DE1134994B

DE1134994B - Verfahren zum Stabilisieren von Co-Enzym A

Info

Publication number: DE1134994B
Application number: DER21807A
Authority: DE
Inventors: Michel Robilliart
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1956-09-05
Filing date: 1957-09-04
Publication date: 1962-08-23
Also published as: US2917434A; CH366258A; DE1134994C2

Description

Verfahren zum Stabilisieren von Co-Enzym A Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren des Co-Enzyms A.
Das Co-Enzym A ist instabil, sobald es zuviel Feuchtigkeit aufnimmt oder sobald es Temperaturen über 4°C ausgesetzt wird, wobei sich die Instabilität verstärkt bemerkbar macht, wenn beide Bedingungen gleichzeitig auftreten. Durch Lyophilisation (Gefriertrocknung) kann man verhindern, daß das Co-Enzym A überschüssige Feuchtigkeit aufnimmt, es war aber bisher trotzdem notwendig, das Produkt bei Temperaturen unter 4°C aufzubewahren, um seine Zersetzung zu verhindern. Aus diesem Grunde konnte das Produkt auf vielen an sich wünschenswerten Anwendungsgebieten nicht eingesetzt werden.
Das Co-Enzym A wird im allgemeinen als atypisches Dinucleotid angesehen, in welchem eines der Mononucleotide möglicherweise durch das Phosphopantothein ersetzt sein kann ; in dem letzteren ist Pantothensaure mit einem Molekül p-Mercaptoäthylamin durch Peptidbindung verbunden. Es wird angenommen, daß das Co-Enzym A folgende Strukturformel besitzt : Das Molekulargewicht des Co-Enzyms A beträgt 767.
Es wird angenommen, daß die Instabilität des Co-Enzyms A von der großen Aktivität der SH-Gruppe in seinem Molekül herrührt. Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß man den Co-Enzym-A-Komplex bei Zimmertemperatur stabilisieren kann, wenn man eine wäßrige Lösung, die Co-Enzym A und ein wasserlösliches, nicht zerfließliches Salz eines ein-oder zweiwertigen Metalls enthält, lyophilisiert. Es ist dann möglich, den Co-Enzym-A-Komplex für eine verhältnismäßig lange Zeit aufzubewahren. Man erhält auf diese Weise ein Produkt, welches im Hinblick auf seine enzymatischen Eigenschaften stabil ist.
Beispiell Co-Enzym A........................ 1534 Calciumgluconat..................... 448, 3 Beispiele Co-Enzym A........................ 1534 Calciumbenzoat...................... 336, 3 Beispiel 3 µg Co-Enzym A........................ 1534 Calciumcitrat....................... 570, 5 Das Calciumsalz reagiert mit dem Co-Enzym A, indem es vermutlich den Platz des Wasserstoffes der SH-Gruppe in dem Molekül des Co-Enzyms A einnimmt, wobei folgender allgemeiner Reaktionsverlauf angenommen werden kann : (Der Ausdruck Co A-S H stellt das Molekül des Co-Enzyms A dar).

COA-SH COAS,

+ Calciumgluconat +, Ca

CoA-SH CoAS/

Das Reaktionsprodukt des Co-Enzyms A, welches in Form eines stabilisierten Metallsalzes vorliegt, ist nach der Lyophilisation enzymatisch stabil. Wenn man es jedoch in eine wäßrige Lösung bringt, zersetzt es sich unter Hydrolyse und bildet das Co-Enzym A zurück. Die Reaktion zwischen dem Co-Enzym A und dem wasserlöslichen Salz, z. B. Calciumgluconat, geht unter stöchiometrischen Verhältnissen vor sich, d. h., wenn man ein in Wasser lösliches Salz eines einwertigen Metalls verwendet, so reagiert nur ein Molekül Co-Enzym A an Stelle der beiden Moleküle.
Vorzugsweise wird aber das Co-Enzym A mit einem Überschuß des wasserlöslichen Salzes umgesetzt, da dieser Überschuß des Salzes die Stabilität des erhaltenen Produktes nicht beeinflußt und nach der Lyophilisation ein Reaktionsprodukt in Form eines Kuchens von gutem Aussehen und vorzüglicher Haltbarkeit ergibt.
In den folgenden Beispielen wird ein Salzüberschuß angewendet : Beispiel 4 Gewichtsteile Co-Enzym A...................... 0, 300 mg Calciumgluconat................... 5 mg Beispiel 5 Gewichtsteile Co-Enzym A.................. 0, 300 mg Calciumbenzoat.................... 5 mg Beispiel 6 Gewichtsteile Co-Enzym A...................... 0, 300 mg Calciumcitrat..................... 5 mg Das Reaktionsprodukt fällt in Form eines festen, leicht verwendbaren Kuchens an.
Außer den obengenannten Salzen kann man zum Stabilisieren des Co-Enzyms A auch andere nicht zerfließende und in Wasser lösliche Metallsalze organischer Säuren und Salze von Mineralsäuren verwenden. Als Beispiel für nicht zerfließende und in Wasser lösliche Salze zweiwertiger Metalle sind z. B. die Salze des Magnesiums, Cadmiums, Nickels, Kobalts, Eisens und Mangans zu nennen, doch werden vorzugsweise die löslichen Calciumsalze organischer Säuren verwendet, da diese leicht wasserlöslich und nicht zerfließend sind. Außer den Salzen der Säuren, die weiter oben schon genannt worden sind, kann man äquivalente Mengen der wasserlöslichen Metallsalze der Essigsäure, Ameisensäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure und anderer organischer Säuren und Mineralsäuren verwenden, und zwar insbesondere die nicht zerfließenden und wasserlöslichen Salze der Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure.
Vorzugsweise können Natrium-oder Calciumsalze zweibasischer organischer Säuren, wie Gluconsäure, oder auch der Benzoesäure verwendet werden.
Die Stabilität des Reaktionsproduktes des Co-Enzyms A mit dem Metallsalz läßt sich durch die Tatsache beweisen, daß das Produkt dieselben spektrophotometrischen und chromatographischen Eigenschaften wie das reine, durch Kälte stabilisierte Co-Enzym A besitzt.
Die Wirksamkeit des Verfahrens gemäß der Erfindung ergibt sich weiter aus folgenden Versuchen : Verwendet wurde ein Co-Enzym A mit zwei Molekülen Wasser, dessen Molekulargewicht zu 803 ermittelt wurde. Das Produkt besitzt theoretisch 394 Lipman-Einheiten. Der Versuch ergab 373 Lipman-Einheiten. Das Verhältnis der SH-Gruppen zu Adenin beträgt theoretisch 1, 00. Gemessen wurde ein Wert von 0, 77. Ein Teil dieses Produktes wurde mit Calciumgluconat gemäß Beispiel 4 versetzt. Der andere Teil blieb ohne Zusatz. Die beiden Proben wurden in Reagenzgläser gebracht und der Luft bei 81°/o relativer Feuchtigkeit und einer Temperatur von 25 °C ausgesetzt. Nach 4 Stunden war die Kontrollprobe vollständig geschmolzen, während das gemäß der Erfindung stabilisierte Produkt ein weißes Pulver geblieben war, welches offensichtlich einige Feuchtigkeit aufgenommen hatte und kristallin geworden war.
Nach 24stündigem Stehen zeigte die letztere Probe das Aussehen einer körnigen kristallinen Masse, die sich leicht mit einem Spatel zerteilen ließ. Die Analyse der beiden Proben nach 24stündiger Lagerung bei 25 °C an der Luft mit 81°/o relativer Feuchtigkeit ergab folgende Ergebnisse :

