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Verfahren zur Herstellung von Isoalloxazinen Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Isoalloxazinen der Formel
worin X ein Sauerstoffatom oder eine Iminogruppe, R eine Methyl- oder Äthylgruppe
und R' einen Alkyl- oder Kohlehydratrest bedeutet. Da in 3-Stellung, also der Iminogruppe
bzw. dem Sauerstoffatom in 2-Stellung und der Iminogruppe in 4-Stellung benachbart
noch ein Wasserstoffatom an das ringständige Stickstoffatom gebunden ist, sind die
neuen Verbindungen enolisierbar, weshalb die - angegebene Formel auch Desmotrope
dieser Verbindungen umfaßt.
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Bedeutet in der angegebenen Formel R einen Methylrest und X eine
Iminogruppe, dann werden die dargestellten Verbindungen als in 9-Stellung durch
einen Alkyl- oder Kohlehydratrest substituierte 2,4-Diimino-2,4-desoxo-6,7-dimethyl-isoalloxazine
bezeichnet. Wenn darin R' ein Ribitylrest ist, dann handelt es sich um die Verbindung
2,4-Diimino-2,4-desoxo-riboflavin. Ist R' eine Methylgruppe, wird die Verbindung
als 2,4-Diimino-2,4-desoxolumiflavin bezeichnet. Bedeutet X Sauerstoff, sind die
so dargestellten Verbindungen in 6- und 7-Stellung durch Methyl- oder Äthylgruppen
und in 9-Stellung durch einen Alkyl- oder Kohlehydratrest substituierte 4-Imino4-desoxo-isoalloxazine.
Besonders bedeutsam sind die Verbindungen, in denen R' ein Alkyl- oder ein Kohlehydratrest
mit nicht mehr als 6 Kohlenstoffatomen, besonders ein Methyl-, Äthyl-, Ribityl-
oder Ribosylrest ist.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man entweder
ein Isoalloxazin der Formel
worin Y ein Sauerstoffatom und R" einen Alkylrest oder einen acetylierten Kohlehydratrest
bedeutet und R die oben angegebene Bedeutung hat, oder ein in 6- und 7-Stellung
durch den Rest Rund in 9-Stellung durch eine Alkylgruppe oder einen acetylierten
Kohlehydratrest substituiertes 2,2,4- oder 2, 4, 4-Trichlor-isoalloxazin mit Ammoniak
um und spaltet die Acetylreste aus dem Kohlehydratrest in an sich bekannter Weise
ab.
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Als Ausgangsstoffe werden vorzugsweise solche chlorierten Isoalloxazine
verwendet, in deren Formel R" einen Alkylrest mit nicht mehr als 6 Kohlenstoffatomen
oder einen acetylierten Kohlehydratrest bedeutet, der ohne Einrechnung der Acetylgruppen
nicht mehr als 6 Kohlenstoffatome enthält. Von den acetylierten Kohlehydratresten
ist der acetylierte Ribitylrest besonders bevorzugt.
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Zur Herstellung der bevorzugten Ausgangsstoffe wird Riboflavin mit
Essigsäureanhydrid in Pyridin acetyliert, um die reaktionsfähigen Gruppen des Kohlehydratrestes
gegen die weiteren Reaktionen zu schützen. Das entstehende Tetraacetylderivat des
Riboflavins wird mit Phosphorpentachlorid in einem geeigneten Lösungsmittel, z.
B. Phosphoroxychlorid, Phosphortrichlorid oder Chloroform, chloriert. Die Chlorierung
des Tetraacetylderivates des Riboflavins kann so erfolgen, daß entweder die 4-Chlor-2-oxo-
oder die 2,2,4- bzw. 2,4,4-Trichlorverbindung entsteht. Die genannten Chlorverbindungen
werden dann erfindungsgemäß durch Behandlung mit Ammoniak, z. B. mit alkoholischem
Ammoniak, verflüssigtem Ammoniak oder konzentriertem, wäßrigem, Ammoniak und anschließende
Entacetylierung in 4-IminoXdesoxo-bzw.
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2, 4-Diimino-2, 4-desoxo-riboflavin übergeführt.
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Für das Verfahren zur Herstellung der als Ausgangsstoffe dienenden
Chlor-isoalloxazine wird ein Schutz nicht beansprucht.
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Die Verfahrensprodukte sind Antagonisten für alle enzymatisch aktiven
Formen der Folsäure und Tetrahydrofolsäure bei der Biosynthese der Desoxyribonuclein
säure oder stellen Zwischenprodukte für die Herstellung solcher Antagonisten dar.
