DE1222489B - Verfahren zur Abtrennung von reinem Kanamycin A - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND,

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C07c

Deutsche Kl.: 12o-6

Nummer: 1222489

Aktenzeichen: M 42620IV b/12 ο

Anmeldetag: 3. September 1959

Auslegetag: 11. August 1966

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung des wertvollen Antibiotikums Kanamycin A aus rohen Gemischen oder Lösungen, wie sie bei der fermentativen Herstellung von Kanamycin anfallen, die Kanamycin A, das unerwünschte, etwas stärker toxische Kanamycin B und andere Stoffe enthalten, die in solchen rohen Gemischen anwesend sein können.

Kanamycin, ein durch Fermentation verschiedener Stämme von Streptomyces kanamyceticus erzeugtes Antibiotikum, besitzt antibiotische Wirksamkeit gegen verschiedene Arten von grampositiven und gramnegativen Bakterien. Diese wertvollen antibiotischen Eigenschaften sind auf die Anwesenheit eines Stoffes zurückzuführen, der als »Kanamycin A« bezeichnet worden ist. Dieser Stoff besitzt die folgende chemische Struktur:

CH.NH.

HO M

HO

Verfahren zur Abtrennung von reinem
Kanamycin A

Anmelder:

Meiji Seika Kaisha, Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr. W. Kühl, Patentanwalt,

Hamburg 36, Esplanade 36 a

Als Erfinder benannt:

John William Rothbrock, North Plainfield, N. J.; Irving Putter, Martinsville, N. J. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 12. September 1958
(760 660)

NH₂

NH_a

H₈N

OH

Kanamycin A

Kanamycin A tritt in den Fermentationsprodukten im Gemisch mit anderen Formen von Kanamycin, deren Strukturen noch unbekannt sind, und mit verschiedenen anderen Stoffen auf, zu denen wasserunlösliche Stoffe, Salze und gefärbte Verunreinigungen gehören. Die Form von Kanamycin, die in der größten Menge zusammen mit Kanamycin A vorkommt, wird als »Kanamycin Β« bezeichnet. Eine andere Form von Kanamycin, die als »Kanamycin C« bezeichnet wird, findet sich in verhältnismäßig geringen Mengen. Während Kanamycin A eine wertvolle antibiotische Wirksamkeit aufweist, hat sich herausgestellt, daß Kanamycin B zwar ebenfalls antibiotische Eigenschaften besitzt, jedoch etwas stärker toxisch ist als Kanamycin A. Deshalb ist die Anwesenheit von Kanamycin B als Verunreinigung des Kanamycins A unerwünscht. Die Toxizität von Kanamyein C, welches noch nicht isoliert wurde, ist unbekannt.

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von Kanamycin A und Kanamycin B sind so ähnlich, daß die Trennung dieser beiden Verbindungen voneinander äußerst schwierig ist. Die Eigenschaften von Kanamycin C sind sehr ähnlich denjenigen von Kanamycin B, und die Bezugnahme auf Kanamycin B in der nachfolgenden Beschreibung bezieht sich auch auf Gemische von Kanamycin B und Kanamycin C.

Die üblichen Trennverfahren sind nur von geringem Wert für die Trennung von Kanamycin A und Kanamycin B. Durch Kristallisation der Verbindungen selbst oder verschiedener bekannter Salze derselben lassen sich die Stoffe z. B. nicht in zufriedenstellender Weise voneinander trennen. Kanamycin A und Kanamycin B sind bereits durch Gegenstromverteilung der Salicylidenderivate des rohen Kanamycingemisches unter Verwendung eines aus Methanol, Wasser, Chloroform und Benzol im Verhältnis 5:4:2:1 bestehenden Systems voneinander getrennt worden; dieses Verfahren ist jedoch für die großtechnische Durchführung nicht zufriedenstellend, weil es um-

