DE1159942B - Verfahren zur Herstellung neuer anabol wirksamer 16-Methylen-steroide - Google Patents

Description

Es wurde gefunden, daß 16-Methylen-17«-methyl-5-androsten-3/?,17/?-diol eine wesentlich stärkere anabole und eine verringerte androgene Wirkung als das zugrunde liegende, in 16-Stellung nicht substituierte Steroid besitzt. Insbesondere ist das Verhältnis der anabolen zur androgenen Wirkung bei 16-Methylen-17a-methyl-5-androsten-3/3,17/3-diol wesentlich stärker zugunsten der anabolen Wirkung verschoben als bei dem bekannten, in 16-Stellung nicht substituierten 17«-Methyl-5-androsten-3/5,17^-diol. ι ο

Ferner wurde gefunden, daß die durch Dehydrierung bzw. Oxydation aus lö-Methylen-na-methyl-S-androsten-3j8,17/J-diol erhältlichen Steroide 16-Methylen-17a-methyl-testosteron und lö-Methylen-na-methyl-1-dehydro-testosteron ebenfalls hervorragend anabol wirken bei gleichzeitig verringerter androgener Wirksamkeit.

Die neuen Verbindungen sind nach dem Reaktionsschema aus 16-Methylen-5-androsten-3/?-ol-17-on zugänglich, -so

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung neuer anabol wirksamer 16-Methylen-steroide, das darin besteht, daß man in an sich bekannter Weise lo-Methylen-S-androsten- 3ß-ol-l7-on (I) mit einem Methylalkalimetall behandelt, gegebenenfalls das so erhaltene 16-Methylen-17«-methyl-5-androsten-3^,17^-diol (I) durch milde chemische oder mikrobiologische Oxydation, vorzugsweise Oppenauer-Oxydation oder Behandlung mit ein Kultur von Flavobacterium dehydrogenans, in 16-Methylen-17a-methyl-testosteron (III) umwandelt sowie gegebenenfalls letzteres nach an sich bekannten chemischen oder mikrobiologischen Dehydriermethoden in das entsprechende, in 1(2)-Stellung dehydrierte Produkt (IV) umwandelt.

Die Überführung der 17-Ketogruppe des 16-Methylen-5-androsten-3/?-ol-17-ons in eine 17/9-Hydroxyl- und eine 17x-Methylgruppe wird vorzugsweise durch Behandlung mit Methyllithium vorgenommen. Man arbeitet zweckmäßig in Gegenwart eines wasserfreien Lösungsmittels, wie Benzol, Äther oder Tetrahydrofuran, und setzt das Methyllithium bei Zimmertemperatur zu. Anschließend ist es vorteilhaft, zur Beendigung der Umsetzung das Reaktionsgemisch entweder über Nacht stehenzulassen oder unter Rückfluß zu erhitzen. Danach wird die Reaktionslösung mit Wasser versetzt und anschließend mit einem_mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z. B. Äther, extrahiert. Aus der ätherischen Lösung kann Verbindung II in üblicher Weise isoliert werden.

Die Oxydation der 3/9-ständigen Hydroxylgruppe von Verbindung II zur 3-Ketogruppe unter gleich-Verfahren zur Herstellung neuer anabol
wirksamer 16-Methylen-steroide

Anmelder:

E. Merck Aktiengesellschaft,
Darmstadt, Frankfurter Str. 250

Dipl.-Chem. Dr. Klaus Brückner,

Dipl.-Chem. Dr. Klaus Irmscher, Dr. Ulrich Jahn,

Dr. Harald Metz und Dr. Josef Guussen, Darmstadt,

sind als Erfinder genannt worden

zeitiger Isomerisierung der 5(6)-Doppelbindung zur 4(5)-Doppelbindung kann chemisch oder mikrobiologisch erfolgen. Als chemische Methode kommt in erster Linie die Oppenauer-Oxydation in Frage. Zum Beispiel kann man Verbindung II in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Toluol, lösen und anschließend bei Gegenwart von Cyclohexanon mit Aluminiumisopropylat behandeln. Die Umsetzung wird in der üblichen Weise durch Kochen des Reaktionsgemisches unter Rückfluß beendet. Es ist vorteilhaft, danach eine Wasserdampfdestillation anzuschließen und den dabei erhaltenen Rückstand mit Äther zu extrahieren. Aus dem Ätherextrakt kann das erwünschte 16-Methylen-17«-methyl-testosteron (III) in kristalliner Form isoliert werden.

