DE10297369T5

DE10297369T5 - Anwendung von Oligosacchariden in kosmetischen oder dermatologischen Zusammensetzungen zum Stimulieren der Haftung von Keratinozyten an den Hauptproteinen der Lederhaut-Epidermis-Verbindung und zum Wiederherstellen der Epidermiskohäsion

Info

Publication number: DE10297369T5
Application number: DE10297369T
Authority: DE
Inventors: Christian Lubrano; Laurence Flavet; Gaëlle Aintigny; Jean-Renaud Robin
Original assignee: Laboratoires de Biologie Vegetale Yves Rocher SA
Current assignee: Laboratoires de Biologie Vegetale Yves Rocher SA
Priority date: 2001-11-08
Filing date: 2002-11-08
Publication date: 2004-10-28
Also published as: FR2831819A1; US20070293433A1; WO2003039509A1; FR2831819B1; US20040224892A1

Abstract

Anwendung von Oligogalakturonid in der Kosmetik oder zur Herstellung einer dermatologischen Zusammensetzung als Mittel zur Stimulierung der Haftung von basalen Keratinozyten an zwei Hauptproteinen der JDE, welche das Laminin V und das Kollagen IV sind, zum Lindern von Unregelmäßigkeiten der Kommunikation zwischen der Lederhaut und der Epidermis und der Verringerung der interkeratinozytären Kohäsion im Bereich der Epidermis, welche im Verlauf der Hautalterung auftreten.

Description

Die Erfindung hat zum Ziel neue kosmetische Zusammensetzungen zur Hautpflege zum Zweck der Anti-Alterung. Besonders betrifft die Erfindung die kosmetische Anwendung eines Gemisches von Oligosacchariden vom Typ Oligogalakturoniden, die durch enzymatische Hydrolyse eines Pektins erhalten werden, im Hinblick auf die Stimulierung der Haftung von Keratinozyten an Proteinen der Lederhaut-Epidermis-Verbindung (Laminin V und Kollagen IV). Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ermöglichen die Linderung der Störungen der Kommunikation zwischen der Lederhaut und der Epidermis und der Verringerung des interkeratinozytären Zusammenhalts im Bereich der Epidermis, welche im Verlauf der Hautalterung auftreten, und so die Epidermiskohäsion wiederherzustellen.
Die Basalmembran der Haut oder die Lederhaut-Epidermis-Verbindung (JDE = jonction dermo-épidermique) entspricht der Zone, die anatomisch zwischen den Basalzellen der Epidermis und den oberflächlichsten Schichten der Lederhaut liegt. Das ist eine Zone der Haftung zwischen der Epidermis und der Lederhaut, welche für die Steuerung der Filtration von kleinen Molekülen und dem Halten der benachbarten Zellen sorgt (Damour O., M. C. Martini und P. Rouselle, Okt. 1998, Le vieillissement cutané, Ed. Flash Media).
Die JDE weist spezifische Bindungskomplexe auf, die Hemidesmosome, deren Funktion die Gewährleistung der Bindung zwischen den basalen Keratinozyten der Epidermis und der darunterliegenden Basalmembran ist (Kelly, 1966, J. Cell. Biol., 28: 51–73).
Die JDE spielt eine sehr wichtige Rolle, sowohl auf der mechanischen Ebene, da sie die feste Verankerung der Epidermis ermöglicht, wie auf der biologischen Ebene, da sie in die Übermittlung zellulärer Signale durch Rezeptoren der Familie der Integrine eingreift.
Die Integrine sind Transmembran-Glykoproteine, die sich am Basisteil des Keratinozyten in Kontakt mit der JDE befinden. Sie besitzen einen extrazellulären Teil, der eine Erkennung mit den charakteristischen Proteinen der JDE ermöglicht. Unter den Bestandteilen der JDE seien zwei Proteine genannt, die eine fundamentale Rolle im Bereich der JDE spielen:

– das Laminin V, welches ein die Hemidesmosomen bildendes Protein ist, und
– das Kollagen IV.

Diese Proteine ermöglichen mittels Membranrezeptoren (den Integrinen α6β4 α3β1 für das Laminin V und dem Integrin α2β1 für das Kollagen IV):

– die Haftung von basalen Keratinozyten am Träger in einer wohldefinierten Ausrichtung,
– die Signalübertragung von der Lederhaut zur Epidermis, wie von Signalen der Proliferation, Differenzierung der Keratinozyten.

