-
Die
Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung eines midregionalen
Teilpeptids des Proadrenomedullin (mid-proAM), insbesondere die
Bestimmung des proAM (45-92) Teilpeptids in biologischen Flüssigkeiten für Zwecke
der medizinischen Diagnostik, und zwar insbesondere in der Sepsisdiagnostik,
aber auch z.B. in der Krebsdiagnostik und Kardialdiagnostik bzw.
generell im Rahmen der Diagnostik solcher Krankheitszustände, bei
denen eine Bestimmung des Peptids Adrenomedullin (AM) diagnostisch
relevante Ergebnisse liefert. Die erfindungsgemäßen Bestimmungen erfolgen insbesondere
mittels Immunoassays eines Typs, bei dem mit einem markierten Antikörper gearbeitet
wird (Sandwichassay; kompetitiver Assay nach dem SPALT oder SPART-Prinzip).
-
In
dieser Beschreibung wird dabei der Begriff "Diagnostik" grundsätzlich als vereinfachender
Oberbegriff verwendet, der auch Prognostik/Frühprognostik und therapiebegleitende
Ver laufskontrolle einschließen soll.
-
Das
Peptid Adrenomedullin (AM) wurde erstmals 1993 als neues hypotensives
Peptid aus 52 Aminosäuren,
das aus einem menschlichen Phänochromozytom
isoliert worden war, von Kitamura et al. (vgl. 18; Zahlenangaben
beziehen sich auf die beigefügte
Literaturliste) beschrieben. Im gleichen Jahr wurde auch die für ein Vorläuferpeptid
aus 185 Aminosäuren
kodierende cDNA und die vollständige
Aminosäuresequenz
dieses Vorläuferpeptids
beschrieben (19; SEQ ID NO:1). Das Vorläuferpeptid, das u.a. eine Signalsequenz
von 21 Aminosäuren
am N-Terminus umfaßt,
wird als "Präproadrenomedullin" (pre-proAM) bezeichnet.
In der vorliegenden Beschreibung beziehen sich alle angegebenen
Aminosäuren-Positionen
normalerweise auf das 185 Aminosäuren
umfassende pre-proAM, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO:1 aufweist, es
sei denn, es ergibt sich aus dem konkreten Textzusammenhang etwas
anderes.
-
Das
Peptid Adrenomedullin (AM) ist ein 52 Aminosäuren umfassendes Peptid (SEQ
ID NO:2), das die Aminosäuren
95 bis 146 des pre-proAM umfaßt,
aus dem es durch proteolytische Spaltung gebildet wird. Von den
bei der Spaltung des pre-proAM gebildeten Peptid-Fragmenten wurden
bisher im wesentlichen nur wenige Fragmente genauer charakterisiert,
und zwar die physiologisch wirksamen Peptide Adrenomedullin (AM)
und "PAMP", ein Peptid aus
den 20 Aminosäuren
(22-41), die im pre-proAM auf die 21 Aminosäuren des Signalpeptids folgen.
Sowohl von AM als PAMP wurden außerdem auch physiologisch aktive
Unterfragmente entdeckt und näher
untersucht.
-
Die
Entdeckung und Charakterisierung des AM im Jahre 1993 löste eine
intensive Forschungstätigkeit und
eine Flut von Publikationen aus, deren Ergebnisse in jüngerer Zeit
in verschiedenen Review-Artikeln zusammengefaßt wurden, wobei im Rahmen
der vorliegenden Beschreibung insbesondere hingewiesen wird auf die
in einer AM gewidmeten Nummer von "Pep tides" (Peptides 22 (2001)) zu findenden Artikel,
insbesondere (12) und (2). Ein weiterer Review ist (3). Bei den
bisherigen wissenschaftlichen Untersuchungen wurde u.a. gefunden,
dass AM als multifunktionelles regulatorisches Peptid angesehen
werden kann. Es wird in einer durch Glycin verlängerten inaktiven Form in die
Zirkulation freigesetzt (5). Ferner existiert ein für AM spezifisches
Bindeprotein (11), das wahrscheinlich ebenfalls die Wirkung des
AM moduliert.
-
Diejenigen
physiologischen Wirkungen des AM, wie auch des PAMP, die bei den
bisherigen Untersuchungen im Vordergrund standen, waren den Blutdruck
beeinflussende Wirkungen. So ist AM ein wirksamer Vasodilatator,
wobei die hypotensive Wirkung insbesondere Peptidabschnitten im
C-terminalen Teil des AM zugeordnet werden kann. Peptidsequenzen
vom N-Terminus des AM zeigen dagegen hypertensive Wirkungen (vgl.
z.B. (6)).
-
Es
wurde ferner gefunden, dass das aus dem pre-proAM gebildete o.g.
weitere physiologisch aktive Peptid PAMP ebenfalls eine hypotensive
Wirkung zeigt, auch wenn es einen anderen Wirkmechanismus als AM
aufzuweisen scheint (vgl. neben den o.g. Review-Artikeln (2) und
(3) auch (8), (9) oder (14) sowie
EP 0 622 458 A2 ).
-
Es
wurde ferner festgestellt, dass die Konzentrationen des AM, die
man in der Zirkulation und anderen biologischen Flüssigkeiten
messen kann, bei einer Reihe von Krankheitszuständen signifikant über den
bei gesunden Kontrollpersonen zu findenden Konzentrationen liegen.
So sind die AM-Spiegel bei Patienten mit Stauungsinsuffizienz (congestive
heart failure), Myokardinfarkt, Nierenerkrankungen, Bluthochdruckerkrankungen, Diabetes
mellitus, in der akuten Phase eines Schocks und bei Sepsis und septischem
Schock signifikant, wenn auch in unterschiedlichem Maße erhöht (vgl.
z.B. (2), Kapitel 7., und die dazu zitierte Literatur). Auch die PAMP- Konzentrationen sind
bei einigen der genannten Krankheitszustände erhöht, wobei allerdings die Plasmaspiegel
gegenüber
AM relativ erniedrigt sind ((2); S.1702).
-
Es
ist ferner bekannt, dass bei Sepsis bzw. beim septischen Schock
ungewöhnlich
hohe Konzentrationen an AM zu beobachten sind (vgl. (2) sowie (4),
(1), (13), (15) und (16)). Die Befunde werden zu den typischen hämodynamischen
Veränderungen
in Beziehung gesetzt, die als typische Erscheinungen des Krankheitsverlaufs
bei Patienten mit Sepsis und anderen schweren Krankheitsbildern
wie z.B. SIRS bekannt sind.
-
Obwohl
davon ausgegangen wird, dass AM und PAMP aus dem gleichen Vorläuferpeptid,
dem pre-proAM (SEQ ID NO:1) gebildet werden, in dem die diesen Peptiden
entsprechenden Aminosäuresequenzen
als Teilpeptide in äquimolaren
Mengen vorhanden sind, sind die in biologischen Flüssigkeiten
messbaren Konzentrationen von AM bzw. PAMP anscheinend verschieden.
