DE10308610A1

DE10308610A1 - Immersionsflüssigkeit für die Mikroskopie bei Wasserimmersion

Info

Publication number: DE10308610A1
Application number: DE10308610A
Authority: DE
Inventors: Hans-Joachim Weippert
Original assignee: Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2023-02-28
Also published as: US7285231B2; DE10308610B4; JP4598412B2; JP2004258662A; US20040220070A1

Abstract

Eine Immersionsflüssigkeit für die Mikroskopie zur Benutzung mit Wasserimmersionsobjektiven weist eine Brechzahl im Bereich von 1,25 bis 1,4 und eine kinematische Viskosität von größer als 20 mm·2·/s bei 20 DEG C auf.

Description

Zur Erhöhung der numerischen Apertur und damit des Auflösungsvermögens von Mikroskopobjektiven bedient man sich der Methode der Immersion. Bei Immersionsobjektiven wird zwischen Präparat und Objektiv eine viskose Flüssigkeit (Immersionsöl) gegeben, die im Brechungsindex und Dispersion an die optischen Eigenschaften der Frontlinse des Objektivs angepasst ist.
Die Eigenschaften von Immersionsölen sind in den Normen DIN 58.884 bzw. ISO 8036/1+2 definiert. Der Brechungsindex bzw. die Brechzahl von Immersionsölen, die dieser Norm entsprechen, liegt bei n_e = 1,5180 ± 0,0004 bei 23°C.
In der DE 197 05 978 A1 und in der DE 197 37 501 A1 werden solche Immersionsöle beschrieben.
Diese Immersionsflüssigkeiten werden zwischen das Mikroskopobjektiv und die zu beobachtende Probe eingebracht, um die Auflösung der Mikroskope zu erhöhen. Die zur Realisierung dieser hohen Brechzahlen eingesetzten chemischen Stoffe, z.B. Chlorparaffine, weisen eine hohe Toxizität auf und sind insbesondere zur Untersuchung lebender biologischer Proben nicht geeignet. Aus diesem Grund wird für die Untersuchung solcher Proben im Allgemeinen Wasser verwendet, welches zwar nur eine Brechzahl von 1,3339 (bei 23°C) hat, aber dafür biologisch verträglich ist und außerdem sehr gute optische Eigenschaften (keine Eigenfluoreszenz, hohe Transmission) aufweist. Um eine optimale Abbildungsqualität zu erreichen, müssen die Mikroskopobjektive genau an die Brechzahl der verwendeten Immersionsflüssigkeit angepasst sein, so dass ein Öl-Objektiv nicht mit Wasserimmersion benutzt werden kann und umgekehrt. Wasser als Immersionsflüssigkeit hat aber den Nachteil, dass vor allem bei Langzeituntersuchungen, wie sie in der modernen Biologie in steigendem Maß angewandt werden, Verdunstung eintritt und damit die Wirkung der Immersionsflüssigkeit aufgehoben wird.
Um dieses Problem zu beseitigen, wird in der DE-OS 101 23 027 eine Vorrichtung, zur automatischen Zuführung von Immersionsflüssigkeit vorgeschlagen. Diese Vorrichtung ist kompliziert im Aufbau und hat außerdem den Nachteil, dass Teile in den Probenraum hineinreichen und damit die Manipulation der Probe behindern.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Immersionsmedium zu schaffen, das Langzeituntersuchungen ermöglicht und optische Eigenschaften von Wasser aufweist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Immersionsflüssigkeit mit einer Brechzahl im Bereich von 1,25 bis 1,4 und mit einer kinematischen Viskosität von größer als 20 mm²/s bei 20°C gelöst.
