DE1134994C2 - Verfahren zum Stabilisieren von Co-Enzym A - Google Patents

Verfahren zum Stabilisieren von Co-Enzym A

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DE1134994C2 DE1957R0021807 DER0021807A DE1134994C2 DE 1134994 C2 DE1134994 C2 DE 1134994C2 DE 1957R0021807 DE1957R0021807 DE 1957R0021807 DE R0021807 A DER0021807 A DE R0021807A DE 1134994 C2 DE1134994 C2 DE 1134994C2
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
PATENTSCHRIFT 1134
INTERNAT. KL. C 07 f
ANMELDETAG: 4. SEPTEMBER 1957
BEKANNTMACHUNG
DER ANMELDUNG
UND AUSGABE DER
AUSLEGESCHRIFT: 23. AUGUST 1962
AUSGABE DER
PATENTSCHRIFT: 7. MARZ 1963
STIMMT ÜBEREIN MIT AUSLEGESCHRIFT
1134 994 (R 21807 IVd/12 p)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren des Co-Enzyms A.
Das Co-Enzym A ist instabil, sobald es zuviel Feuchtigkeit aufnimmt oder sobald es Temperaturen über 4° C ausgesetzt wird, wobei sich die Instabilität verstärkt bemerkbar macht,..wenn beide Bedingungen gleichzeitig auftreten. Durch Lyophilisation (Gefriertrocknung) kann man verhindern, daß das Co-Enzym A überschüssige Feuchtigkeit aufnimmt, es war aber bisher trotzdem notwendig, das Produkt bei Temperaturen unter 4°C aufzubewahren, um seine Zersetzung zu verhindern. Aus diesem Grunde konnte das Produkt auf vielen an sich wünschenswerten Anwendungsgebieten nicht eingesetzt werden.
Das Co-Enzym A wird im allgemeinen als atypisches Dinucleotid angesehen, in welchem eines der Mononucleotide möglicherweise durch das Phosphopantothein ersetzt sein kann; in dem letzteren ist Pantothensäure mit einem Molekül /S-Mercaptoäthylamin durch Verfahren zum Stabilisieren von Co-Enzym A
Patentiert für:
Michel Robilliart, Paris
Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 5. September 1956 (Nr. 607 991)
Michel· Robilliart, Paris,
ist als Erfinder genannt worden
Peptidbindung verbunden. Es wird angenommen, daß das Co-Enzym A folgende Strukturformel besitzt:
CHo OH
,CH8-CH2
O!
CH2-C — CH — C-N
O CH3
O = P-OH NH2
O C = N
O = P-OH N-C CH
I ^
CH2-CH-CH-CH-CH-N-C-N
O OH
HO —P-OH
O
C — NH — CH„ — CH„ — SH
/ CH
Das Molekulargewicht des Co-Enzyms A beträgt 767.
Es wird angenommen, daß die Instabilität des Co-Enzyms A von der großen Aktivität der SH-Gruppe in seinem Molekül herrührt. Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß man den Co-Enzym-A-Komplex bei Zimmertemperatur stabilisieren kann, wenn man eine wäßrige Lösung, die Co-Enzym A und ein wasserlösliches, nicht zerfließliches Salz eines ein- oder zweiwertigen Metalls enthält, lyophilisiert. Es ist dann möglich, den Co-Enzym-A-Komplex für eine verhältnismäßig lange Zeit aufzubewahren. Man erhält auf diese Weise ein Produkt, welches im Hinblick auf seine enzymatischen Eigenschaften stabil ist.
309 51fi/198
Beispiel 1
Co-Enzym A 1534
Calciumgluconat 448,3
Beispiel 2
Co-Enzym A 1534
Calciumbenzoat 336,3
Beispiel 3
Co-Enzym A 1534
Calciumcitrat 570,5
Das Calciumsalz reagiert mit dem Co-Enzym A, indem es vermutlich den Platz des Wasserstoffes der SH-Gruppe in dem Molekül des Co-Enzyms A einnimmt, wobei folgender allgemeiner Reaktionsverlauf angenommen werden kann: (Der Ausdruck Co A — SH stellt das Molekül des Co-Enzyms A dar).
CoA-SH
CoA-SH
Calciumgluconat
CoAS,
CoAS
Ca