Zum Beispiel wurde die Aktivität des 2, 4-Diimino-2,4-desoxo-riboflavins als Antagonist
für alle enzymatisch aktiven Formen der Folsäure und Tetrahydrofolsäure an Bakterienkulturen
von Lactobacillus leichmannii festgestellt. Es ergab sich, daß dieses Isoalloxazin
bei einer Konzentration von 2ylccm das Wachstum dieses Organismus beeinträchtigt
und daß es bei einer Konzentration von 8 ylccm das Wachstum dieses Organismus völlig
verhindert. Diese Wachstumshemmung kann durch Zugabe von Tetrahydrofolsäure und
bei niederer Konzentration des Isoalloxazins durch Zugabe von Folsäure wieder aufgehoben
werden, wenn molare Mengen an Fol- bzw. Tetrahydrofolsäure, bezogen auf die eingesetzte
2,Diimino-2, 4-desoxy-riboflavinmenge, angewendet werden. Die durch 2,4-Diimino-2,4-desoxyriboflavin
verursachte Wachstumshemmung von Lactobacillus leichmannii wird auch durch Zugabe
von Thymin wieder aufgehoben, woraus zu schließen ist, daß das Isoalloxazin die
Biosynthese der Desoxy-ribonucleinsäure durch Blockierung der Thyminsynthese verhindert.
Weiterhin sind die Verfahrensprodukte wirksame Antagonisten von Riboflavin in biosynthetischen
Prozessen.
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Die erfindungsgemäß hergestellten Isoalloxazine sind sehr gut brauchbar
als Mittel gegen Tumoren, insbesondere gegen maligne Tumoren.
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Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden ausführlich beschriebenen
Beispiele näher erläutert werden.
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Beispiel 1 10 g Riboflavin wurden mit einem Überschuß an Essigsäureanhydrid
in Pyridin acetyliert. Das entstandene Tetraacetylderivat des Riboflavins wurde
aus Chloroform umkristallisiert und dann in Phosphoroxychlorid gelöst.
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Die entstandene Lösung wurde mit 10 g Phosphorpentachlorid gemischt
und unter Ausschluß von Wasser 6 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach wurde das
überschüssige Phosphoroxychlorid durch Vakuumdestillation entfernt. Der Rückstand
wurde in Chloroform gelöst und die Chloroformlösung nach dem Ausschütteln mit Eis-
wasser
und einer kalten Natriumcarbonatlösung im Vakuum eingedampft und der Rückstand im
Exsikkator über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das erhaltene Trockenprodukt
wurde in heißem Alkohol gelöst. Diese alkoholische Lösung wurde mit gasförmigem
Ammoniak gesättigt. Das Einleiten von Ammoniakgas wurde 5 Stunden lang fortgesetzt,
während die Lösung unter Rückfluß gekocht wurde. Die Lösung wurde abgekühlt, dann
20 ccm konzentrierte, wäßrige Ammoniaklösung zugefügt und die erhaltene Mischung
1 Stunde lang unter Rückfluß gekocht. Die Mischung wurde abgekühlt und dann durch
Vakuumdestillation konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde abgekühlt, wobei
sich ein Niederschlag bildete.
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Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Sein Schmelzpunkt
lag oberhalb 3000 C. Das so erhaltene 2,4-Diimino-2,4-desoxo-riboflavin wurde spektrophotometrisch
analysiert. Die ultravioletten Absorptionsmaxima lagen bei 270, 350 (360) und 450
mai (Flavine haben charakteristischerweise drei Absorptionsmaxima).
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Beispiel 2 2,4-Diimino-2,4-desoxo-riboflavin wurde nach dem Verfahren
des Beispiels 1 hergestellt, mit der Abweichung, daß das dort bei der Chlorierungsreaktion
als Lösungsmittel verwendete Phosphoroxychlorid durch Chloroform ersetzt wurde und
daß das Kochen der erhaltenen Lösung unter Rückfluß 24 Stunden lang fortgesetzt
wurde.
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Beispiel 3 2,4-Diimino-2,4-desoxy-riboflavin wurde nach dem Verfahren
des Beispiels 1 hergestellt, mit der Abweichung, daß bei diesem Aminierungsverfahren
die chlorierte Verbindung in eine Reaktionsbombe mit einem Überschuß an flüssigem
Ammoniak gegeben wurde. Die Bombe wurde dann verschlossen und auf eine Temperatur
von 550 C erhitzt; sie wurde dann bei dieser Temperatur 4 Tage lang gehalten, bis
die Reaktion beendet war. Dann wurde der Überschuß an Ammoniak verdampft, und der
Rückstand wurde mit Salzsäure extrahiert. Danach wurde das 2, 4-Diimino-2,4-desoxy-riboflavin
durch Neutralisieren der Lösung mit wäßriger Natriumhydroxydlösung ausgefällt.