Das ist nichts Ungewöhnliches.
So können
die messbaren Konzentrationen verschiedener Abbauprodukte ein- und
desselben Vorläuferpeptids
z.B. deshalb verschieden sein, weil sie das Ergebnis verschiedener
konkurrierender Abbauwege sind, die z.B. bei unterschiedlichen Krankheitszuständen zu
einer unterschiedlichen Fragmentierung eines Vorläuferpeptides
und damit zu verschiedenen Abbauprodukten führen. Bestimmte im Vorläuferpeptid
enthaltene Teilpeptide können dabei
als freie Peptide gebildet oder auch nicht gebildet werden, und/oder
verschiedene Peptide werden auf verschiedene Weise und in verschiedenen
Mengen gebildet. Auch wenn zur Prozessierung eines Vorläuferpeptids
nur ein einziger Abbauweg beschritten wird, und somit alle Abbauprodukte
aus ein und demselben Vorläuferpeptid
stammen und an sich primär
in äquimolaren
Mengen entstanden sein müssen,
können
die in biologischen Flüssigkeiten
messbaren Stationärkonzentrationen
verschiedener Teilpeptide und Fragmente sehr verschieden sein, nämlich z.B.
dann, wenn einzelne von ihnen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit
gebildet werden und/oder in der jeweiligen biologischen Flüssigkeit
unterschiedliche individuelle Stabilitäten (Lebensdauern) aufweisen,
oder wenn sie aufgrund unterschiedlicher Clearance-Mechanismen und/oder
mit unterschiedlichen Clearance-Geschwindigkeiten aus der Zirkulation
entfernt werden.
-
So
kann man im Zusammenhang mit der Bildung von AM zwar davon ausgehen,
dass bei der proteolytischen Prozessierung von pre-proAM neben AM
und PAMP auch noch andere Peptidfragmente gebildet werden müssen. Es
sind jedoch in der wissenschaftichen Literatur keinerlei Daten zum
Auftreten und zur Stabilität
derartiger möglicher
weiterer Fragmente zu finden, und das, obwohl zu Forschungszwecken
z.B. von der Fa. Phoenix Pharmaceuticals, Inc., derartigen pre-proAM
Peptidfragmenten entsprechende Peptide und auch Radioimmunoassays
(RIA) zu deren Bestimmung kommerziell angeboten werden.
-
Aufbauend
auf Erkenntnissen, die mit dem Auftreten des Prohormons Procalcitonin
bei Sepsis gewonnen worden waren (vgl. z.B.
EP 0 656 121 B1 ), und ausgehend
von der Hypothese, dass bei Sepsis möglicherweise auch andere normalerweise
nicht zu beobachtende Prohormone in der Zirkulation von Sepsispatienten
nachzuweisen sein könnten,
wurde von der Anmelderin unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
RIA mit einem Antikörper,
der an die Aminosäuren
45-92 des pre-proAM bindet, jedoch nicht an Sequenzen des reifen
AM, ein orientierender Versuch zum Nachweis von Proadrenomedullin
in Seren von Sepsispatienten durchgeführt. Die Ergebnisse, die in
der Veröffentlichung
WO 00/22439 beschrieben werden, belegen eine gegenüber gesunden
Kontrollpersonen erhöhte
Konzentration eines vorläufig
als Proadrenomedullin bezeichneten Analyten. Die gemessene Erhöhung lag
jedoch nur in der Größenordnung
von etwa dem Doppelten des Normalwerts, war also relativ geringfügig. Angesichts
von Literaturdaten, die bei Sepsis von erhöhten AM-Werten in der Größenordnung
des 12fachen Normalwerts berichten, erschien die beobachtete Erhöhung auf
etwa das Doppelte des Normalwerts für die mit dem verwendeten Assay
gemessene proAM-Immunreaktivität
wenig attraktiv, im Rahmen der Sepsisdiagnostik anstelle von AM
diese "proAM-Immunreaktivität" zu bestimmen. Ob
bei dem beschriebenen Versuch tatsächlich Proadrenomedullin (22-185
bzw. 22-146) gemessen wurde, oder ob die auf die beschriebene Weise
gemessene Proadrenomedullin-Immunreaktivität auf eine oder mehrere andere
in den Patientenproben auftretende Spezies zurückzuführen war, war auf der Basis
der gemessenen Befunde nicht entscheidbar.
-
Im
Rahmen ihrer umfassenden Forschungs- und Entwicklungsarbeiten zu
Biomarkern, die für
die Sepsisdiagnostik von klinischem Nutzen sein können, und
insbesondere auch im Hinblick auf das Ziel, auf dem Wege einer Multiparameter-Bestimmung (gleichzeitige
Bestimmung mehrerer Biomarker) die Sepsis-Feindiagnostik verbessern
zu können,
zog die Anmelderin auch die Bestimmung bzw. zusätzliche Bestimmung des bei
Sepsis erhöhten
AM in Betracht. Wie sich jedoch zeigte, war eine zuverlässige Bestimmung
von AM unter Gewinnung von Resultaten, die einen einfachen Vergleich
von Messergebnissen über
die Grenzen der jeweiligen einzelnen Forschungsarbeit hinaus ermöglichen
würden,
nicht ohne weiteres möglich.
Die Daten der meisten Forschungsarbeiten wurden mit RIAS gewonnen,
die auf einer Konkurrenz von AM mit einem markierten Markerpeptid
um eine gemeinsame AM-Bindungsstelle eines Antikörpers beruhten. Die jeweiligen
RIAS waren oft individuelle Entwicklungen, und es wurde mit verschiedenen
Antikörpern
und Peptiden gearbeitet, was einen quantitativen Interassay-Vergleich
der erhaltenen Messergebnisse erschwerte (vgl. z.B. 10). Außerdem hatten
jüngere
Forschungsergebnisse gezeigt, dass verschiedene Formen von AM (mit
oder ohne C-terminalem Glycinrest) existierten, denen unterschiedliche
Aktivitäten
zugeordnet werden konnten (vgl. (2) sowie z.B. (5)). Die Entdeckung
eines Bindeproteins (vgl. 11) für
AM führte
zu einer weiteren Verkomplizierung der Situation – sowohl
der vorhandene oder fehlende Glycinrest, als auch die fehlende oder
vorhandene Komplexierung von AM durch sein Bindeprotein können die
Bestimmung von AM in Abhängigkeit
vom jeweiligen Assay unvorhersehbar beeinflussen. Diese Umstände stellen
hohe Anforderungen an einen validen Immunoassay für AM, der
für Routineuntersuchungen
geeignet ist: Für
einen solchen Assay müssen
geeignete Antikörper
gefunden werden, die an solche AM-Bereiche binden, die nicht durch
das Bindeprotein belegt sind – wenn es
solche Bereiche überhaupt
gibt. Oder es muß ein
vorausgehender Schritt der Freisetzung und Abtrennung des Bindeproteins
vom AM durchgeführt
werden, wobei der Einfluß eines
solchen Schritts auf die Stabilität des AM und/oder die erhältlichen
Messwerte nur schwer abschätzbar
ist. Dass neben dem kompletten AM physiologisch auch verschiedene
AM-Teilpeptide gefunden werden und im physiologischen Gesamtgeschenen
eine Rolle zu spielen scheinen, erschwert die Schaffung eines validen
Immunoassays und die Vergleichbarkeit von der Literatur entnehmbaren
Meßwerten
weiter.
