Beispiel 1 und die Ballotini-Methode nach Beispiel 2, können durch die Methode, welche Druck und darauffolgendes Druckentspannen durch Freilassung der Suspension durch eine kleine Öffnung verwendet, ersetzt werden. Das Züchten der Organismen wird wie im Beispiel 1 beschrieben vorgenommen, und die isolierten Zellen werden gewaschen und in einer 0,1molaren Glutathionlösung in Lockes Lösung suspendiert. Die so erhaltene Suspension wird in der von M ii n e r et al., a. a. 0., beschriebenen Druckzelle einem Druck von bis zu 850 Atmosphären ausgesetzt. Nach dem Freilassen der Suspension durch eine schmale Öffnung wird das erhaltene Homogenat mikroskopisch, sowie im Sterilitätstest untersucht und enthält keine ganzen oder lebenden Zellen. Es wird, wie oben beschrieben, direkt zur Impfung verwendet; die Kontrolltiere sterben binnen 20 bis 45 Tagen, während die geimpften Tiere die 60 Tage des Experimentes überleben.
Die obige Druckzelle (French Pressure Cell) kann durch andere zellzerstörende Apparate ersetzt werden, welche auf der Basis der Freilassung einer unter Druck stehenden Suspension von T. cruzi-Organismen durch eine kleine Öffnung arbeiten, wie z. B. die von Milner et al., Science, 111, S.633 (1950); Hughes, Brit J. Exp. Path., 32, S. 97 (1951); E a t o n, J. Back., 83, 5. 1359 (1962), und R a p e r et al., J. Bact, 85, S. 712 (1960), beschriebenen Apparate, oder andere Zellzerstörungsapparate, wie der von Frazer, Nature, 167, S. 33 (1951), beschriebene und von R e y n i e r s et al., J. Nat. Canc. Inst., 25, S. 663 (1960), abgeänderte Apparat.

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung eines als Impfstoff mit immunisierenden Eigenschaften zum Schutz gegen Trypanosoma cruzi-Infektionen verwendbaren Präparates, d a d u r c h g e k e n n -z ei c h n e t, daß man in an sich bekannter Weise eine Suspension von aus Kulturmedien gewonnenen T. cruzi-Organismen in ihrer Crithidia-Form mit die Zerstörung der Zellstruktur der Organismen herbeiführenden mechanischen Mitteln behandelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension der T. cruzi-Organismen einer zur Zerstörung der Zell struktur der Organismen geeigneten Schallvibration ausgesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension der T. cruzi-Organismen einem zur Zerstörung der Zellstruktur der Organismen geeigneten Schütteln in Gegenwart von geometrischen Körpern aus festem Material ausgesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Suspension der T. cruzi-Organismen einem zur Zerstörung der Zellstruktur der Organismen geeigneten Druck, gefolgt von Druckentspannung durch Freilassung der Suspension durch eine kleine Öffnung, ausgesetzt wird.