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3 4

ständliche Verfahrensschritte erfordert, die sich nicht praktisch, mit einer über den oben angegebenen Beleicht durchführen lassen.· -·.-". ;.. :'. ..;■ reich hinausgehenden Konzentration zu arbeiten,

Ein Zweck der Erfindung ist daher die Schaffung weil die Dichte der stärker konzentrierten Lösungen eines Verfahrens, welches es gestattet, Kanamycin A so groß ist, daß das leichtere Harz durch die Bevon Kanamycin B und anderen Stoffen zu trennen, 5 schickungslösung verdrängt wird. Es wurde beobachsich leicht auf eine Arbeitsweise im großtechnischen tet, daß in diesen Fällen der obere Teil der Harz-Maßstabe übertragen läßt und sich wirtschaftlich und säule auf der Beschickungslösung schwimmt. In den verhältnismäßig leicht durchführen läßt. bevorzugten Konzentrationsbereichen verläuft jedoch

Ein weiterer Erfindungszweck ist die Schaffung das chromatographische Verfahren so, daß man hineines solchen Verfahrens, welches imstande ist, Kana- io reichend dichte Adsorptionsstreifen erhält und das mycin A in praktisch reiner, für die pharmazeutische Harz durch die Beschickung nicht aus der Säule verAnwendung geeigneter Form zu isolieren. drängt wird.

Dies wird erfindungsgemäß mittels eines chromato- Es wurde mit hohen Beladungen von etwa 1 g Ka-

graphischen Verfahrens erreicht, bei dem eine Lösung namycin je 25 ecm Harz gearbeitet; im allgemeinen

von Kanamycin A und Kanamycin B langsam durch 15 werden jedoch etwas niedrigere Beladungen bevor-

ein stark basisches Anionenaustauschharz perkoliert zugt. Eine Beladung von 1 g je 50 ecm Harz liefert

wird, worauf das Kanamycin A und das Kanamycin B z. B. eine scharfe Trennung ohne Uberbeladung des

gesondert und selektiv aus dem Harz eluiert werden. Harzes.

Es wird angenommen, daß Kanamycin A und Kana- Die besonderen Harze, die sich als geeignet für

mycin B in einer chromatographischen Säule geson- 20 die chromatographische Trennung des Kanamycins A

derte Streifen bilden, wenn eine diese Verbindungen vom Kanamycin B erwiesen haben, lassen sich als

enthaltende Lösung langsam durch die Säule perko- poröse Anionenaustauschharze von der Art der stark

liert wird. Beim Eluieren erfolgt die Entwicklung basischen quaternären Amine kennzeichnen. Es ist

der Säule derart, daß das beweglichere Kanamycin B eine große Anzahl derartiger Harze bekannt. Beispiele

vor dem weniger beweglichen Kanamycin A bevor- 25 hierfür sind »Amberlite IRA-400«, »Amberlite IRA-

zugt eluiert wird. Durch Auffangen von Fraktionen 401«, »Dowex l-x2«, »Dowex 2-x4« und »Permutit

des Eluates istes also, möglich, das gewünschte Kana- SK« (Handelsnamen). Auch andere Anionenaus-

mycin A vollständig von dem unerwünschten Kana- tauschharze dieses allgemeinen Typs können verwen-

mycin B zu trennen. det werden. Die Korngröße des Harzes ist nicht kri-

Für die Zwecke der Erfindung kann das dem 30 tisch. Mit Harzen einer Korngröße zwischen 0,42

chromatographischen Trennverfahren unterworfene . und 0,074 mm wurden zufriedenstellende Ergebnisse

Känamycingemisch eines der verschiedenen, Kanä- erzielt Alle Harze werden in der Hydroxylform ver-

mycin enthaltenden Gemische sein, die bei den ver- wendet.