-
Die
Anmelderin hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein valides, routinetaugliches
Meßverfahren
zu schaffen, das gegenüber
den o.g. Störeinflüssen einer
direkten Messung von AM weitgehend unempfindlich ist und das zuverlässige Werte
für die
physiologische Produktion von AM und/oder seiner Vorläufer bei
verschiedenen Krankheitszuständen,
insbesondere Sepsis oder anderen Krankheitszuständen, bei denen erhöhte Werte
für AM
gefunden werden, liefern kann.
-
Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch
gelöst,
dass zu Diagnosezwecken nicht AM oder ein anderes der bisher untersuchten
pre-proAM Teilpeptide bestimmt wird, sondern ein midregionales Teilpeptid, das
die Aminosäuren
42-95 des preproAM enthält
(SEQ ID NO:3), wobei die Bestimmung besonders bevorzugt mit einem
Immunoassay erfolgt, bei dem mit einem markierten Antikörper gearbeitet
wird.
-
Anspruch
1 gibt den Kern der vorliegenden Erfindung wieder.
-
Vorteilhafte
und derzeit bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind den Unteransprüchen zu
entnehmen.
-
Zur
Lösung
der Aufgabe, ein Bestimmungsverfahren zu schaffen, das die Bildung
von AM bzw. seiner Vorläufer-
oder Nebenprodukte bei verschiedenen Krankheitszuständen, insbesondere
Sepsis, aber auch z.B. Kardialerkrankungen, Bluthochdruckerkrankungen
oder Krebserkrankungen oder anderen Erkrankungen, bei denen erhöhte AM-Spiegel
beobachtet werden können,
zuverlässig
erfaßt,
wurde, trotz der eher wenig vielversprechenden Ergebnisse, einerseits
an das in der WO 00/22439 beschriebene Ergebnis einer bei Sepsis
erhöhten "Proadrenomedullin-Immunreaktivität" angeknüpft. Andererseits
wurden ergänzende
umfangreiche klinische Studien unter Vermessung von Seren von Sepsis-,
Krebs- und Kardialpatienten mit verschiedenen neuen Assays durchgeführt, die überraschender
Weise Messwerte mit deutlich verbesserter Validität lieferten.
-
Die
durchgeführten
Untersuchungen und die signifikantesten Ergebnisse dieser Untersuchungen
werden nachfolgend genauer erläutert,
wobei auf Figuren Bezug genommen wird.
-
Dabei
zeigen:
-
1 die Ergebnisse der Messung
von mid-proAM in Seren von 109 gesunden Normalpersonen, gegenübergestellt
den Ergebnissen der Messung von 110 Seren von Septikern sowie von
20 Seren von Patienten mit Polytrauma. Alle Messungen wurden mit
einem SPALT-Assay
vorgenommen, wie er im experimentellen Teil genauer beschrieben
wird. Bemerkenswert ist, dass – anders
als im Falle von Procalcitonin und anderen Entzündungsmarkern – nur die
Werte für
die Sepsispatienten (hohe Konzentrationen von ca. 550 pmol/l bzw. 550
fmol/ml gegenüber
Werten von 33 pmol/l für
Gesunde) erhöht
waren, nicht jedoch die Werte für
Polytrauma-Patienten.
-
2 die Ergebnisse der Messung
von mid-proAM in Seren von 274 gesunden Normalpersonen, von 267
Septikern, von 20 Patienten mit Herzerkrankungen und 49 Krebspatienten
mit einem Sandwichassay, wie er im experimentellen Teil näher beschrieben
ist.
-
Im
Zusammenhang mit den Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung
führten,
rückte
die Frage nach der Natur der bei den verschiedenen Erkrankungen
gemessenen Spezies, bzw. nach der Wahl einer besonders geeigneten
Spezies für
AM/proAM- Messungen, in den Vordergrund des Interesses. Da RIAs prinzipiell
wenig geeignet sind, wertvolle Erkenntnisse zu dieser Frage zu liefern,
und außerdem
RIAS aus verschiedenen Gründen
auch für
das angestrebte Entwicklungsziel der Schaffung eines validen Assays
für Routinebestimmungen
wenig aussichtsreich erschienen, mußten zuerst neue Assays entwickelt
werden, wobei Immunoassays eines Typs gewählt wurden, bei denen mit markierten
Antikörpern
gearbeitet werden konnte.
-
Im
Rahmen der Untersuchung der Frage, ob die gemäß der WO 00/22439 gemessenen
erhöhten
Werte für
eine Proadrenomedullin-Immunreaktivität bei Sepsis tatsächlich erhöhte Proadrenomedullin-Konzentrationen
in den untersuchten Proben widerspiegeln, wurde zuerst ein Sandwichassay
entwickelt, der aufgrund des Assaydesigns weitgehend spezifisch
für Proadrenomedullin
(22-146 bzw. 22-185) war, indem er weder AM noch pre-proAM-Teilpeptide,
die kein AM enthielten, erkennen konnte.
-
Bei
diesem Sandwichassay wurde mit zwei unterschiedlichen Antikörpern gearbeitet,
die spezifisch die Aminosäuresequenz
des Peptids (69-86: Peptidbereich SPCD19; SEQ ID NO:4) bzw. eines
Peptids (129-147; C-terminates AM-Peptid) erkannten. Als Standarmaterial
diente das rekombinante vollständige Proadrenomedullin
(22-185), das in einem kommerziellen kompetitiven AM-Assay kalibriert
worden war.
-
Bei
der Vermessung von Seren von gesunden Normalpersonen und von Sepsispatienten
wurden mit diesem Sandwichassay keine erhöhten Messwerte über dem
Detektionslimit von ca. 40 pg/ml erhalten (Ergebnisse nicht gezeigt).
Aus diesen Befunden mußte
der Schluß gezogen
werden, dass die bei Sepsis gefundene erhöhte proAM-Immunreaktivität nicht
auf die Anwesenheit des Proadrenomedullin-Peptids in den Proben
zurück
zu führen
ist.