Verbindung III kann aus Verbindung II auch mikrobiologisch, z. B. durch Einwirkung einer Kultur von Flavobacterium dehydrogenans,hergestellt werden. Als Nährlösung für die Kultur von Flavobacterium dehydrogenans wird eine auf pH 7,0 gepufferte Lösung eines l%ig^en Hefeextraktes in Wasser verwendet. Nach etwa 10- bis 16stündigem Wachstum bei etwa 28° C setzt man der Bakterienkultur die Verbindung II zu. Die Bebrütung wird dann unter Belüftung etwa 6 Stunden fortgesetzt. Den Fortgang der Reaktion kann man durch Messung des UV-Spektrums kontrollieren. Nach Beendigung der Fermentation wird Verbindung III durch Chlorformextraktion aus dem Reaktionsgemisch isoliert und anschließend durch Eindampfen des Chloroformextraktes in kristalliner Form gewonnen.

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Die 1(2)-Dehydrierung von Verbindung III zu Verbindung IV kann sowohl chemisch als auch mikrobiologisch durchgeführt werden. Als chemisches Dehydrierungsmittel kann z. B. Selendioxyd verwendet werden. Gegebenenfalls empfiehlt es sich, vor der Behandlung mit Selendioxyd die 17/3-ständige Hydroxylgruppe des 16-Methylen-17a-methyl-testosterons (III) zu acylieren, insbesondere zu acetylieren. Nach der 1(2)-Dehydrierung kann die 17ständige Hydroxylgruppe in üblicher Weise wieder in Freiheit gesetzt werden. Vorteilhaft arbeitet man bei der Dehydrierung mit Selendioxyd in tert.-butanolischer Lösung, der man eine geringe Menge Essigsäure zusetzt. Die Umsetzung gelingt in guter Ausbeute durch Kochen des Reaktionsgemisches unter Rückfluß. Das ausgefallene Selen wird abgetrennt und aus dem Filtrat das erwünschte 1(2)-Dehydrierungsprodukt (Verbindung IV bzw. deren 17-Acylat) isoliert.

Die Dehydierung von Verbindung III zu IV kann auf chemischem Wege auch unter Verwendung von 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-benzochinon als Dehydrierungsmittel erfolgen. Dabei arbeitet man zweckmäßig in Gegenwart eines Lösungsmittels mit einem Siedepunkt von etwa 130 bis 15O⁰C. Als Lösungsmittel sind geeignet Äthanol, Butanol, tert.-Butylessigsäuremethylester, Butylessigsäureäthylester, Dioxan, Eisessig, Benzol, Tetrahydrofuran oder Aceton. Es ist ferner vorteilhaft, dem Reaktionsgemisch geringe Mengen Nitrobenzol zuzumischen. Die Reaktionszeiten liegen zwischen 5 und 48 Stunden, je nach verwendetem Lösungsmittel. Die Umsetzung wird vorteilhaft bei Siedetemperatur des . verwendeten Lösungsmittels durchgeführt.

Zur Einführung der I(2)-ständigen Doppelbindung in Verbindung III auf mikrobiologischem Wege können z. B. die Kulturen von folgenden Mikroorganismen verwendet werden: Bacillus sphaericus, Fusarium solani, Corynebacterium simplex, Alternaria sp., Mycobacterium smegmatis, Calonectiia decora, Mycobacterium lacticola, Ophiobolus sp., Alcanigenes sp., Didymella lycopersici, Protaminobacter sp., Septomyxa affinis, Nocardia sp., Cylindrocarpon radicicola, Streptomyces lavendulae, Bacillus cyclooxydans. Durchschnittlich erfordert die mikrobiologische 1(2)-Dehydrierung etwa 4 bis 24 Stunden, je nachdem, welcher Mikroorganismus verwendet wird. Insbesondere eignen sich Kulturen von Bacillus sphaericus var. fusiformis oder Cornynebacterium simplex für diese Umsetzung.