Eine solche Immersionsflüssigkeit weist eine Brechzahl/Brechungsindex auf, die in der Nähe der Brechzahl von Wasser liegt bzw. dieser entspricht.
Aufgrund einer erhöhten kinematischen Viskosität von größer als 20 mm²/s, im Vergleich dazu liegt die Viskosität von Wasser bei etwa 1 mm²/s, ist ein Medium bereitgestellt, das einen öligen Charakter aufweist, was zu einer Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsfilmes zwischen Mikroskop und Probenträger beiträgt und das nicht die Neigung zum Verdunsten wie Wasser zeigt, so dass dementsprechend Langzeituntersuchungen problemlos durchgeführt werden können.
In dieser Immersionsflüssigkeit werden zum einen die positiven optischen Eigenschaften von Wasser und die positiven Eigenschaften von Ölen im Hinblick auf geringe Verdampfbarkeit vereint, so dass für diesen Anwendungszweck optimierte Immersionsflüssigkeiten geschaffen werden.
In weiteren Ausgestaltungen der Erfindung weist die Immersionsflüssigkeit eine kinematische Viskosität von größer als 50 mm²/s, insbesondere größer als 150 mm²/s auf.
In diesen Bereichen nimmt der ölige Charakter deutlich zu, ohne die positiven optischen Eigenschaften von Wasser völlig zu verlassen.
In einem Bereich einer kinematischen Viskosität von 20 mm²/s bis 1500 mm²/s lassen sich besonders günstige Immersionsflüssigkeiten herstellen. Je nach Anforderungen, beispielsweise an die Dauer der Langzeituntersuchungen bzw. an die Präparationstechnik, wird ein mehr öliger Charakter gewünscht, wobei besonders vorteilhaft der Bereich der kinematischen Viskosität von 200 mm²/s bis 800 mm²/s ist.
Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht in der exakten Anpassung der Brechzahl der Immersionsflüssigkeit an die Brechzahl von Wasser.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bei Mikroskopen, deren Objektive auf das bisher eingesetzte Immersionsmedium Wasser berechnet waren, nunmehr problemlos die erfindungsgemäße Immersionsflüssigkeit eingesetzt werden kann, ohne dass Umrechnungen vorgenommen werden, wobei zugleich die nachteilige Eigenschaft der leichten Verdunstung des Wassers durch die Verwendung schwerflüchtiger Substanzen beseitigt wird.
Besonders vorteilhaft weist die Immersionsflüssigkeit die Brechzahl von Wasser bei erhöhten Temperaturen, insbesondere bei 37°C auf, weil dann Untersuchungen an lebenden Zellen durchgeführt werden können, ohne dass Umrechnungen durchgeführt werden müssen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weist die Immersionsflüssigkeit eine hohe Transmission, insbesondere eine Transmission über 70 % bei einer Schichtdicke von d = 10 mm bzw. über 96 % bei einer Schichtdicke von d = 1 mm bei Wellenlängen von größer als 350 nm auf.
Dieser besonders interessierende Wellenlängenbereich erlaubt eine hohe Transmission, die an das Transmissionsverhalten von Wasser herankommt, insbesondere im Bereich der Wellenlängenbereiche von über 400 nm.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung liegt der Dampfdruck der Immersionsflüssigkeit bei 20°C unter einem Wert von 0,01 kPa. Der Dampfdruck von Wasser bei 20°C beträgt 2,34 kPa.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung beträgt der Dampfdruck bei 20°C weniger als 0,001 kPa.