-
Zur
weiteren Prüfung
der Frage, ob die relativ wenig (ca. 2fach) erhöhten "proAM-Immunreaktivitäts-Meßwerte" der früheren Messungen real gewesen
waren, oder ob bei diesen Messungen möglicherweise Artefakte eine
Rolle spielten, die auf den verwendeten kommerziellen RIA zurück zu führen waren,
wurde ein weiterer Assay entwickelt, der auf dem sogenannten SPALT-Prinzip
beruhte. Bei einem solchen Assay wird eine Kompetition zwischen
einem festphasengebundenen (solid phase = SP) Kompetitor für den Analyten ("Antigen" = A) und dem Analyten
um gemeinsame Bindungsstellen eines markierten Antikörpers, der
sich in der Reaktionsflüssigkeit
befindet, genutzt. Im vorliegenden Fall war der Antikörper mit
einem Lumineszenz-Tracer (LT) markiert (vgl. Experimenteller Teil).
Die Anwesenheit des Analyten, bzw. die Besetzung von Bindungsstellen
des Antikörpers
durch konkurrierende Bindungspartner aus der Probe, zeigt sich als
Verminderung der Bindung des markierten Antikörpers an die Festphase.
-
Als
festphasengebundener Kompetitor diente in dem beschriebenen SPALT-Assay
das festphasengebundene Peptid (69-86: Peptidbereich SPCD19; SEQ
ID NO:4), als Antikörper
ein gegen dieses Peptid gebildeter und dieses Peptid erkennender
markierter anti-SPCD19-Schaf-Antikörper (affinitätsgereinigt;
vgl. Experimenteller Teil). Als Standard dienten Verdünnungen
des Peptids SPCD19 in normalem Pferdeserum. Die Nachweisgrenze lag
bei ca. 50 pmol/l. Bei den Bestimmungen wurden jeweils 100 μl Probe (bzw.
Standard) und 100 μl
Tracer bei 4°C
in mit dem SPCD19-Peptid beschichteten Polysorb-Tuben über Nach
inkubiert, wonach mit 4 × 1
ml Standardwaschlösung
aus dem LUMItest® der Anmelderin gewaschen
und dann in einem Luminometer vermessen wurde.
-
Bei
einer Vermessung von Sepsisseren mit diesem SPRLT-Assay wurde eine
drastische Abgrenzung von Septikern gegen gesunde Normalpersonen
gefunden. Bei einem Detektionslimit von ca. 1 ng/ml wurden für Seren
von Septikern Werte gefunden, die im Mittel bei rund 19000 pg/ml
lagen. Die deutliche Unterscheidung von Seren von Septikern und
Gesunden war angesichts der eher geringfügigen Erhöhung bei den Vorversuchen unter
Verwendung eines kommerziellen RIA (WO 00/22439) sehr überraschend.
-
Die
klinischen Messungen mit dem genannten SPALT-Assay wurden ausgeweitet.
Die Ergebnisse der ausgeweiteten Studie sind in 1 graphisch zusammengeafßt, wobei
auf die obige Erläuterung
zu 1 ausdrücklich verwiesen
wird.
-
Die
o.g. positiven Ergebnisse mit SPALT-Assays zeigten, dass (i) die
in Sepsisseren gemessene "proAM-Immunreaktivität" zwar nicht auf die
tatsächliche
Anwesenheit von Proadrenomedullin zugeführt werden konnte, aber (ii)
eine entsprechende Messung eines Analyten mit einer Aminosäuresequenz
aus einem mittleren Abschnitt des pre-proAM, genauer des mid-proAM
gemäß SEQ ID
NO:3, geeignet war, Septiker klar von Normalpersonen zu unterscheiden.
-
Auf
diesen Ergebnisse aufbauend wurde die Untersuchgun in zwei Richtungen
vertieft:
- 1. Die tatsächlich in der Zirkulation auftretende
preproAM Spezies sollte identifiziert und ggf. auf ihre Eignung
als Biomarker für
Routinemessungen untersucht werden.
- 2. Parallel dazu sollte vertieft werden, inwieweit die Messung
dieser Spezies diagnostisch wertvolle Meßergebnisse liefert.
-
Die
Ergebnisse sind nachfolgend unter Bezugnahme auf den experimentellen
Teil noch näher
beschrieben. Sie lassen sich wie folgt zusammen fassen:
- 1. In der Zirkulation (Serum, Plasma) findet sich in signifikant
erhöher
Konzentration, und einer gut reproduzierbaren Messbarkeit, ein Peptid,
das die Aminosäuren
45-92 des pre-proAM enthält
bzw. aus diesen besteht (SEQ ID NO:3) und das in dieser Anmeldung
als mid-proAM bezeichnet wird.
- 2. Die Vermessung von Seren Kranker mit einem Assay, der spezifisch
dieses mid-proAM mißt,
liefert Meßergebnisse,
die nicht nur eine klare Unterscheidung von Septikern und Normalpersonen
ermöglichen,
sondern die – in
Verbindung mit klinischen Befunden – auch andere Erkrankungen
erkennen lassen, die mit einer gesteigerten Bildung von AM verbunden
sind, und zwar insbesondere Kardial- und Krebserkrankungen.
-
Das
Verfahren betrifft somit insbesondere die Bestimmung des mid-proAM
in der Zirkulation eines Patienten, und zwar insbesondere unter
Verwendung von Plasmaproben.
-
Nachfolgend
werden bestimmte allgemeine Aspekte bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung noch näher
erläutert,
und es werden weitere ausgewählte
Versuchsergebnisse näher
erläutert.
-
Für die praktische
Umsetzung der Erfindung wird ein Assay format bevorzugt, bei dem
mit markierten Antikörpern
gearbeitet wird, z.B. ein Assay, der nach dem oben beschriebenen
kompetitiven SPALT-Prinzip arbeitet (wobei jedoch auch andere Markierungen,
z.B. radioaktive als SPART-Assay, eingesetzt werden können).
-
Besonders
bevorzugt sind jedoch nicht-kompetitive Sandwichassays, z.B. der
Art, wie er für
die weitergehenden vertiefenden Untersuchungen verwendet wurde und
nachfolgend genauer beschrieben wird.
-
Nicht-kompetitive
Sandwich-Immunoassays (Zweiseiten-Immunoassays) haben gegenüber kompetitiven
Immunoassays eine Reihe von Vorteilen, zu denen gehört, daß sie besser
als Festphasenassays (heterogene Assays) ausgelegt werden können, in
der Handhabbarkeit robuster sein können, Meßergebnisse mit einer höheren Sensititivät liefern
können
und sich auch besser für
eine Automatisierung und Serienmessung eignen. Außerdem können sie
im Vergleich mit kompetitiven Immunoassays, die mit nur einem Typ
von Antikörper arbeiten,
auch zusätzliche
Aussagen liefern, indem Sandwich-Immunoassays nur solche Moleküle bzw.