schiedeüen Stufen des zur fermentativen Herstellung Nachdem die Harzsäule mit der Beschickungs-

yon Kanamycin dienenden Verfahrens anfallen. Man 35 lösung überschichtet worden und die Lösung in die

kann zwar-das rohe Fermentationsprodukt, welches Harzsäule eingesickert ist, wird das Harz sorgfältig

die verschiedenen Kanamycine und andere Verunrei- mit Lösungsmittel überschichtet und dann die ge-

nigungen enthält, unmittelbar dem chromatographi- wünschte Strömungsgeschwindigkeit innegehalten,

sehen Trennverfahren zuführen; zweckmäßiger ist es um die Säule durch Eluieren des Kanamycins A und

jedoch, zu diesem Zwecke eine gereinigte Lösung zu 40 des Kanamycins B aus dem Harz zu entwickeln, ohne

verwenden, da stark gefärbte Verunreinigungen das das Harzbett aufzurühren.

Harz vergiften können und Salze das Harz in die Als Lösungsmittel für die Entwicklung der Säule

Salzform überführen, die chromatographisch nicht hat sich destilliertes Wasser oder Leitungswasser als

verwendbar ist. zufriedenstellend erwiesen. Man kann auch mit

Zur Herstellung aus einer gereinigten Lösung, für 45 wäßrigen Lösungen organischer Lösungsmittel, z. B.

die hier kein Schutz beansprucht wird, wird die Fer- mit wäßrigen Lösungen von Alkoholen oder Keto-

mentationsflüssigkeit zunächst filtriert, um feste Ver- nen, wie Methanol oder Aceton, arbeiten. So stellt

unreinigungen zu entfernen, und dann werden die Wasser mit einem Zusatz von 5°/o Methanol ein zu-

■Kanamycine an einem sauren Kationenaustauschharz friedenstellendes Lösungsmittel dar. Man kann auch

adsorbiert und mit einer schwachen Base, wie Ammö- 50 höhere Konzentrationen an mit Wasser mischbaren

niak, eluiert, um verschiedene Salze und andere far- organischen Lösungsmitteln verwenden; bei zu hohen

bige Verunreinigungen zu entfernen. Das Eluat von Konzentrationen können jedoch die Kanamycine in

dieser ersten Harzreinigungsstufe wird dann stärker der Säule auskristallisieren.

entfärbt; z.B. mit Aktivkohle. Hierauf werden die Die Strömungsgeschwindigkeit des zur Entwick-Kanamycine aus dem entfärbten Eluat durch Zusatz 55 lung dienenden Lösungsmittels durch die Harzsäule von Methanol als Sulfate auskristallisiert. Die so er- kann innerhalb gewisser Grenzen variieren und richtet haltenen Monosulfate werden in Wasser gelöst und sich nach der Größe der jeweiligen Anlage. Bei zu durch eine Säule von basischem Antionenaustausch- hohen Strömungsgeschwindigkeiten wird das Gleichharz, wie »Amberlite IRA-401«, geleitet, wodurch die gewicht zwischen dem Harz und der Lösung nicht Monosulfatlösüng entfärbt wird und die freien Basen 60 erreicht. Zu niedrige Strömungsgeschwindigkeiten entstehen. sind zeitraubend. Eine Säule mit einem 76 cm hohen

Die Beschickung enthält vorzugsweise etwa 5 bis Harzbett von 400 ecm »Dowex l-x2« (Handelsname)

50% Gesamtfeststoffe. Unterhalb dieses Feststoff- kann z.B. bei einer Strömungsgeschwindigkeit von

bereiches benötigt man ein so großes Volumen, daß 3,5 ccm/Min. entwickelt werden. Für das gleiche

die Durchführung des Verfahrens unpraktisch wird. 6g System ist eine Strömungsgeschwindigkeit von

Oberhalb dieses Bereiches findet Kristallisation statt. 7 ccm/Min. zu hoch.