| Erfindungsgem ß | Vergleichs-

stabilisiert probe

Verhältnis von SH-

Gruppen zu Adenin 0, 610 0, 460

Prozentuale Oxydation 19, 8 °/0 39, 8 °/0

Die prozentuale Oxydation wurde nach folgender Formel berechnet : ursprüngliches Verhältnis-nach 24 Stunden gemessenes Verhältnis 100 ursprüngliches Verhältnis Zum Beweis, daß-überraschenderweise auch Eisen-und Kupfersalze erfindungsgemäß verwendet werden können, wurden drei Proben Co-Enzym A zuje 1000 llg abgewogen. Die erste Probe enthielt einen Zusatz von 350 iag Kupfergluconat, die zweite Probe einen Zusatz von 200 Sg Ferrosulfat, die dritte Probe blieb ohne Zusatz. Die Kationen befanden sich hierbei etwa in stöchiometrischem Verhältnis zum Co-Enzym A, wobei ein leichter Salzüberschuß vorhanden war. Sämtliche drei Proben wurden gleichermaßen einer Lyophilisation unterworfen.
Die sorgfältig verschlossenen Proben wurden bei Zimmertemperatur (18 bis 22°C) 7 Wochen lang aufbewahrt und dann titriert.
Die Bestimmung der acetylierenden Wirkung geschah sowohl nach der Methode von K a p 1 a n-L i p m a n als auch nach der Transacetylase-Methode nach Stadtman (vgl. Method of Biochimical Analysis, Vol. 2, S. 204).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Mikrogramm Co-Enzym A ausgedrückt. Die Ausgangsverbindung wies einen Reinheitsgrad von 85°/o auf, was 330 Einheiten je mg Co-Enzym A entspricht.

Datum Probe Methode Transacetylase-

Ka Methode

7. 11. Co-Enzym-A Nr. 418 1008 Fg 926 Fg

1000 Fg

20. 12. Co-Enzym A Nr. 418 604 tg 592 Fg

1000 ug

20. 12. Co-Enzym A

1000 µg + 350 µg

Kupfergluconat 915 zig 860 Fg

20. 12. Co-Enzym A

1000 µg + 200 µg

Ferrosulfat 833 Fg 910 Fg

Unter den gleichen Bedingungen ergibt ein mit Calciumgluconat versetztes Co-Enzym A folgende Werte :

Methode Kaplan an Transacetylase-Methode

980 ptg 1 916 Fg

Obwohl die Anwendung des Calciumsalzes die besten Ergebnisse liefert, kann eine durchaus befriedigende Konservierung auch bei Zusatz der Kupfer-bzw. Eisensalze festgestellt werden. Das Ergebnis der Versuche würde noch auffallender sein, wenn die Aufbewahrungszeit länger und die Lagerungstemperatur höher gewesen wären.

Im Mittel zeigen die Versuche eine Konservierung von 88, 5°/o der Aktivität, nach der Transacetylase-Methode gemessen, und von 88 °/o nach der Methode K a plain. Der Fehler bei der Dosierung der Proben wird auf 3 °/0 geschätzt ; der Titrationsfehler ist auf zt 10°/o zu schätzen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zum Stabilisieren von Co-Enzym A, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung, die Co-Enzym A und ein wasserlösliches, nicht zerfließliches Salz eines ein-oder zweiwertigen Metalls enthält, lyophilisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Natrium-oder Calciumsalz verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Salz der Gluconsäure oder der Benzoesäure verwendet.

In Betracht gezogene Druckschriften : Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 9 (1955), S. 43 bis 45 ; Journal of the American Chemical Society, Bd. 76 (1954), S. 3575 bis 3577.