Peptide erkennen, bei denen beide Bindungsstellen für die für die Sandwichbildung
verwendeten Antikörper
auf dem gleichen Molekül
vorhanden sind.
-
Die
Antikörper
können
grundsätzlich
beliebige geeignete monoklonale und/oder polyklonale Antikörper sein,
wobei jedoch derzeit affinätsgereinigte
polyklonale Antikörper
bevorzugt werden.
-
Besonders
bevorzugt wird einer der Antikörper
durch Immunisierung eines Tiers, insbesondere Schafs, mit einem
Antigen erhalten, das eine synthetische Peptidsequenz enthält, die
die Aminosäuren
69-86 des pre-proAM sowie einen zusätzlichen Cysteinrest am N-Terminus
aufweist (SEQ ID NO:4). Der andere Antikörper kann z.B. entsprechend
mit einem Antigen erhalten werden, das eine synthetische Peptidsequenz
enthält,
die die Aminosäuren
83-94 (Peptidbereich PSR13; SEQ ID NO:5) des pre-proRM mit einem
zusätzlichen Cysteinrest
am N-Terminus aufweist. Die unter Verwendung der genannten synthetischen
Peptide, die gemeinsam einen lückenlosen
midregionalen Abschnitt der proAM-Sequenz erfassen, erhaltenen Antikörper erkennen
nur Bindungsstellen im Bereich des o.g. mid-proAM (Aminosäuren 45-92),
genauer im Bereich der Aminosäuren
60-92 des pre-proAM.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Verfahren als heterogener Sandwich-Immunoassay durchgeführt, bei
dem einer der Antikörper
an eine beliebige Festphase, beispielsweise die Wände beschichteter
Teströhrchen
(z.B. aus Polystyrol; "Coated
Tubes"; CT) oder
an Mikrotiterplatten, zum Beispiel aus Polystyrol, oder an Partikel,
beispielsweise Magnetpartikel immobilisiert ist, während der
andere Antikörper
einen Rest trägt,
der ein direkt nachweisbares Label darstellt oder eine selektive
Verknüpfung
mit einem Label ermöglicht
und der Detektion der gebildeten Sandwich-Strukturen dient. Auch
eine zeitlich verzögerte
bzw. nachträgliche
Immobilisierung unter Verwendung geeigneter Festphasen ist möglich.
-
Grundsätzlich können alle
in Assays der beschriebenen Art verwendbaren Markierungstechniken
angewandt werden, zu denen Markierungen mit Radioisotopen, Enzymen,
Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder Biolumineszenz-Labeln und direkt
optisch detektierbaren Farbmarkierungen, wie beispielsweise Goldatomen
und Farbstoffteilchen, wie sie insbesondere für sog. Point-of-Care (POC)
oder Schnelltests verwendet werden, gehören. Die beiden Antikörper können auch
im Falle heterogener Sandwich-Immunoassays Teile eines Nachweissystems
der nachfolgend im Zusammenhang mit homogenen Assays beschriebenen
Art aufweisen.
-
Es
liegt somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung, das erfindungsgemäße Verfahren
auch als Schnelltest auszugestalten.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann ferner als homogenes Verfahren ausgestaltet werden, bei dem die
aus den beiden Antikörpern
und dem nachzuweisenden mid-proAM gebildeten Sandwichkomplexe in
der flüssigen
Phase suspendiert bleiben.
-
In
einem solchen Fall ist es bevorzugt, beide Antikörper mit Teilen eines Nachweissystems
zu markieren, das dann, wenn beide Antikörper in einen einzigen Sandwich
integriert werden, eine Signalerzeugung oder Signalauslösung ermöglicht.
Derartige Techniken sind insbesondere als Fluoreszenzverstärkungs-
oder Fluoreszenzlöschungs-Nachweisver-Eahren ausgestaltbar.
Ein besonderes bevorzugtes derartiges Verfahren betrifft die Verwendung
von paarweise einzusetzenden Nachweisreagenzien, wie sie beispielsweise
beschrieben sind in
US-A-4
822 733 ,
EP-B1-180
492 oder
EP-B1-539
477 und dem darin zitierten Stand der Technik. Sie ermöglichen
eine Messung, die selektiv nur Reaktionsprodukte erfaßt, die
beide Markierungskomponenten in einem einzigen Immunkomplex enthalten,
direkt in der Reaktionsmischung. Als Beispiel ist auf die unter
den Marken TRACE
® (Time Resolved Amplified
Cryptate Emission) bzw. KRYPTOR
® angebotene
Technologie zu verweisen, die die Lehren der o.g. Anmeldungen umsetzt.
-
Es
zeigte sich überraschenderweise,
daß die
erfindungsgemäße Bestimmung
des mid-proAM (SEQ ID NO:3) hoch signifikante Meßergebnisse liefert. Diese
Aussage gilt, wie nachfolgend gezeigt wird, nicht nur für die Sepsisdiagnostik,
sondern auch für
die Kardialdiagnostik und die Krebsdiagnostik.
-
Es
wird davon ausgegangen, dass das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren besonders
vorteilhaft auch im Rahmen einer sogenannten Multiparameterdiagnostik
durchgeführt
werden kann, und zwar sowohl auf dem Gebiet der Kardialdiagnostik
als auch der Sepsis- und der Krebsdiagnostik. Weitere dabei bestimmte
Parameter sind beispielsweise die Kardialparameter ANP, BNP, proANP
oder proBNP oder Sepsisparameter, die z.B. aus der Gruppe ausgewählt sind,
die besteht aus Anti-Gangliosid-Antikörpern, den Proteinen Procalcitonin,
CA 125, CA 19-9, S100B, S100A-Proteinen, LASP-1, löslichen
Cytokeratin-Fragmenten,
insbesondere CYFRA 21, TPS und/oder löslichen Cytokeratin-1-Fragmenten
(sCY1F), den Peptiden Inflammin und CHP, anderen Peptid-Prohormonen,
der Glycin-N-Acyltransferase (GNAT), der Carbamoylphosphat Synthetase
1 (CPS 1) und dem C-reaktiven Protein (CRP) oder Fragmenten davon.
Bei den genannten Multiparameter-Bestimmungen ist vorgesehen, die
Messergebnisse für
mehrere Parameter gleichzeitig oder parallel zu bestimmen und z.B.
mit Hilfe eines Computerprogramms, das auch diagnostisch signifikante
Parameterkorrelationen nutzt, auszuwerten.
-
Nachfolgend
wird die Erfindung durch eine Beschreibung der Herstellung der bevorzugten
Assay-Komponenten, der Durchführung
einer bevorzugten Ausführungsform
eines Assays vom Sandwich-Typ und der unter Verwendung eines solchen
Assays erhaltenen Ergebnisse von mid-proAM-Bestimmungen in EDTA-Plasmen von Kontrollpersonen,
und von Sepsis-, Herz- und Krebspatienten näher erläutert.