Die als Ausgangsmaterial benötigte Verbindung I ist durch Mannich-Kondensation aus 5-Androsten-3/S-ol-17-on zugänglich. Dabei erhält man als Zwischenprodukt 1 ö-Dimethylaminomethyl-S-androsten-Sß-ol-17-on, das durch Wasserdampfdestillation in das als Ausgangsmaterial für das Verfahren nach der Erfindung verwendete 16-Methylen-5-androsten-3ß-ol-17-on zerlegt werden kann. Für die Herstellung der Ausgangsverbindung I wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Schutz nicht begehrt.

Die neuen Verbindungen (II bis IV) können als Arzneimittel mit anaboler Wirkung auf allen entsprechenden Indikationsgebieten in der Humanmedizin eingesetzt werden. Sie lassen sich zu allen üblichen pharmazeutischen Zubereitungsformen, z. B. Pillen, Tabletten, Dragees, Suppositorien, Emulsionen sowie gegebenenfalls unter Verwendung geeigneter Lcsungsvermittler auch zu Injektionslösungen verarbeiten.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindung?- gemäße Verfahren.

Beispiel 1

15 g lö-Methylen-S-androsten-ßjS-ol-n-on werden in 800 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und diese Lösung mit 958 ml Methyllithiumlösung, enthaltend 5,48 g Methyllithium, versetzt. Nach Stehen über Nacht wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt, die ätherische Phase abgetrennt und der wäßrige Teil noch einmal mit Äther extrahiert. Die vereinigten Ätherlösungen werden dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Dabei kristallisiert das 16-Methylen-17*-methyl-5-androsten-3/9,17jS-diol aus. F. 170 bis 173°C. Nach weiterem Umkristallisieren schmilzt die Substanz bei 180 bis 181⁰C. («)ΰ = —136° (Dioxan).

Beispiel 2

4 g d_es gemäß Beispiel 1 erhaltenen 16-Methylen-17«-methyl-5-androsten-3/S,17,e-diols werden in 315 ml Toluol und 51 ml Cyclohexanon gelöst, danach werden 30 ml dieses Gemisches abestilliert, zum Reaktionsgemisch 6,6 g Aluminiumisopropylat hinzugefügt und das Ganze 1 Stunde unter Rückfluß gekocht. Anschließend wird das Gemisch einer längeren Wasserdampfdestillation unterworfen. Der Rückstand wird dann mit Äther ausgeschüttelt, der Ätherextrakt gewaschen, getrocknet und eingeengt.

Aus Cyclohexan kristallisiert das 16-Methylen-17a-methyl-testosteron. F. 140 bis 142⁰C. Nach weiterem Umkristallisieren schmilzt die Substanz bei 149bis 150⁰C. [oi\_D = -5° (Dioxan). %_maa = 240ιημ; E i* = 569.

Beispiel 3

Ein Kleinfermenter mit 101 einer Nährlösung, die 1 % Hefsextrakt und V₁₆ Mol Phosphatpuffer nach Sörensen, Ph6,8, enthält, wird mit 400 ml einer 24 Stunden alten Schüttelkultur von Flavobacterium dehydrogenans beimpft. Nach lOstündigem Wachstum bei 28 ⁰C unter krätigem Rühren und Belüften wird eine Lösung von 5 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen 16-Methylen-17&-methyl- 5 - androsten-3/3,17/3-diols in 150 ecm Methanol zugesetzt. Die Bebrütung und Belüftung wird 6 Stunden fortgesetzt und während dieser Zeit der Reaktionsverlauf durch stündliche Messung der UV-Absorptionsextinktion bei 240 πιμ verfolgt. Nach 6 Stunden ist nur noch 16-Methylen-17a-methyl-testosteron nachzuweisen. Die Kulturlösung wird dann mit Chloroform mehrfach ausgeschüttelt, der Chloroformextrakt getrocknet und eingeengt. Aus dem Rückstand kristallisiert das im Beispiel 2 beschriebene 16-Methylen-17«-methyl-testosteron.