Diese Integrine sind daher echte Zonen des Dialogs zwischen dem Inneren und Äußeren der Zelle und, indem sie die zellulare Haftung begünstigen, tragen sie noch über die Basalschicht hinaus zu einer besseren Kommunikation zwischen den Hauptabteilungen der Haut, der Lederhaut und der Epidermis bei.
Neuerdings wurde gezeigt, daß die Haftung von basalen Keratinozyten an Hauptproteinen der JDE, wie dem Laminin V, dem Kollagen IV oder dem Fibronectin anscheinend die Expression der Verbindungen (Grenzspalt = jonctions gap), zwischen den Keratinozyten der Epidermis steuert (Lampe et al., J. Cell. Biol., 1998, 1735–1747). So soll eine Verstärkung der Wechselwirkungen zwischen besonders dem Laminin V und den basalen Keratinozyten über Integrine wie α6β4 α3β1 die Emission von "Signalen" im Bereich der Epidermis hervorrufen, um die Bildung von interzellularen Verbindungen zu begünstigen und eine bessere Kommunikation zwischen den Keratinozyten der Epidermis zu ermöglichen.
Im Verlauf der Hautalterung beobachtet man eine Abflachung und ein Dünnerwerden der (JDE). Die Haftungseigenschaften der Epidermis werden herabgesetzt wegen einer Verringerung der Expression der Integrine, die spezifisch eine Rolle bei der Haftung der basalen Keratinozyten spielen (Levarlet et al., 1998, J. Invest. Dermatol., 3: 172–9). Alle diese Modifikationen führen zu einer Verringerung der Kommunikation zwischen den verschiedenen Abteilungen, was wahrscheinlich zu einer Lederhaut-Epidermis-Desorganisation beiträgt.
Obgleich noch nicht alle Mechanismen aufgeklärt wurden, läßt alles daran denken, daß eine Verstärkung der Haftung der Zellen besonders an der JDE die Wiederherstellung einer besseren Lederhaut-Epidermis-Kommunikation sowie einer besseren Epidermiskohäsi on ermöglichen würde, was zur Wiederherstellung einer besseren Koordination der Hautfunktionen führen würde. Tatsächlich können Unregelmäßigkeiten in der Lederhaut-Epidermis-Kommunikation einerseits und auf dem Niveau der Kohäsion zwischen den Keratinozyten der Epidermis andererseits zu Schwierigkeiten in der Koordination der zellulären Funktion wie Proliferation und/oder Epidermis-Differenzierung führen.
Ziel der Erfindung ist es genau, Mittel zu schaffen, welche es ermöglichen, spezifisch die Haftung von basalen Keratinozyten an den zwei Hauptproteinen der JDE, welche das Laminin V und das Kollagen IV sind, zu erhöhen, um die Unregelmäßigkeiten der Kommunikation zwischen der Lederhaut und Epidermis und die Verringerung der inter-keratinozytären Kohäsion zu lindern, die im Verlauf der Hautalterung auftreten.
Dieses Ziel wird erreicht durch kosmetische oder dermatologische Zusammensetzungen für die Hautpflegen und besonders nützlich zur Bekämpfung der Alterung der Haut, die als wirksames Mittel Oligogalakturonide enthalten.
Die Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung begünstigt die Haftung der Zellen an den zwei Proteinen der JDE wegen einer besseren Verfügbarkeit von Rezeptoren α6β4 für das Laminin V und α2β1 für das Kollagen IV. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wäre in der Lage, eine Aktivierung dieser Rezeptoren zu induzieren dank einer Veränderung der Konformation.
Die Oligogalakturonide der erfindungsgemäßen Zusammensetzung weisen vorzugsweise einen Polymerisationsgrad zwischen 1 und 5 auf.
Die Oligogalakturonide der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind kaum methyliert oder verestert.
Die erfindungsgemäßen kosmetischen Zusammensetzungen enthalten als Trockenäquivalent in Bezug auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung von 0,01 bis 5 % und vorzugsweise 0,5 % der Oligogalakturonide.
Die erfindungsgemäßen kosmetischen Zusammensetzungen können außer den Oligogalakturoniden andere aktive Substanzen enthalten, und besonders Pflanzenextrakte. Als Beispiele solcher Extrakte seien genannt:

– ein Extrakt von Yams-Wurzel (dioscorea) mit einem garantierten Gehalt an Diosgenin oder reinem Diosgenin. Es kann sich um einen Extrakt handeln, der 15 % Diosgenin enthält, oder eine Lösung von reinem Diosgenin.
– Betacarotin rein oder verdünnt in Form einer Suspension in Öl, besonders in einer Verdünnung auf 30 %.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch noch eine oder mehrere Formulierungshilfsmittel oder Zusätze von üblicher und klassischer Anwendung in den kosmetischen und dermatologischen Zusammensetzungen aufweisen, wie beispielsweise und ohne Begrenzung darauf Weichmacher, Farbstoffe, filmbildende Mittel, Tenside, Parfums, Konservierungsmittel, Emulgatoren, Öle, Glykole, Sebumabsorptionsmittel, Vitamine usw. Aufgrund seiner Kenntnisse auf dem Gebiet der Kosmetik weiß der Fachmann, welche Formulierungshilfsmittel und in welchen Mengen in Abhängigkeit von den gewünschten Eigenschaften er sie den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zusetzt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in jeder dem Fachmann auf dem Gebiet der Kosmetologie und Dermatologie bekannten Form vorliegen ohne andere galenische Einschränkung als die Anwendung auf der Haut des Gesichts oder Körpers. In vorteilhafter Weise liegen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Form eines Gels, einer Creme, einer Emulsion, einer Milch, eines Sprays usw. vor.
In vorteilhafter Weise werden die Oligogalakturonide der erfindungsgemäßen Zusammensetzung durch enzymatische Hydrolyse eines Pektins erhalten.
Das Pektin besteht aus einer Hauptkette, genannt Pektinsäure mit einer Verknüpfung von Zuckern vom Typ Galakturonsäure. Die konstituierenden Zucker können methyliert oder verestert sein, und der Anteil von transformierten Zuckern ist charakteristisch für eine Pflanzenart. Die Hauptkette ist gelegentlich durch Einsatz einer neutralen Seitenkette von Zuckern vom Typ Rhamnose oder Glucose unterbrochen.
Die Oligogalakturonide, die früher als Oligosaccharine bezeichnet wurden, wurden als regelrechte pflanzliche Hormone beschrieben (Darvill et al., Glycobiology, vol 2, Nr. 3, pp 181–198, 1992). Sie können hergestellt werden durch Hydrolyse des Pektins, und die Größe oder der Polymerisationsgrad der Oligogalakturonide hängt von den Reaktionsbedingungen der Hydrolyse ab.
Die Anmelderin hat jetzt ein Verfahren zur Herstellung von Oligogalakturoniden verwirklicht, das es ermöglicht, ein als kosmetisches Mittel wirksames industrielles Produkt zu erhalten.
Zahlreiche Pektine sind im Handel in großer Menge und veränderlicher Qualität verfügbar. Oft handelt es sich um standardisierte Pektine, die häufig Zuckern zugesetzt werden, um eine Homogenisierung der Viskositäten zwischen den Chargen zu erreichen. Tatsächlich hängt die erste Anwendung dieser Pektine mit ihren gelierenden Eigenschaften und als Viskositätsmittel zusammen.
Vorzugsweise werden die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingesetzten Oligogalakturonide durch Hydrolyse von Pektin hergestellt, das einen geringen Grad an Methylierung und Veresterung aufweist, um sich der Polygalakturonsäure so weit wie möglich anzunähern.
Als Beispiel eines solchen Pektins seien genannt die Pektine vom Typ HERBSTREITH und FOX Classic AAU 910, die aus Äpfeln gewonnen werden (Pektin Typ HB AU).
Die zur Hydrolyse von Pektin verwendeten Enzyme sind von dem industriellen Typ, der häufig in der Industrie der Fruchtsaftherstellung verwendet wird. Es handelt sich um Enzymcocktails, die entwickelt wurden, um die Membranpektine zu zerschneiden und so eine bessere Extraktion der Fruchtsäfte durch Brüchigmachen der Strukturen vor dem Pressen zu erreichen. Sie ermöglichen auch die Klärung der Fruchtsäfte, in denen eine Trübung, die oft mit den Pektinen zusammenhängt, nicht erwünscht ist. Als Beispiel eines solchen Enzyms sei besonders genannt das von der Firma LYVEN vertriebene "Clarification granulé". Der Enzymcocktail umfaßt Pektinasen mit hauptsächlich Aktivitäten von Polygalakturonase, Methylesterase und Polygalakturonaselyase.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Oligogalakturoniden nach der Erfindung weist die folgenden Schritte auf:

– Hydrolyse einer Pektinlösung mit einer Konzentration von 0,1 bis 10 % und vorzugsweise 1 % bei einem pH in der Größenordnung von 4,5 durch Zugabe einer Enzymlösung, die 10 bis 1000 und vorzugsweise 100 Einheiten Polygalakturonase enthält, zu der genannten Pektinlösung, um in der Endlösung 1 bis 10 und vorzugsweise 4 Einheiten Pektinase zu erhalten;
– Abbruch der Hydrolyse;
– Abtrennung von Polymeren mit hohem Molekulargewicht und Gewinnung der Oligogalakturonide.

Vorteilhafterweise wird die Hydrolyse bei 50°C während 2 Stunden durchgeführt und dann durch Erhitzen auf 70°C während 1 Stunde oder 100°C während 5 Minuten abgebrochen.
Nach dem Abkühlen werden die Polymeren mit hohem Molekulargewicht durch Zugabe von HCl 1N gefällt und dann durch Zentrifugieren beispielsweise mit 5000 g während 30 Minuten oder durch Filtrieren entfernt.
Der pH des Überstands wird am Ende auf einen Wert zwischen 6 und 8, beispielsweise in der Größenordnung von 6,9 eingestellt.
Die Erfindung bezweckt auch die Anwendung von Oligogalakturoniden wie oben definiert in der Kosmetik oder zur Herstellung einer pharmazeutischen, besonders dermatologischen Zusammensetzung als Mittel zur Stimulierung der Haftung von basalen Keratinozyten an den zwei Hauptproteinen der JDE, welche das Laminin V und das Kollagen IV sind, und dazu dient, die Deregulierungen der Kommunikation zwischen der Lederhaut und der Epidermis und die Verringerung der interkeratinozytären Kohäsion im Bereich der Epidermis zu lindern, welche im Verlauf der Hautalterung auftreten.
Die Erfindung betrifft auch eine kosmetische Methode zur Linderung der Störungen der Steuerung der Kommunikation zwischen der Lederhaut und der Epidermis und der Verringerung der interkeratinozytären Kohäsion im Bereich der Epidermis, die im Verlauf der Hautalterung auftreten, um so die Epidermiskohäsion wiederherzustellen, welche darin besteht, auf die Haut eine wirksame Menge Oligogalakturonid oder eine solche wie oben definiert enthaltende Zusammensetzung aufzutragen.
Die Erfindung wird mit weiteren Vorteilen und Eigenschaften erläutert durch die folgenden Beispiele, welche die Herstellung von Oligogalakturoniden und ihre Anwendung als kosmetisches Mittel betreffen.
I Herstellung der Oligogalakturonide
1) Verfahrensweise

Pektin: 0,1 bis 10 % Pektin werden gelöst (1 % Pektin HB AU910)
Der pH wird auf 4,5 eingestellt, vorzugsweise mit einer Essigsäurelösung.
Enzym: Eine Lösung entsprechend 10 bis 1000, vorzugsweise 100 Einheiten Polygalakturonase wird hergestellt.