Immersionsflüssigkeiten mit derartig geringen Dampf druckwerten zeigen keine Neigung zum Verdunsten, und neigen somit nicht zum Austrocknen, wie das bei Wasser der Fall ist.
Immersionsöle mit den vorgenannten Bedingungen können besonders vorteilhaft zumindest einen funktionellen Perfluorpolyether enthalten. Reine Perfluorpolyether sind als Basiskomponenten für Immersionsöle mit wasserähnlichem Brechwert weniger gut geeignet, da sie typischerweise Brechungsindices von n_D = 1,29 bis 1,31 bei 20°C aufweisen. Ebenfalls weniger gut geeignet sind Fluorsiliconöle (n_D = 1,38 bis 1,39 bei 20°C) und Fluorkohlenstoffverbindungen (n_D ≤ 1,29 bei 20°C, hohe Flüchtigkeit). Bei Perfluorpolyethern ist zu unterscheiden in linearkettige, verzweigtkettige und gemischtkettige Verbindungen.
Funktionelle Perfluorpolyether können monofunktional oder auch difunktional sein. Als funktionelle Gruppen sind folgende Gruppen einsetzbar: Alkohol, Polyglycol (mit Ethylenglycol- und/oder Propylenglycol-Strukturen), Alkyl, Alkylalkohol, Alkylolefin, Alkylester, Alkylmethacrylat, Methylester, Acetylester, Alkylamid, Alkylsulfat, Alkylphosphat, Alkylcarboxylat, Isocyanat und Derivate, funktionelle Silane.
Funktionelle Perfluorpolyether werden z.B. von der Firma Solvay Solexis unter dem geschützten Markennamen Fluorolink bzw. von der Firma Du Pont unter dem geschützten Markennamen Zonyl hergestellt und vertrieben.
Perfluorpolyether sind wenig flüchtig, ungiftig, chemisch weitgehend inert und sehr alterungsstabil.
Zum Reinigen der Objektive von der erfindungsgemäßen Immersionsflüssigkeit können gängige Lösungsmittel, wie Aceton oder auch Isopropanol eingesetzt werden, bzw. man verwendet zunächst fluorierte Lösungsmittel zur Vorreinigung und anschließend unpolare Lösungsmittel wie Petrolether, Hexan oder Cyclohexan zum Nachreinigen.
Funktionelle Perfluorpolyether stehen wie oben dargestellt in zahlreichen chemischen Konstitutionen auf dem Markt zur Verfügung und können durch zusätzliche Modifikationen den jeweiligen Gegebenheiten bei der Mikroskopie leicht angepasst werden. Weisen die funktionellen Perfluorpolyether endständige Alkoholgruppen auf, können alkohollösliche Mikroskopie-Farbstoffe angelöst werden. Falls diese Eigenschaft störend ist, beispielsweise bei offener Präparation (ohne Deckgläschen), können die endständigen Hydroxyl-Gruppen abgesättigt werden, bei spielsweise durch Acetylierung, so dass ein völlig farbstoffinertes Verhalten erreicht werden kann, ohne dass sich dabei sonstige optische Eigenschaften signifikant ändern.
Sollten herstellungsbedingt die Fluoreszenz- bzw. die Transmissionswerte der eingesetzten Rohstoffe noch nicht zufriedenstellend sein, so kann durch eine Nachreinigung, beispielsweise mit Aktivkohle, diese Fluoreszenz- bzw. Transmissionswerte verbessert werden, ohne dass sich andere optische Eigenschaften nachteilig verändern. Dies liegt insbesondere an dem im Wesentlichen chemisch inerten Verhalten dieser Perfluorpolyether.
Besonders vorteilhaft werden Perfluorpolyether der allgemeinen Form (I) eingesetzt R₁-CF₂O-(CF₂-CF₂-O)_p- (CF₂O) _q-CF₂-R₂ (I)wobei R₁ und R₂ jeweils für Folgendes stehen