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Der Niederschlag wurde durch Filtrieren von der Flüssigkeit getrennt
und getrocknet.
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Beispiel 4
O C1 |
CH3 POCl3 NJY'N \7½ CH |
HN - CH3 POCl3) N |
o= --CH3 N,N-Dimethylanilin °= \ J CH3 |
N N |
CH3 CH3 |
NH2 |
N H3 in CHOH N H N V C H3 |
1300C 6 Stunden O=t |
N N CH3 |
CH3 |
Zu einer Mischung von 6,5 ccm N,N-Dimethylanilin in 50 ccm frisch destilliertem
Phosphoroxychlorid werden 2,56 g (0,01 Mol) Lumiflavin gegeben; die Mischung wird
dann 1 Stunde auf dem Dampfbad erwärmt. Das über-
schüssige Phosphoroxychlorid wird
durch Vakuumdestillation entfernt und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatlösung
wird gut mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Das
Filtrat wird zur Trockne eingedampft und in 60 ccm einer 10gewichtsprozentigen Lösung
von Ammoniak in Methanol gelöst. Die Mischung wird in einem Autoklav 6 Stunden lang
auf 130 bis 1800C erwärmt. Dann wird sie zur Trockne eingedampft, der Rückstand
in
200ccm ln-Salzsäure gelöst und die Lösung filtriert.
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Das Filtrat wird mit wäßriger Ammoniaklösung versetzt, bis der pS-Wert
11 beträgt; der ausgefallene Niederschlag wird gesammelt und getrocknet. Man erhält
so 2,00 g 4-Amino-4-desoxy-lumiflavin.
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Beispiel 5
o Cl |
HN N/POCl3 POCl3 CH3 |
CH2 |
, CH3 N,N-Dimethylanilin O=XuN-N/0/CH3 |
N N N |
CH2 CH2 |
CHOAc CHOAc |
CHOAc CHOAc |
CHOAc CHOAc |
CH20Åc CH20Ac |
1 |
NH2 |
N X-/>CH |
0 C H8 |
N N |
CH2 |
CHOH |
CHOH |
CHOH |
CH2OH |
Zu einer Mischung von 6,5 ccm N,N-Dimethylanilin in 50 ccm frisch destilliertem
Phosphoroxychlorid werden 5,46 g Riboflavintetraacetat gegeben; die Mischung wird
1 Stunde auf dem Dampfbad erwärmt, dann gekühlt und unter schnellem Rühren auf 400
g Eis gegossen, um das überschüssige Phosphoroxychlorid zu zersetzen. Die dunkelgrüne,
ölige Suspension wird wiederholt mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte
werden vereinigt, mit Wasser neutral gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat
getrocknet. Die getrocknete Lösung wird filtriert und auf dem Dampfbad zur Trockne
eingedampft. Der Rückstand wird aus 500 ccm n-Propanol umkristallisiert. Man erhält
so 3,7 g 4-Chlor-4-desoxyriboflavintetraacetat. Eine Probe für die Analyse wurde
nochmals aus n-Propanol umkristallisiert: Analyse für C26H27N4OgCl : Berechnet...
C 53,34, H 4,84, N 9,95, Cd 6,30; gefunden.... C 53,32, H 5,08, N 9,94, Cl 7,33.
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Um das 4-Amino-4-desoxy-riboflavin zu erhalten, wird die Chlorierung
wie oben wiederholt. Das überschüssige Phosphoroxychlorid wird durch Vakuumdestillation
entfernt und der Rückstand in 500 ccm Äthylacetat gelöst.
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Die Äthylacetatlösung wird gut mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in 60 ccm einer 10gewichtsprozentigen Lösung von Ammoniak in
absolutem Methanol suspendiert. Die Suspension wird im Autoklav 6 Stunden lang auf
130 bis 1400C erwärmt. Die Reaktionsmischung wird zur Trockne eingedampft, die Substanz
in 200 ccm 1 n-Salzsäure gelöst und durch Zugabe einer konzentrierten, wäßrigen
Ammoniaklösung ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt,
mit einer 3normalen, wäßrigen Ammoniaklösung gewaschen, im Vakuum getrocknet und
ergibt eine Ausbeute von 3,96 g 4-Amino-4-desoxy-riboflavin.