Beispiel 4

In einem Kleinfermenter werden 151 einer Nährlösung aus I⁰I₀ Hefeextrakt, die auf ein Ph von 6,8 eingestellt worden ist, mit 0,5 1 einer Schüttelkultur von Bacillus sphaericus beimpft. Die Kultur wächst unter ständigem Rühren und starker Belüftung bei 28⁰C und erhält nach etwa 6 Stunden einen Zusatz von 7,5 g des gemäß Beispiel 2 oder 3 erhaltenen 16-Methylen-17«-methyl-testosterons, gelöst in 300 ml Methanol. Die Dehydrierung wird dünnschichtchromatographisch verfolgt und ist nach etwa 20 Stunden beendet. Danach wird die Fermentations-

lösung mit Chloroform mehrfach extrahiert, der Chloroformextrakt getrocknet und eingeengt. Aus dem Rückstand kristallisiert das 16-Methylen-l-dehydro-17*- methyl -testosteron. F. 147 bis 148° C. [x]_D =-101,3° (Dioxan); l_max 244 ηιμ; E JI₁ = 550.

Beispiel 5

In einem Kleinfermenter von 151 Inhalt wird eine Nährlösung, die 0,1% Hefeextrakt enthält und auf pH 6,8 eingestellt ist, mit 11 einer Schüttelkultur von Corynebacterium simplex beimpft. Die Kultur wächst unter ständigem Rühren und starker Belüftung bei 28⁰C und erhält nach etwa 6 bis 8 Stunden einen Zusatz von 5 g des gemäß Beispiel 2 oder 3 erhaltenen 16-Methylen-17*-methyl-testosterons, gelöst in 300 ml Methanol.

Wie im Beispiel 4 beschrieben, wird auch hier die Reaktion dünnschichtchromatographisch verfolgt. Die Dehydrierung ist im allgemeinen nach 8 bis 10 Stunden beendet. Die Kulturlösung wird, wie im Beispiel 4 beschrieben, zur Isolierungdes 16-Methylen-l-dehydro-17«-methyl-testosterons aufgearbeitet.

Beispiel 6

In einem Kleinfermenter werden 121 einer Nährlösung aus 0,1% Hefeextrakt (ph 6,8) mit 800 ml einer Submerskultur von Corynebacteriumsimplex beimpft. Die Kultur wächst unter Rühren und starker Belüftung bei 28⁰C und erhält nach etwa 8 Stunden einen Zusatz von 8 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen 16-Methylen-17«-methyl-5-androsten-3/J, 17/3-diols in 250 ml Methanol. Der Umsatz wird dünnschichtchromatographisch verfolgt und ist nach 10 bis 12 Stunden beendet. Als Zwischenprodukt ist 16-Methylen-17«-methyl-testosteron festzustellen, das sofort weiter zu 16-Methylen- 1-dehydro-l 7a-methyl-testosteron dehydriert wird. Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe wird wie im Beispiel 4 durchgeführt.

Beispiel 7

2 g des gemäß Beispiel 2 oder 3 erhaltenen 16-Methylen-17«-methyl-testosterons werden in 47 ml Benzol gelöst und zusammen mit 2,5 g 2,3-Dichlor-5,6-dicyanp-benzochinon 10 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach wird das Reaktionsgemisch in 500 ml Wasser eingerührt und mit Äther extrahiert. Der Ätherauszug wird mit verdünnter Natronlauge und mit Wasser geschüttelt, getrocknet und eingeengt. Aus Cyclohexan kristallisiert das 16-Methylen- 3 -dehydro-17«-methyltestosteron vom Schmp. 147 bis 148⁰C.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH:

   Verfahren zur Herstellung neuer anabol wirksamer 16-Methylen-steroide,dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise 16-Methylen-5-androsten-3/5-ol-17-on (I) mit einem Methylalkalimetall behandelt, gegebenenfalls das so erhaltene 16-Methylen- na-methyl-S-androsten-3/3,17/3-diol (II) durch milde chemische oder mikrobiologische Oxydation, insbesondere durch Oppenauer-Oxydation oder Behandlung mit einer Kultur von Flavobacteriumdehydrogenans, in 16-Methylen-17ot-methyl-testosteron (III) umwandelt sowie gegebenenfalls letzteres nach an sich bekannten chemischen oder mikrobiologischenDehydrierungsmethoden in das entsprechende, in 1(2)-Stellung dehydrierte Produkt (IV) umwandelt.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Journ. Am. Chem. Soc, Bd. 82 (I960), S. 3404 bis 3409.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   ® 309 770/480 12.63