Obwohl man bei höheren Konzentrationen eine bes- Beim Eluieren der chromatographischen Säule er-

sere chromatographische Trennung erzielt, ist es nicht hält man zunächst als Vorlauf die Flüssigkeit aus

den Hohlräumen der Harzsäule, die anorganische Hydroxyde enthält. Dann folgt das Kanamycin B, hierauf ein Gemisch von Kanamycin B und Kanamycin C und schließlich das Kanamycin A, welches das am wenigsten bewegliche Kanamycin ist.

Der Verlauf der Eluierung kann an einem Papierstreifenchromatogramm der verschiedenen eluierten Fraktionen unter Zuhilfenahme eines roten Farbstoffes verfolgt werden (vgl. J. W. Rothrock und Mitarbeiter, »Antibiotics Annual«, 1958/1959, S.798). Das weniger bewegliche Kanamycin A erscheint dann als roter Fleck mit einem R₁-Wert von 0,15 bis 0,22 und das beweglichere Kanamycin B als roter Fleck mit einem R_f-Wert von 0,25 bis 0,40. Die Beweglichkeit des Kanamycins C liegt etwa in der Mitte zwischen diesen beiden Werten.

Ein typisches Chromatogramm ist in F i g. 1 dargestellt, wo die Eluatfraktionen von 6 bis 19 numeriert sind und der mit der Bezeichnung »A + B« versehene Streifen durch Entwickeln eines hergestellten Testgemisches von Kanamycin A und Kanamycin B erhalten wurde. Aus dieser Figur ist ersichtlich, daß das Kanamycin B in den Fraktionen 8 bis 12 und teilweise in der Fraktion 13 erscheint, während Kanamycin A in den Fraktionen 14 bis 19 und zum Teil ebenfalls in der Fraktion 13 erscheint. In diesem Beispiel war die Konzentration an Kanamycin C so niedrig, daß dieser Stoff in dem Chromatogramm nicht festgestellt werden konnte. Die Fraktionen 14 bis 19 enthalten also Kanamycin A, welches nicht durch Kanamycin B verunreinigt ist.

Obwohl die Entwicklung von Papierstreifenchromatogrammen eine Möglichkeit an die Hand gibt, zu bestimmen, wann die Eluierung von Kanamycin A beginnt, ist diese Methode jedoch zur laufenden Betriebskontrolle des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht geeignet, weil die Entwicklung der Papierstreifen zu lange Zeit benötigt.

Auch die Bestimmung des Gesamtfeststoffgehaltes in dem Eluat als mg Feststoffe je Kubikzentimeter Eluat, wobei der Gesamtfeststoffgehalt an dem Punkt ein Minimum erreicht, bei welchem das Kanamycin A in dem Eluat zu erscheinen beginnt, leidet an dem Nachteil, daß die Zeit zur Gewinnung der gewünschten Werte für die Anwendung im technischen Betrieb zu lang ist.

Auch die Messung des pH-Wertes ist für diesen Zweck nicht zufriedenstellend. Zwar durchläuft der pH-Wert des Eluates bei dem Punkt, bei welchem Kanamycin A im Eluat erscheint, ein Minimum, jedoch sind die Änderungen des pH-Wertes so klein, daß die Genauigkeit der Messung zur Bestimmung eines scharfen Trennpunktes nicht ausreicht.

Man kann den Verlauf der Eluierung auch durch chemische Analysenmethoden zur Bestimmung von Kanamycin A verfolgen. Eine derartige Analyse beruht auf der Bildung eines furfurolartigen Stoffes aus Kanamycin A durch Einwirkung von Schwefelsäure und ist in der obengenannten Arbeit von J. W. Rothrock und Mitarbeitern auf Seite 798 beschrieben.

Zum Nachweis von Kanamycin A oder Kanamycin B kann man sich auch biologischer Analysenmethoden, z. B. der Messung der Zone der Wachstumshemmung des Organismus B. subtilis, bedienen, wie es ebenfalls in der genannten Arbeit von J. W. Rothrock und Mitarbeitern auf Seite 798 beschrieben ist.