-
Ferner
wird die Identifizierung des tatsächlich bestimmten, in der Zirkulation
auftretenden proAM-Teilpeptids beschrieben.
-
Experimenteller Teil
-
Material und Methoden
-
1. Peptidsynthesen
-
Abgeleitet
von der bekannten Aminosäuresequenz
des humanen Präproadrenomedullin
(SEQ ID NO:1) wurden ein erster Bereich (Pos. 69-86: Peptidbereich
SPCD19; SEQ ID NO:4) und ein zweiter Bereich (Pos. 83-94: Peptidbereich
PSR13; SEQ ID NO:5) ausgewählt.
Jeweils ergänzt
um einen N-terminalen Cystein-Rest wurden beide Bereiche nach Standardverfahren
als lösliche
Peptide chemisch synthetisiert, gereinigt, mittels Massenspektrometrie
und Reversed Phase HPLC qualitätskontrolliert
und in Aliquots lyophilisiert (Firma JERINI AG, Berlin, Deutschland).
Die Aminosäuresequenzen
der Peptide lauten:
Peptid SPCD19: CRPQDMKGASRSPEDSSPD (SEQ
ID NO:4)
Peptid PSR13: CSSPDAARI RVKR (SEQ ID NO:5)
-
Außerdem wurde
als Standard das gesamte mid-proAM (entsprechend Pos. 45-92; SEQ
ID NO:3) synthetisiert:
ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRV
(SEQ ID NO:3)
-
2. Konjugation
und Immunisierung
-
Mittels
MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid Ester) wurden die obigen
Peptide SPCD19 bzw. PSR13 an das Trägerprotein KLH (Keyhole limpet
hemocyanin) konjugiert (s. Arbeitsanleitung "NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers" Firma PIERCE, Rockford,
IL, USA). Mit diesen Konjugaten wurden Schafe nach folgendem Schema
immunisiert: Jedes Schaf erhielt initial 100 μg Konjugat (Massenangabe bezogen
auf den Peptid-Anteil des Konjugats) und anschließend 4-wöchentlich
je 50 μg
Konjugat (Massenangabe bezogen auf den Peptid-Anteil des Konjugats). Beginnend mit
dem vierten Monat nach Beginn der Immunisierung wurden 4-wöchentlich
je Schaf 700 ml Blut abgenommen und daraus durch Zentrifugation
Antiserum gewonnen. Konjugationen, Immunisierungen und Gewinnung
von Antiseren wurden von der Firma MicroPharm, Carmarthenshire,
UK, durchgeführt.
-
3. Reinigung
der Antikörper
-
In
einem 1-Schritt Verfahren wurden aus den Antiseren, die beginnend
mit dem vierten Monat nach der Immuniserung gewonnen worden waren,
die Peptid-spezifischen Antikörper
wie folgt präpariert.
-
Dazu
wurden zunächst
die o.g. Peptide SPCD19 und PSR13 an SulfoLink Gel gekoppelt (s.
Arbeitsanleitung "SulfoLink
Kit" Firma PIERCE,
Rockford, IL, USA). Dabei wurden zur Kopplung je 5 mg Peptid pro
5 ml Gel angeboten.
-
Die
Affinitätsreinigung
von Peptid-spezifischen Antikörpern
aus Schaf-Antiseren gegen beide Peptide wurde wie folgt durchgeführt:
Die
Peptid-Säulen
wurden zunächst
drei mal im Wechsel mit je 10 ml Elutionspuffer (50 mM Citronensäure, pH 2.2)
und Bindungspuffer (100 mM Natriumphosphat, 0.1% Tween, pH 6.8)
gewaschen. 100 ml der Schaf-Antiseren wurden über 0,2 μm filtriert und mit dem vorhandenen
Säulenmaterial
versetzt. Dazu wurde das Gel quantitativ mit 10 ml Bindungspuffer
aus der Säule
gespült.
Die Inkubation erfolgte über
Nacht bei Raumtemperatur unter Schwenken. Die Ansätze wurden
quantitativ in Leersäulen
(NAP 25, Pharmacia, entleert) überführt. Die
Durchläufe
wurden verworfen. Anschließend
wurde mit 250 ml Bindungspuffer proteinfrei (Proteingehalt des Wascheluats < 0,02 A280 nm) gewaschen.
Auf, die gewaschene Säulen
wurde Elutionspuffer gegeben, und es wurden Fraktionen á 1 ml
gesammelt. Von jeder Fraktion wurde der Proteingehalt mittels der BCR-Methode
(s. Arbeitsanleitung Firma PIERCE, Rockford, IL, USA) bestimmt.
Fraktionen mit Proteinkonzentrationen > 0.8 mg/ml wurden gepoolt. Nach einer
Proteinbestimmung der Pools mittels der BCR-Methode ergaben sich
Ausbeuten von 49 mg für
den anti-SPCD19 Antikörper
(affinitätsgereinigt;
polyklonal) und 60 mg für
den anti-PSR13 Antikörper
(affinitätsgereinigt;
polykonal).
-
4. Markierung
-
Über eine
NAP-5 Gelfiltrationssäule
(Pharmacia) wurden 500 μl
des gereinigten anti-SPCD19 Antikörpers (s.o.) in 1 m1 100 mM
Kalium-Phosphatpuffer (pH 8,0) nach Arbeitsanleitung umgepuffert.
Die Proteinkonzentationsbestimmung der Antikörperlösung ergab einen Wert von 1,5
mg/ml.
-
Zur
Chemilumineszenzmarkierung des Antikörpers wurden 67 μl der Antikörperlösung mit
10 μl MA70-Akridinium-NHS-Ester
(1 mg/ml; Firma HOECHST Behring) versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Dann wurden 423 μl
1 M Glycin zugesetzt und weitere 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurde
der Markierungsansatz über
eine NAP-5 Gelfiltrationssäule
(Pharmacia) in 1 ml Laufmittel A (50 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl,
pH 7.4) nach Arbeitsanleitung umgepuffert und dabei von niedermolekularen
Bestandteilen befreit. Zur Abtrennung letzter Reste nicht an Antikörper gebundenen
Labels wurde eine Gelfiltrations-HPLC durchgeführt (Säule: Waters Protein Pak SW300).
Die Probe wurde aufgetragen und bei einer Flußrate von 1 ml/min mit Laufmittel
A chromatographiert. Mit einem Durchflußphotometer wurden die Wellenlängen 280
nm und 368 nm gemessen. Das Absorptionsverhältnis 368 nm/280 nm als Maß für den Markierungsgrad
des Antikörpers
betrug am Peak 0.10. Die monomeren Antikörper enthaltenden Fraktionen
(Retentionszeit 8-10 min) wurden gesammelt und in 3 ml 100 mM Natriumphosphat,
150 mM NaCl, 5% Bovines Serum Albumin, 0.1% Natrium Azid, pH 7.4,
aufgenommen.