Das Reaktionsprodukt des Co-Enzyms A, welches in Form eines stabilisierten Metallsalzes vorliegt, ist nach der Lyophilisation enzymatisch stabil. Wenn man es jedoch in eine wäßrige Lösung bringt, zersetzt es sich unter Hydrolyse und bildet das Co-Enzym A zurück. Die Reaktion zwischen dem Co-Enzym A und dem wasserlöslichen Salz, z. B. Calciumgluconat, geht unter stöchiometrischen Verhältnissen vor sich, d. h., wenn man ein in Wasser lösliches Salz eines einwertigen Metalls verwendet, so reagiert nur ein Molekül Co-Enzym A an Stelle der beiden Moleküle.
Vorzugsweise wird aber das Co-Enzym A mit einem Überschuß des wasserlöslichen Salzes umgesetzt, da dieser Überschuß des Salzes die Stabilität des erhaltenen Produktes nicht beeinflußt und nach der Lyophilisation ein Reaktionsprodukt in Form eines Kuchens von gutem Aussehen und vorzüglicher Haltbarkeit ergibt.
In den folgenden Beispielen wird ein Salzüberschuß angewendet:
Beispiel 4
Gewichtsteile
Co-Enzym A 0,300 mg
Calciumgluconat 5 mg
Beispiel 5
Gewichtsteile
Co-Enzym A 0,300 mg
Calciumbenzoat 5 mg
Beispiel 6
Gewichtsteile *
Co-Enzym A 0,300 mg
Calciumcitrat 5 mg
Das Reaktionsprodukt fällt in Form eines festen, leicht verwendbaren Kuchens an.
Außer den obengenannten Salzen kann man zum Stabilisieren des Co-Enzyms A auch andere nicht zerfließende und in Wasser lösliche Metallsalze organischer Säuren und Salze von Mineralsäuren verwenden. Als Beispiel für nicht zerfließende und in Wasser lösliche Salze zweiwertiger Metalle sind z. B. die Salze des Magnesiums, Cadmiums, Nickelsr Kobalts, Eisens und Mangans zu nennen, doch werden vorzugsweise die löslichen Calciumsalze organischer
ίο Säuren verwendet, da diese leicht wasserlöslich und nicht zerfließend sind. Außer den Salzen der Säuren, die weiter oben schon genannt worden sind, kann man äquivalente Mengen der wasserlöslichen Metallsalze der Essigsäure, Ameisensäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure und anderer organischer Säuren und Mineralsäuren verwenden, und zwar insbesondere die nicht zerfließenden und wasserlöslichen Salze der Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure.
Vorzugsweise können Natrium- oder Calciumsalze zweibasischer organischer Säuren, wie Gluconsäure, oder auch der Benzoesäure verwendet werden.
Die Stabilität des Reaktionsproduktes des Co-Enzyms A mit dem Metallsalz läßt sich durch die Tatsache beweisen, daß das Produkt dieselben spektrophotometrischen und chromatographischen Eigenschaften wie das reine, durch Kälte stabilisierte Co-Enzym A besitzt.
Die Wirksamkeit des Verfahrens gemäß der Erfindung ergibt sich weiter aus folgenden Versuchen:
Verwendet wurde ein Co-Enzym A mit zwei Molekülen Wasser, dessen Molekulargewicht zu 803 ermittelt wurde. Das Produkt besitzt theoretisch 394 Lipman-Einheiten. Der Versuch ergab 373 Lipman-Einheiten. Das Verhältnis der S Η-Gruppen zu Adenin beträgt theoretisch 1,00. Gemessen wurde ein Wert von 0,77. Ein Teil dieses Produktes wurde mit Calciumgluconat gemäß Beispiel 4 versetzt. Der andere Teil blieb ohne Zusatz. Die beiden Proben wurden in Reagenzgläser gebracht und der Luft bei 81°/0 relativer Feuchtigkeit und einer Temperatur von 25 0C ausgesetzt. Nach 4 Stunden war die Kontrollprobe vollständig geschmolzen, während das gemäß der Erfindung stabilisierte Produkt ein weißes Pulver geblieben war, welches offensichtlich einige Feuchtigkeit aufgenommen hatte und kristallin geworden war. Nach 24stündigem Stehen zeigte die letztere Probe das Aussehen einer körnigen kristallinen Masse, die sich leicht mit einem Spatel zerteilen ließ. Die Analyse der beiden Proben nach 24stündiger Lagerung bei 25 0C an der Luft mit 81°/o relativer Feuchtigkeit ergab folgende Ergebnisse:
Verhältnis von SH-Gruppen zu Adenin
Prozentuale Oxydation
Erfindungsgemäß
stabilisiert
0,610
19,8%
Vergleichsprobe
0,460
39,8%
Die prozentuale Oxydation wurde nach folgender Formel berechnet:
ursprüngliches Verhältnis — nach 24 Stunden gemessenes Verhältnis ursprüngliches Verhältnis
100.
Zum Beweis, daß überraschenderweise auch Eisen- und Kupfersalze erfindungsgemäß verwendet werden können, wurden drei Proben Co-Enzym A zu je 1000 fi.g abgewogen. Die erste Probe enthielt einen Zusatz von 350 μg Kupfergluconat, die zweite Probe einen Zusatz von 200 μg Ferrosulfat, die dritte Probe blieb ohne
Zusatz. Die Kationen befanden sich hierbei etwa in stöchiometrischem Verhältnis zum Co-Enzym A, wobei ein leichter Salzüberschuß vorhanden war. Sämtliche drei Proben wurden gleichermaßen einer Lyophilisation unterworfen.
Die sorgfältig verschlossenen Proben wurden bei Zimmertemperatur (18 bis 22 0C) 7 Wochen lang aufbewahrt und dann titriert.
Die Bestimmung der acetylierenden Wirkung geschah sowohl nach der Methode von Kaplan-Lipman als auch nach der Transacetylase-Methode nach Stadtman (vgl. Method of Biochimical Analysis, Vol. 2, S. 204).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Mikrogramm Co-Enzym A ausgedrückt. Die Ausgangsverbindung wies einen Reinheitsgrad von 85 % auf, was 330 Einheiten je mg Co-Enzym A entspricht.
Datum
7. 11.
20. 12.
20. 12.
20. 12.
Probe
Co-Enzym-A Nr. 418
1000 μg
Co-Enzym A Nr. 418
1000 μg
Co-Enzym A
1000 μg + 350 [Ag
Kupfergluconat
Co-Enzym A
1000 μg + 200 μg
Ferrosulf at
Methode
Kaplan
1008 μg
604 μg
915
833
Transacetylase-Methode
926 μg
592
860 μg
910 μg
Methode Kaplan Transacetylase-Methode
980 μδ 916 jig
Obwohl die Anwendung des Calciumsalzes die besten Ergebnisse liefert, kann eine durchaus befriedigende Konservierung auch bei ,Zusatz der Kupfer-' bzw. Eisensalze festgestellt werden. Das
ίο Ergebnis der Versuche würde noch auffallender sein, wenn die Aufbewahrungszeit länger und die Lagerungstemperatur höher gewesen wären.
Im Mittel zeigen die Versuche eine Konservierung von 88,5% der Aktivität, nach der Transacetylase-Methode gemessen, und von 88 % nach der Methode Kaplan. Der Fehler bei der Dosierung der Proben wird auf ± 3% geschätzt; der Titrationsfehler ist auf ± 10% zu schätzen.

Claims (3)

PATENTANSPRÜCHE:
1. Verfahren zum Stabilisieren von Co-Enzym A, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung, die Co-Enzym A und ein wasserlösliches, nicht zerfließliches Salz eines ein- oder zweiwertigen Metalls enthält, lyophilisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Natrium- oder Calciumsalz verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Salz der Gluconsäure oder der Benzoesäure verwendet.
Unter den gleichen Bedingungen ergibt ein mit Calciumgluconat versetztes Co-Enzym A folgende Werte:
In Betracht gezogene Druckschriften:
Hοüben—Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 9 (1955), S. 43 bis 45;
Journal of the American Chemical Society, Bd. 76 (1954), S. 3575 bis 3577.
DE1957R0021807 1956-09-05 1957-09-04 Verfahren zum Stabilisieren von Co-Enzym A Expired DE1134994C2 (de)

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US3300476A (en) * 1963-05-24 1967-01-24 Mack Chem Pharm Deoxyribonuclease blocking agents
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