In der Praxis beobachtet man, daß die ersten Fraktionen des Eluates der chromatographischen Säule bereits biologisch aktiv sind, also Kanamycin enthalten, während die späteren Fraktionen auch chemisch aktiv sind, woraus auf die Anwesenheit von Kanamycin A geschlossen werden kann, welches im Gegensatz zu Kanamycin B, wie oben beschrieben, bei der chemischen Umsetzung mit Schwefelsäure einen furfurolartigen Stoff erzeugt. Wegen der Zeitdauer bis

ίο zur Gewinnung des Ergebnisses ist jedoch auch diese Methode nicht zur Durchführung laufender Betriebsanalysen geeignet.

Für die technische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die kontinuierliche Messung des spezifischen elektrischen Widerstandes die geeigneteste Methode zur laufenden Bestimmung der Zusammensetzung der Eluatfraktionen. In der spezifischen Widerstandskurve der Eluate treten zwei Maxima auf, das erste beim Beginn der Eluierung

ao des Kanamycins B und das zweite beim Beginn der Eluierung des Kanamycins A. Die Messung des spezifischen Widerstandes läßt sich äußerst schnell durchführen und ist innerhalb der bei der Eluierung der chromatographischen Säule gegebenen Grenzen genau

as genug, um eine scharfe Trennung des Kanamycins A vom Kanamycin B durch Herausschneiden von Fraktionen zu ermöglichen. Insbesondere ist es mit Hilfe eines Registriergerätes, welches eine graphische Darstellung des Verlaufs des spezifischen Widerstandes liefert, möglich, den Punkt zu bestimmen, bei welchem das gewünschte Kanamycin A aus der chromatographischen Säule eluiert wird, und die nachfolgenden Fraktionen aufzufangen und auf diese Weise Kanamycin A von Kanamycin B zu trennen.

Ein Diagramm der bei einem derartigen Eluierungsvorgang erhaltenen Werte für den spezifischen Widerstand ist in F i g. 2 dargestellt, in welcher die numerierten Fraktionen denjenigen der Papierstreifenchromatogramme der F i g. 1 entsprechen. Diese beiden Zeichnungen stellen die Auswertung des Ausführungsbeispiels 1 dar. Wie man sieht, ist der spezifische Widerstand der ersten 0,3 Raumteile, bezogen auf das Füllvolumen der Säule an Ionenaustauscherharz, an Eluat, d. h. der Flüssigkeit aus den Hohlräumen der Harzkolonne, hoch. Die Fraktionen 4 bis 6 andererseits, die etwa 0,4 Raumteile, bezogen auf das Füllvolumen der Säule an Ionenaustauscherharz, an Eluat ausmachen, besitzen infolge der Eluierung anorganischer Hydroxyde einen sehr niedrigen spezifisehen Widerstand. Etwa mit Beginn der Fraktion 7 steigt der spezifische Widerstand steil zu einem Maximum an, worauf die Eluierung des Kanamycins B beginnt. Die Anwesenheit von Kanamycin B im Eluat wird durch den Teil der Kurve dargestellt, der sich über dem Buchstaben »B« befindet. Kanamycin B wird also in etwa 0,7 Raumteilen der Säule in den Fraktionen 8 bis 13 zusammen mit etwas Kanamycin C eluiert, was sich aus der Schulter bei der Fraktion 12 ergibt. Beginnend mit Fraktion 13 durchläuft der spezifische Widerstand ein weiteres Maximum, wenn Kanamycin A im Eluat zu erscheinen beginnt. Die Eluierung des Kanamycins A wird durch den Teil der Kurve dargestellt, der sich über dem Buchstaben »A« befindet. Kanamycin A wird also in 2,5 Raumteilen, bezogen auf das Füllvolumen der Säule an Ionenaustauscherharz, in den Fraktionen 13 bis 32 eluiert. Man sieht, daß das Maximum in der Widerstandskurve bei Fraktion 13 in Fig. 2 mit dem Auf-

treten der die Anwesenheit von Kanamycin A kennzeichnenden Flecke in dem Papierstreifenchromatogramm der Fig. 1 zusammenfällt. Das Papierstreifenchromatogramm ist also eine Kontrolle für die Genauigkeit der Methode der Messung des spezifischen Widerstandes zur Bestimmung der Anwesenheit von Kanamycin A im Eluat.