– R₃O-CH₂- mit R₃ = H, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen
– R₄-COO- mit R₄ = Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen
– R₅-O-CH₂CH(OH)-CH₂-O-CH₂- mit R₅ = H, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder R₄-CO-,
– R₃-O- (CH₂CH₂O )_n-CH₂- mit n im Bereich von 1 bis 3 ,
– und p und q jeweils im Bereich von 3 bis 12 liegen.

Diese Substanzgruppe erlaubt das Herstellen von Immersionsflüssigkeiten in einer großen Bandbreite, die den zuvor genannten Parametern entsprechen. Durch Mischen von einzelnen Substanzen können jeweils die gewünschten Eigenschaften gezielt beeinflusst oder ganz bestimmte Vorgaben erfüllt werden, wobei das im Rahmen des technischen Handelns und Versuchens des Fachmanns liegt.
So können insbesondere gezielt Immersionsflüssigkeiten hergestellt werden, die exakt den Brechungsindex von Wasser (n_e (546,1 nm) = 1,3339 bei 23°C) aufweisen.
Je nach Anwendungstemperatur, beispielsweise für die Beobachtung lebender Zellen bei 37°C können höherviskose funktionelle Perfluorpolyether hinzugemischt werden, um die Viskosität für die Arbeitstemperatur zu erhöhen.
Die Auswahl von Perfluorpolyethern betrifft nur eine Substanzgruppe. Es liegt im Rahmen des fachmännischen Versuchens unter den erfindungsgemäß vorgegebenen Randbedingungen, andere Substanzgruppen oder zusätzliche Substanzen in Vermischung mit den Perfluorpolyethern einzusetzen, um dasselbe Ziel zu erreichen.
Außerdem können Substanzen den Immersionsflüssigkeiten zugefügt werden, die den Brechungsindex und/oder die Viskosität wenig beeinflussen, aber aus sonstigen Gründen wünschenswert sind. Bilden Perfluorpolyether die Basis, so sind diese als dominierender Bestandteil vorhanden, beispielsweise 90°C oder mehr.
Daher betrifft die Erfindung nicht nur die vorstehend genannten und die nachstehend genannten Substanzen oder die genannten Kombinationen, sondern auch andere im Rahmen der Erfindung liegende Kombinationen.
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand einiger ausgewählter Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Ausgewählte Perfluorpolyether
Tabelle 1
HOCH₂-CF₂O-(CF₂CF₂O )_p- (CF₂O) _q-CF₂-CH₂OH (1)
Diese Perfluorpolyether sind unter den markenrechtlich geschützten Bezeichnungen Fluorolink D und Fluorolink D10 von der Firma Solvay Solexis erhältlich.
Tabelle 2
HO (CH₂CH₂O )_n-CH₂CF₂O-( CF₂CF₂O) _p-(CF₂O)_q-CF₂-CH₂(OCH₂CH₂)_n OH (2)
Derartige Perfluorpolyether sind unter den markenrechtlich geschützten Bezeichnungen Fluorolink E und Fluorolink E10 von der Firma Solvay Solexis erhältlich.
Tabelle 3
CH₃COO-CF₂O-(CF₂CF₂O)_p-(CF₂O)_q-CF₂-COOCH₃ (3)
Derartige Perfluorpolyether sind unter den markenrechtlich geschützten Bezeichnungen Fluorolink L und Fluorolink L10 von der Firma Solvay Solexis erhältlich.
Tabelle 4
HOCH₂CH(OH)CH₂OCH₂-CF₂O-(CF₂CF₂O)_p-(CF₂O)_q-CF₂-CH₂OCH₂CH(OH)CH₂OH (4)
sDerartige Perfluorpolyether sind unter den markenrechtlich geschützten Bezeichnungen Fluorolink T und Fluorolink T10 von der Firma Solvay Solexis erhältlich.
Durch Mischen der vorgenannten Polyfluorpolyether ist es möglich, eine Immersionsflüssigkeit herzustellen, die beispielsweise den exakten Brechungsindex von Wasser, nämlich von 1,3339 bei 23°C und eine kinematische Viskosität bei 20°C von ca. 300 – 600 mm²/s aufweist.
Aus den vorgenannten Perfluorpolyethern wurden entsprechend der nachfolgenden Tabelle 5 die Versuchsmuster V1 bis V3 gemischt.
Tabelle 5 Mischungsverhältnisse
In der nachfolgenden Tabelle 6 sind die Eigenschaften der drei Immersionsflüssigkeiten unter der Bezeichnung Immersol W gegenüber den entsprechenden Eigenschaften von Wasser dargestellt. Tabelle 6
Immersol ist ein geschützter Markenname für Immersionsflüssigkeiten von Carl Zeiss (Marke Nr. 4323 847).
Aus der vorgenannten Tabelle ist ersichtlich, dass durch die Mischung der vorgenannten funktionellen Perfluorpolyether eine Immersionsflüssigkeit hergestellt werden kann, die Brechungsindices aufweist, die nahezu identisch zu dem von Wasser sind, so dass beispielsweise diese Immersionsflüssigkeit für solche Mikroskopobjektive eingesetzt werden kann, die auf das Medium Wasser berechnet sind. Es ist auch deutlich zu erkennen, dass entsprechend der erfindungsgemäßen Lehre die positiven optischen Eigenschaften von Wasser, insbesondere bezüglich des Brechungsindex und der hohen Transmission und der geringen Restfluoreszenz erzielt werden können, dass aber zugleich wesentlich höhere Viskositätswerte, also ein mehr öliger Charakter, sowie ein minimaler Dampfdruck erzielt werden kann. Mit diesem Eigenschaftsmerkmal wird der wesentliche Nachteil von Wasser als Immersionsmedium, seine leichte Verdunstbarkeit, beseitigt.