-
Der
markierte Antikörper
wurde einerseits, wie nachfolgend genauer beschrieben wird, in einem
Sandwich-Immunoassay verwendet, andererseits jedoch auch in dem
bereits beschriebenen SPALT-Assay.
-
5. Kopplung
-
Zur
Schaffung der Festphase eines Sandwich-Immunoassays wurden bestrahlte
5 ml Polystyrolröhrchen
(Firma Greiner) mit gereinigtem anti-PSR13 Antikörper wie folgt beschichtet:
Der Antikörper
wurde in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,8 zu einer Konzentration
von 6.6 μg/ml
verdünnt.
In jedes Röhrchen
wurden 300 μl
dieser Lösung
pipettiert. Die Röhrchen
wurden 20 Stunden bei 22°C
inkubiert. Die Lösung
wurde abgesaugt. Dann wurde jedes Röhrchen mit 4.2 ml 10 mM Natriumphosphat,
2% Karion FP, 0.3% Bovines Serum Albumin, pH 6.5 befüllt. Nach
20 Stunden wurde die Lösung
abgesaugt.
-
Schließlich wurden
die Röhrchen
in einem Vakuumtrockner getrocknet.
-
Die
beschriebenen Markierungs- und Immobilisierungsprozeduren wurden
außerdem
auf im wesentlichen gleiche Weise mit dem jeweils anderen Antikörper durchgeführt, wobei
ein "inverser" Sandwichassay erhalten
wurde. Bestimmungen, die analog zu den nachfolgend beschriebenen
Bestimmungen unter Verwendung eines solchen "invers" markierten/immobilisierten Immunoassays
durchgeführt
wurden, lieferten im wesentlichen identische Ergebnisse und werden
daher nicht extra beschrieben.
-
6. Durchführung und
Auswertung des Sandwich-Immunoassays
-
Es
wurde ein Assaypuffer folgender Zusammensetzung hergestellt:
100
mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5% Bovines Serum Albumin, 0.1%
unspez. Schaf IgG, 0.1% Natrium Azid, pH 7.4 Als Standardmaterial
diente ein chemisch synthetisiertes mid-proAM (SEQ ID NO:3). Dieses
Peptid wurde seriell in Pferdenormalserum (Firma SIGMA) verdünnt. Den
so hergestellten Standards wurden Konzentrationen gemäß der Einwaage
an Peptid zugeschrieben.
-
Meßproben
waren EDTA-Plasmen von augenscheinlich Gesunden, von Patienten mit
Sepsis und von Patienten mit Herz- und mit Krebserkrankungen.
-
In
die Teströhrchen
wurden 10 μl
Standards bzw. Proben sowie 200 μl
Assaypuffer, enthaltend 1 Million RLU (relative light units) des
MA70-markierten anti-SPCD19 Antikörpers, pipettiert. Es wurde
zwei Stunden bei 22°C
unter Schütteln
inkubiert. Dann wurde 4 × mit
je 1 ml Waschlösung
(0.1% Tween 20) pro Röhrchen
gewaschen, abtropfen gelassen und die am Röhrchen gebundene Chemilumineszenz
in einem Luminometer (Firma BERTHOLD, LB952T; Basisreagenzien BRAHMS
AG) vermessen.
-
Unter
Verwendung der Software MultiCalc (Spline Fit) wurden die midregionalen
Proadrenomedullin-Konzentrationen der Proben an der Standardkurve
abgelesen. Die Ergebnisse sind in 2 graphisch zusammengefaßt.
-
7. Durchführung und
Auswertung des SPALT-Immunoassays
-
Als
festphasengebundener Kompetitor diente in dem beschriebenen SPALT-Assay
das festphasengebundene Peptid SPCD19 (Peptidbereich 69-86; SEQ
ID NO:4), das an die Wände
von Polysorb-Tuben gebunden worden war. Als Antikörper wurde
der wie oben unter 1. bis 4. beschrieben erhaltene markierte anti-SPCD19-Schaf-Antikörper (affinitätsgereinigt)
verwendet. Als Standard dienten Verdünnungen des Peptids SPCD19
in normalem Pferdeserum.
-
Bei
den Bestimmungen wurden jeweils 100 μl Probe (bzw. Standard) und
100 μl Tracer
bei 4°C
in den mit dem SPCD19-Peptid
beschichteten Polysorb-Tubes über
Nacht inkubiert, wonach mit 4 × 1
ml Standardwaschlösung
aus dem LUMItest® der Anmelderin gewaschen
und dann im Luminometer vermessen wurde.
-
Die
Ergebnisse einer mit diesem Assay erhaltenen Meßreihe sind in 1 dargestellt.
-
8. Identifikation
des in den beschriebenen Assays gemessenen Analyten
-
Zur
Anreicherung des Analyten, der von dem in den o.g. Assays verwendeten
Antikörper
erkannt wird, wurden drei individuelle Sepsisplasmen direkt analytisch über eine
C18 Reversed Phase HPLC fraktioniert, wobei mittels eines linearen
Acetonitril-Gradienten eluiert wurde. Es wurden 1 ml-Fraktionen gesammelt
und eingetrocknet. Die Fraktionen wurden in Assaypuffer aufgenommen,
und es wurde die SPCD19-Immunreaktivität der einzelnen
Fraktionen bestimmt. Dazu wurde ein anti-SPCD19-Antikörper (vgl.
oben unter 3.) an den Wänden
eines Polysorb-Tuben immobilisiert, und die Kompetition von Probe
(Fraktion) und lumineszenzmarkiertem SPCD19 um diesen Antikörper wurde
bestimmt.
-
Bei
einer solchen Analyse zeigte sich, dass bei allen Sepsisplasmen
die größte Immunreaktivität in der gleichen
Fraktion (Fraktion 22) zu finden war.
-
Zur
weiteren Identifizierung des gemessenen Analyten wurden 7 Sepsisseren
a ca. 3 ml gepoolt (Endvolumen 22 ml). Unter Verwendung einer Carbolink-Säule mit
einem anti-SPCD19-Antikörper
wurden die gepoolten Seren einer Affinitätsreinigung unterzogen, und
das saure Eluat wurde wie oben über
eine C18 Reversed Phase HPLC fraktioniert. Die Fraktion 22 wurde
getrocknet und massenspektrometrisch untersucht.
-
Bei
einer direkten massenspektrometrischen Analyse wurde als Molmasse
des isolierten Analyten ein Wert von ca. 5146 Dalton ermittelt.
Dieser Wert entspricht der Molmasse eines proAM-Fragments, das die
Aminosäuren
der Positionen 45-92, d.h. des mid-proAM, enthält (der theoretische Wert beträgt, unter
der Annahme, dass die beiden vorhandenen Methionin-Reste oxidert sind,
5146,72 Dalton).