Zur Verfolgung des Verlaufes der Eluierung kann auch der Brechungsindex herangezogen werden, da er in Abhängigkeit vom Feststoffgehalt verläuft. Wie aus Tabelle 1 im Ausführungsbeispiel 1 ersichtlich, entsprechen Höchstwerten an Feststoffgehalt Maxima des Brechungsindex.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Vorreinigung der Ausgangslösung für Beispiel 1

35 g rohes kristallines Kanamycinsulfat wurden in 230 ecm destilliertem Wasser zu einer 15%igen Lösung gelöst. Die dunkelbraune Lösung wurde durch eine dünne Schicht eines Filterhilfsmittels filtriert, um unlösliche Stoffe zu entfernen. Dann wurde das Filtrat mit einer Geschwindigkeit von 7 ccm/Min. durch eine Säule mit 245 ecm »Amberlite IRA-401« (Handelsname) in Hydroxylform perkoliert und die Säule gründlich mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Es wurden 620 ecm eines farblosen Eluates (einschließlich des Waschwassers) aufgefangen und im Vakuum zu einer Lösung von einem Gesamtfeststoffgehalt von 25°/o eingeengt. Die Ausbeute der Eluierung betrug 95 %.

Beispiel 1

Eine 122 cm hohe Säule aus dickwandigem, schwer schmelzbarem Glas von 25,4 mm lichter Weite wurde senkrecht aufgestellt und bis zu einer Höhe von 76 cm mit einer wäßrigen Aufschlämmung von 400 ecm des Anionenaustauschers »Dowex l-x2« (Handelsname) in Hydroxylform von einer Korngröße von 0,149 bis 0,297 mm gefüllt. Das Harz wurde in abwärts gerichtetem Strom mit entionisiertem destilliertem Wasser von einem spezifischen Widerstand von mindestens 45 000 Ohm · cm gewaschen. Dann wurde die wäßrige Aufschlämmung des Harzes mit 40 ecm der 25%igen Lösung des Gemisches von Kanamycinbasen überschichtet. Nachdem die Beschickung in das Harz eingesickert war, wurde das Harz sorgfältig mit entionisiertem, destilliertem Wasser überschichtet, ohne das Harzbett aufzurühren. Während des ganzen Arbeitsganges wurde eine Strömungsgeschwindigkeit von 3,5 ccm/Min. innegehalten. Der Eluatstrom wurde durch einen Strömungsmesser und eine Leitfähigkeitszelle in einen Fraktionsschneider geleitet. An die Zelle war ein Registriergerät angeschlossen, und der spezifische Widerstand wurde fortlaufend registriert. Die Grenzen wurden auf 6000 bis 45 000 Ohm ■ cm eingestellt. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 50 ecm aufgefangen. Außer der Messung des spezifischen Widerstandes wurde das Eluat auf seinen Gesamtfeststoff und seine Brechungszahl analysiert, ferner wurden chemische und biologische Analysen ausgeführt und ein Papierstreifenchromatogramm aufgenommen. Die entsprechenden Zahlenwerte sind in Tabelle 1 angegeben, das Papierstreifenchromatogramm ist in Fi g. 1 und die Registrierung des spezifischen Widerstandes in F i g. 2 abgebildet.