Die Enzymlösung wird der Pektinlösung zugesetzt, um einen Endgehalt von 1 bis 10, vorzugsweise 4 Einheiten Pektinase zu erhalten.
Die Hydrolyse wird bei 50°C während 2 Stunden durchgeführt und dann durch Erhitzen auf 70°C während 1 Stunde oder 100°C während 5 Minuten abgebrochen.
Nach dem Abkühlen werden die Polymeren mit hohem Molekulargewicht durch Zugabe von HCl 1N gefällt und dann durch Zentrifugieren beispielsweise mit 5000 g während 30 Minuten oder durch Filtrieren entfernt.
Der pH des Überstandes wird am Ende auf einen Wert zwischen 6 und 8, beispielsweise in der Größenordnung von 6,9, wieder eingestellt.
Die gebildeten Oligogalakturonide werden schließlich vorzugsweise feinst zerkleinert (atomisiert) oder lyophylisiert, um eine bessere Konservierung und leichtere Handhabungen zu ermöglichen.
2) Analyse der gebildeten Oligogalakturonide durch HPLC
Eine Analysenmethode, welche es ermöglicht, das chromatographische Profil der gebildeten Oligogalakturonide zu erhalten, wurde ausgearbeitet.
Säule: TSK-Gel DEAE 5-PW (TOSOHAAS)
Eluant: CH₃COONH₄ 1M/H₂O im Elutionsgradienten
Durchsatz mobile Phase: 1 ml/min
Verdunstungsdetektor mit Lichtstreuung (DEDL; ALTECH).
Ofentemperatur: 130°C.
Stickstoffdurchsatz: 4,0 OSLPM (Standard Liter pro Minute): Standardbedingungen für H₂O als Lösungsmittel.
Die Wahl des Gradienten ist in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
Man beobachtet eine Verteilung der Oligomeren der Größe (dp: Polimerisationsgrad) von 1 bis 5.
Das Fehlen von Standard ermöglicht keine Dosierung der Oligomeren mit dp 4 und 5, jedoch kann man die kürzesten Oligomeren dosieren.
Wenn man nach den oben beschriebenen Bedingungen eine Pektinlösung mit einer Konzentration von 10 g/1 hydrolysiert, beträgt die Gesamtkonzentration an Mono-, Di- und Tri-galakturonsäure am Ende etwa 4,5 g/1 und somit etwa 45 Gew.-% des in Lösung gebrachten Pektins.
II Wirkungen der Oligogalakturonide auf die Adhäsion von humanen Keratinozyten an Laminin V und Kollagen IV
1) Materialien und Methoden
a) Kultur der Keratinozyten in definiertem Milieu
Das verwendete Kulturmilieu war das definierte Kulturmilieu für Keratinozyten 154 (+ Zusatz HKGS), Hersteller Cascade Inc. (USA) und vertrieben von Tebu (Frankreich), enthaltend 0,2 mM CaCl₂, pH 7,2 bis 7,4.
Die Keratinozyten wurden nach der von Boyce und Ham beschriebenen Methode erhalten (Boyce ST, Ham RG, J invest. Dermatol., 1983, 81, 33s-40s). Hautstücke von menschlicher Vorhaut (Beschneidung) wurden behandelt, um daraus die humanen basalen Keratinozyten zu isolieren. 3 × 10⁴ lebende Zellen wurden anschließend pro cm² gesät auf Gewebekulturgefäße von 25 cm² (Corning, Polylabo, Frankreich).
Die Keratinozyten wurden bei 37°C in einem CO₂ Inkubator (5 % CO₂, 95 % Luft und 98 % Feuchtigkeit) inkubiert. Das Milieu wurde alle 2 Tage gewechselt. Die Subkultur findet statt, wenn die Zellen die Subkonfluenz erreichen. Der Zellteppich wird dann mit PBS gespült, dann werden die Zellen unter Anwendung der klassischen Trypsinisierungstechnik (Trypsin-EDTA 0,05 bis 0,2 %) bei 37°C trypsinisiert. Die Zellen werden dann in Kulturgefäße von 75 cm² ausgesät.
Das Einfrieren der Zellen, 3 bis 5 Millionen pro Ampulle wird im verwendeten Kul-turmilieu in Gegenwart von 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) und 20 % Kalbsserum bei einem Volumen von 1 ml durchgeführt.
b) Quantitative Analyse der zellularen Haftung durch einen kolorimetrischen Test
Herstellung von Haftungssubstraten
Um die ideale Konzentration der später verwendeten Haftungsproteine festzustellen, wurde ein Dosis-Response für jedes der Substrate der zu bewirkenden Haftung vorgenommen.