-
Bei
einer MALDI-TOF-Analyse des tryptischen Verdaus der isolierten Fraktion
22 wurden als monoisotopische Massen (M + H+)
u.a. Peptid-Fragmente identifiziert, die den Aminosäuren der
Positionen 79-89, 75-89, 61-74 und 61-78 des preproAM entsprechen.
Die Molmassedaten und die massenspektrometrische Analyse des tryptischen
Abbaus beweisen gemeinsam, dass das in der isolierten Fraktion enthaltene
Peptid das als mid-proAM (45-92) bezeichnete Peptid (SEQ ID NO:3)
ist. Seine Entstehung kann durch eine proteolytische Prozessierung
des ursprünglichen
pre-proAM-Translationsprodukts durch Signalpeptidase, Prohormonconvertase
(Spaltung zwischen basischen Aminosäuren) und Amino- und Carboxypeptidase
(Abspaltung der basischen Aminosäuren)
erklärt
werden (vgl. das analoge Schema für den Procalcitonin-Abbau in
(20)).
-
9. Stabilitätsuntersuchung
-
Zur
Prüfung
der Frage, ob bei einer Messung des mid-proAM mit Problemen aufgrund
einer unzureichenden Stabilität
des mid-proAM in einer Probe bzw. Messlösung gerechnet werden muß, wurden
20 Sepsis-Seren jeweils frisch und nach einer 3 tägigen Lagerung
bei Raumtemperatur vermessen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle zusammengefaßt.
Sie zeigen, dass nach der 3tägigen
Lagerung die Immunreaktivität
nahezu unverändert
war. Diese nachgewiesene Stabilität des mid-proAM ist unter Handhabungsgesichtspunkten
für die
Diagnostik ein großer
Vorteil.
-
-
Zusammenfassend
kann gesagt werden, dass eine Bestimmung von mid-proAM, z.B. unter
Verwendung eines SPCD19-Antikörpers,
gegenüber
einer Bestimmung von z.B. AM zahlreiche Vorteile aufweist: Eine Bestimmung
des mid-proAM unterliegt keinen bekannten Einschränkungen
aufgrund der Existenz eines Bindeproteins, einer Fragmentierung
und einer schwachen Konzentrationsdynamik.
-
Der
Analyt mid-proAM weist ferner eine gute Stabilität auf, d.h. einen sehr geringen
Verlust an Immunreaktivität
bei Lagerung bei Raumtemperatur, was für diagnostische Routine-Bestimmungen einen
großen praktischen
Vorteil darstellt.
-
Es
wird eine extrem günstige
Dynamik beobachtet, und es nicht davon auszugehen, dass diese spezifisch
für Sepsis
ist.
-
Es
ist daher davon auszugehen, dass eine Messung von mid-proAM generell bei
allen Krankheitsbildern, für
die AM-Konzentrationserhöhungen beschrieben
werden, Vorteile aufweisen kann, wobei derzeit insbesondere eine
Bestimmung im Rahmen der Sepsis-, Kardial- und Krebsdiagnostik vorteilhaft
erscheint.
-
Literaturliste
-
- 1. K. Ehlenz et al.: "High levels of circulating adrenomedullin
in severe illness: Correlation with C-reactive protein and evidence
against the adrenal medulla as site of origin", Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes (1997)
105, 156-162
- 2. Tanenao Eto: "A
review of the biological properties and clinical implications of
adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP),
hypotensive and vasodilating peptides", Peptides (2001) 22, 1693-1711
- 3. Joy Patricia Hinson et al.: "Adrenomedullin, a multifunctional regulatory
peptide", Endocr.
Rev. (2000) 21(2), 138-167
- 4. Yukio Hirata et al.: "Increased
circulating adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in sepsis", J. Clin. Endocrinol.
Metab. (1996) Vol. 81, Nr. 4, 1449-1453
- 5. K. Kitamura et al.: "The
intermediate form of glycineextended adrenomedullin is the major
circulating molecular form in human plasma", Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998)
244(2), 551-555
- G. Kazuo Kitamura et al.: "Adrenomedullin
(11-26): a novel endogenous hypertensive peptide isolated from bovine
adrenal medulla",
Peptides (2001) 22, 1713-1718
- 7. M. Kohno et al.: "Plasma
adrenomedullin concentrations in essential hypertension", Hypertension (1996) 27(1),
102-107
- 8. K. Kuwasako et al.: "Purification
and characterization of PAMP-12 (PAMP-20) in porcine adrenal medulla
as a major endogenous biologically active peptide", FEBS Lett (1997)
414(1), 105-110
- 9. K. Kuwasako et al.: "Increased
plasma proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in patients with
essential hypertension",
Ann. Clin. Biochem. (1999) 36 (Pt 5), 622-628
- 10. Lynley K. Lewis et al.: "Adrenomedullin(1-52)
measured in human plasma by radioimmunoassay: plasma concentration,
adsorption, and storage",
Clin. Chem. (1998) 44:3, 571-577
- 11. Rubén
Pìo et
al.: "Complement
factor H is a serum-binding protein for adrenomedullin, and the
resulting complex modulates the bioactivities of both partners", J. Biol. Chem.
(2001) Vol. 276, Nr. 15, 12292-12300
- 12. Kazuhiro Takahashi: "Adrenomedullin:
from a pheochromocytoma to the eyes", Peptides (2001) 22, 1691
- 13. Yoshio Tomoda et al.: "Regulation
of adrenomedullin secretion from cultured cells", Peptides (2001) 22, 1783-1794
- 14. T. Tsuruda et al.: "Secretion
of proadrenomedullin N-terminal
20 peptide from cultured neonatal rat cardiac cells", Life Sci. (2001)
69(2), 239-245
- 15. Shiro Ueda et al.: "Increased
plasma levels of adrenomedullin in patients with systemic inflammatory
response syndrome",
Am. J. Respir. Crit. Care Med. (1999) Vol. 160, 132-136
- 16. Ping Wang: "Adrenomedullin
and cardiovascular responses in sepsis", Peptides (2001) 22, 1835-1840
- 17. H. Washimine et al.: "Plasma
concentration of human adrenomedullin in patients on hemodialysis", Clin. Nephrol.
(1995) 44(6), 389-393
- 18. K. Kitamura et al.: "Adrenomedullin:
A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma"; Biochem.Biophys.Res.Commun.
192:553-560 (1993)
- 19. K. Kitamura et al.: "Cloning
And Characterization of cDNA Encoding a Precursor for Human Adrenomedullin"; Biochem.Biophys.Res.Commun.
194:720-725 (1993)
- 20. Meisner M., (2000) "Procalcitonin", Georg Thieme Verlag,
ISBN 3-13-105473-5, 5.22
-
-