	5	1	Gesamt	Tabelle	1	J>recxiungs- zahl
	2	feststoffe	Chemische	Biologische
Fraktion	3	mg/ccm	Analyse	Analyse	1,3322
4	0,06	j»/mg	y/mg	1,3323
10 5	0,04	.		1,3323
6	0,24	—	—	1,3334
7	3,20	—	—	1,3334
8	5,26	—	—	1,3324
15 9	0,50	—	—	1,3323
10	0,10	—		1,3323
11	0,48	81	85	1,3326
12	3,16	90	357	1,3330
13	6,02	50	784	1,3330
20 14	5,16	57	824	1,3329
15	3,58	56	861	1,3326
16	2,42	69	728	1,3337
17	9,78	543	791	1,3352
« 18	18,68	933	966	1,3352
25 19	19,94	1001	888	1,3352
20	19,12	997	977	1,3352
21	17,80	932	859	1,3348
22	15,66	971	976	1,3346
3o 23	13,10	942	921	1,3343
24	11,56	985	1053	1,3338
25	9,88	1009	845	1,3336
26	8,32	984	919	1,3334
27	7,04	1019	872	1,3331
35 28	6,36	1014	940	1,3330
29	4,50	970	961	1,3329
30	3,64	1046	968	1,3327
31	2,88	1073	897	1,3326
40 32	2,20	1076	890	1,3324
	1,66	1084	949	1,3324
1,20	1035	940	1,3323
0,82	1060	976
913	875

Aus diesen Werten ersieht man, daß die für die Fraktion 13 beobachteten Minima im Gesamtfeststoffgehalt und in der Brechungszahl mit dem starken Ansteigen des chemischen An'alysenwertes bei der Fraktion 13, dem Erscheinen des Fleckes für Kanamycin A in dem Chromatogramm der F i g. 1 und dem in F i g. 2 für die Fraktion 13 gekennzeichneten Maximum des spezifischen Widerstandes zusammenfallen. Damit ist bewiesen, daß die Fraktion 13 den Beginn der Eluierung von Kanamycin A darstellt und daß in den Fraktionen 14 bis 32 reines Kanamycin A, nicht verunreinigt durch Kanamycin B oder Kanamycin C, eluiert wurde.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit »Dowex 2-x4«, »Amberlite IRA 400« und »Permutit SK« (Handelsnamen) erhalten. Das Harz »Dowex l-x8« lieferte keine zufriedenstellenden Ergebnisse, vermutlich weil es für diesen Zweck zu stark vernetzt ist.

Beispiel 2

27 g rohes Kanamycin wurden an 11 des Anionenaustauschers »Amberlite IRA 401« in Hydroxylform chromatographiert. Das mit Wasser als Eluierungsmittel gewonnene Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen, und es wurden Bestimmungen des Gesamtfeststoffgehaltes sowie chemische und biologische

Analysen ausgeführt. Die Werte sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Probe	Volumen	Gesamt feststoffe	Che mische Analyse	Bio logische Analyse
	ecm	mg/cem	y/mg	y/mg
Beschickung..	500	52,0	568	288
Hohlraum ...	300	—	—	—
Fraktion 1 ...	100	0,4	0	0
Fraktion 2 ...	100	1,0	0	0
Fraktion3 ...	100	1,3	0	0
Fraktion 4 ...	100	1,8	0	0
Fraktion 5 ...	100	2,4	0	104
Fraktion 6 ...	100	3,7	0	379
Fraktion 7 ...	100	4,2	0	477
Fraktion 8 ...	100	6,0	0	333
Fraktion 9 ...	100	6,7	29,9	672
Fraktion 10 ..	100	7,3	54,8	657
Fraktion 11 ..	100	6,0	50,0	833
Fraktion 12 ..	500	7,4	324	1010
Fraktion 13 ..	500	6,9	855	1090
Fraktion 14 ..	1000	4,0	1423	1030
Fraktion 15 ..	1000	2,9	760	1250
Fraktion 16 ..	1000	1,3	685	923

Beispiel 3

IO

15

20

Aus diesen Werten ergibt sich, daß das Minimum an Gesamtfeststoffen in der Fraktion 11 mit dem Ansteigen des Wertes für die chemische Analyse zwischen den Fraktionen 11 und 12 übereinstimmt, welches auf die Anwesenheit von Kanamycin A im Eluat zurückzuführen ist.