Claims

Immersionsflüssigkeit für die Mikroskopie bei Wasserimmersion mit einer Brechzahl im Bereich von 1,25 bis 1,4 und mit einer kinematischen Viskosität von größer als 20 mm²/s bei 20°C.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 1, mit einer kinematischen Viskosität von größer als 50 mm²/s, insbesondere größer als 150 mm²/s.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 1, mit einer kinematischen Viskosität im Bereich von 20 mm²/s bis 1500 mm²/s.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 3, mit einer kinematischen Viskosität im Bereich von 200 mm²/s bis 800 mm²/s.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Brechzahl von Wasser aufweist.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Brechzahl von Wasser bei erhöhten Temperaturen, insbesondere die Brechzahl von Wasser bei 37°C aufweist.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 6, mit einer hohen Transmission, insbesondere mit einem Transmissionswert von über 70 % bei einer Schichtdicke von d = 10 mm bzw. über 96 % bei einer Schichtdicke von d = 1 mm bei Wellenlängen von größer als 350 nm.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, mit einem Dampfdruck bei 20°C von kleiner als 0,01 kPa.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 8, mit einem Dampfdruck bei 20°C von kleiner als 0,001 kPa.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 9, enthaltend einen oder mehrere funktionelle Perfluorpolyether.
Immersionsöl nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an funktionellen Perfluorpolyethern zumindest 90 Gew.-% des Immersionsöles beträgt.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Perfluorpolyether funktionelle Gruppen aufweisen, ausgewählt aus der Reihe bestehend aus Alkohol, Polyglycol, insbesondere mit Ethylenglycol- und/oder Propylenglycol-Strukturen, Alkyl, Alkylalkohol, Alkylolefin, Alkylester, Alkylmethacrylat, Methylester, Acetylester, Alkylamid, Alkylsulfat, Alkylphosphat, Alkylcarboxylat, Isocyanat und Derivate davon, funktionelle Silane.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 12, dass funktionelle Perfluorpolyether der allgemeinen Form (I) ausgewählt sind, nämlich R₁-CF₂O-(CF₂-CF₂-O)_p-(CF₂O)_q-CF₂-R₂ (I)wobei R₁ und R₂ jeweils für Folgendes stehen – R₃O-CH₂- mit R₃ = H, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen – R₄-COO- mit R₄ = Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen – R₅-O-CH₂CH(OH)-CH₂-O-CH₂- mit R₅ = H, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder R₄-CO-, – R₃-O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂- mit n im Bereich von 1 bis 3 , – und p und q jeweils im Bereich von 3 bis 12 liegen.