35

Es wurde nach Beispiel 1 gearbeitet, wobei jedoch das Anionenaustauscherharz »Amberlite IRA 401« in Hydroxylform sowohl für die Vorreinigung der Kanamycinlösung als auch für die Chromatographie verwendet wurde. Als Eluierungsmittel diente Wasser mit einem Gehalt von 5% Methanol. Zuerst wurde Kanamycin B eluiert, hierauf ein Gemisch von Kanamycin A mit abnehmenden Mengen an Kanamycin B und schließlich reines Kanamycin A, was durch Be-Stimmung des Gesamtfeststoffgehaltes und des spezifischen Widerstandes sowie durch Entwicklung eines Papierstreifenchromatogramms nachgewiesen wurde.

Beispiel 4 5<>

Es wurde nach Beispiel 3 gearbeitet, wobei jedoch als Eluierungsmittel Wasser mit einem Gehalt von 5% Aceton diente. Die Ergebnisse waren die gleichen wie im Beispiel 3.

Beispiel 5

Es wurde nach Beispiel 1 gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, daß als Beschickung 40 ecm einer 25°/oigen Lösung von roher, konzentrierter, entfärbter Kanamycinbase verwendet wurden, die vor der Kristallisation des rohen Kanamycinsulfats erhalten wurde. Die Ergebnisse zeigten, daß Kanamycin A in den späteren Eluatfraktionen enthalten war, und zwar nicht verunreinigt durch Kanamycin B oder Kanamycin C, welch letzteres auf einem Papierchromatogramm als Fleck in der Mitte zwischen den Flecken für Kanamycin A und Kanamycin B nachgewiesen wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der gleichen Beschickung vor der Entfärbung mit Aktivkohle erhalten.

Beispiel 6

Es wurde nach Beispiel 1 gearbeitet, jedoch mit 60 ecm einer 25%igen Kanamycinlösung als Beschickung. Die Ergebnisse waren die gleichen wie im Beispiel 1.

Beispiel 7

Es wurde nach Beispiel 1 gearbeitet, jedoch mit 20 ecm einer 5O°/oigen Kanamycinlösung als Beschickung. Die Ergebnisse waren wiederum die gleichen wie im Beispiel 1.

Die obigen Beispiele zeigen, daß das neue Verfahren gemäß der Erfindung die quantitative und vollständige Trennung des Kanamycins A von Kanamycin B und Kanamycin C ermöglicht. Das Verfahren läßt sich leicht für technische Arbeitsgänge ausgestalten, da man die Bestimmung desjenigen Punktes, bei dem das Eluat das gewünschte Kanamycin A enthält, unmittelbar durch die laufende Messung des spezifischen Widerstandes oder der Brechungszahl ermitteln kann.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von reinem Kanamycin A aus rohen oder vorgereinigten Gemischen, die neben Kanamycin A im wesentlichen Kanamycin B sowie gegebenenfalls Kanamycin C und Verunreinigungen enthalten, wie sie bei der mikrobiellen Herstellung von Kanamycin anfallen, mit Hilfe von Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Säule einer wäßrigen Aufschlämmung eines porösen, stark basischen Anionenaustauscherharzes mit einer wäßrigen Lösung des Kanamycingemisches überschichtet, die Lösung sodann durch die Säule leitet, anschließend die Säule mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels eluiert und die zuerst selektiv eluierte Lösung von Kanamycin B, gegebenenfalls auch Kanamycin C, und die danach abfließende Lösung von reinem Kanamycin A in getrennten Fraktionen auffängt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung der Fraktionen mit Hilfe der Messung des spezifischen Widerstandes durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung der Fraktionen mit Hilfe der Messung des Brechungsexponenten durchführt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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