Das Kollagen IV (Becton Dickinson, Frankreich), das Fibronektin (Becton Dickinson, Frankreich) und das im Laboratorium gereinigte Laminin V (Pousselle P. et al. J. cell. biol., 1991 114 (3); 567–576) wurden im Verlauf unserer Untersuchungen verwendet. Ein Bereich von 7 abnehmenden Konzentrationen wurde durch aufeinanderfolgende Verdünnung in destilliertem Wasser ausgehend von einer Ausgangslösung mit 10 μg/ml hergestellt. Diese Lösungen wurden sofort auf Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Dutscher, Brumath, Frankreich) in einer Menge von 100 μg pro Vertiefung verteilt. Die Platten wurden anschließend bei +4°C während 16 bis 18 Stunden gehalten. Die Lösungen wurden dann durch Umdrehen der Platten entfernt und jede Vertiefung wurde gesättigt mit einer wäßrigen Lösung von SAB 1 % (3 zusätzliche Vertiefungen ohne Substrat erhielten die gleiche Behandlung und dienten als Kontrolle).
Test der zellularen Haftung
Die Zellen werden wie oben beschreiben trypsinisiert, dann im Milieu 154 ohne Zusätze suspendiert (3 x 10⁵ Zellen/ml) und dann in Passage 2 in Mehrlochplatten mit 100 μl/Vertiefung ausgesät.
Bewertung des Tests der zellularen Haftung
Nach Aussäen der Zellen wurden die Mehrlochplatten in einem Inkubator bei 37°C während 45 Minuten in Gegenwart oder Abwesenheit des Gemisches von Oligalakturoniden mit verschiedenen, im Kulturmedium nicht zytotoxischen Konzentrationen gehalten. Eine positive Kontrolle wird parallel durchgeführt (Manganchlorid (0,5 mM)), um den Versuch zu bestätigen. Nach der Inkubation werden die Zellen mit dem Phasenkontrastmikroskop beobachtet, um zu verifizieren, daß der Test korrekt abgelaufen ist.
Die charakteristische Ausbreitung der Keratinozyten auf dem Laminin V (Rousselle P. and Aumilley M., J cell biol., 1994 125 (1) 205–214) wurde berücksichtigt. Nach dem Spülen wurden die restlichen am Substrat haftenden Zellen mit Hilfe einer Lösung von 1 % Glutaraldehyd in PBS während 15 Minuten fixiert. Nach der Entfernung des Fixationsmittels wurden die Zellen mit einer auf 1 % verdünnten Lösung von Kristallviolett in destilliertem Wasser während 30 Minuten gefärbt. Nach kräftigen Spülungen mit Wasser wurden die Zellen mittels einer 0,02 %-igen Tritonlösung während 15 Minuten permeabilisiert, um das Kristallviolett in Lösung zu bringen.
Die Ablesung der Absorption wurde bei 570 nm mittels eines ELISA-Plattenlesers durchgeführt. Jeder experimentelle Punkt wurde an 3 Exemplaren realisiert. Der Kontrollwert stellt den Mittelwert der Absorption der 3 Kontrollvertiefungen dar (BSA). Dieser wird von jedem der Werte der optischen Dichte abgezogen, die für die experimentellen Punkte erhalten wurde. Anschließend wurden die Mittelwerte der 3 Absorptionswerte für jeden der 3 Triplikate berechnet.
2) Ergebnisse
a) Untersuchung der Haftung von normalen humanen Keratinozyten an Laminin V
Manganchlorid (0,5 mM) wurde als positive Kontrolle für die Haftung der Zellen am Substrat verwendet.
Das Ergebnis der Haftung, das mit den Zellen ohne Aktivierungsmittel und ohne positive Kontrolle erhalten wurde, wird willkürlich auf 100 % festgelegt.
Die hier identifizierte aktive Substanz besteht aus der Lösung von Referenz-Oligosacchariden vom Typ oligo G04 (nicht lyophylisiert).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2
Die Mischung induzierte bei der Konzentration 1 % eine Erhöhung auf 116 % am Laminin V.
b) Untersuchung der Haftung von normalen humanen Keratinozyten am Kollagen IV
Manganchlorid (0,5 mM) wurde als positive Kontrolle für die Haftung der Zellen am Substrat verwendet.
Die Ergebnisse der mit den Zellen ohne Aktivsubstanz und ohne Positivkontrolle erhaltenen Haftung sind willkürlich auf 100 % festgelegt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
Das Gemisch induzierte bei der Konzentration 1 % eine Erhöhung auf 126 % am Kol-lagen IV.
c) Untersuchung der Morphologie von normalen humanen Keratinozyten nach Haftung am Laminim V oder Kollagen IV
Die Sichtbarmachung der Ausbreitung und der Form der anhaftenden Zellen erfolgte durch das Aufzeigen des Zytoskeletts von Aktin, indem eine Immunomarkierung mit Phalloidin gekoppelt an FITC durchgeführt wurde.

– Haftung am Laminin V.

Die Betrachtung der 1A und 1B zeigt, daß in Gegenwart des mit 0,01 % verwendeten Aktivs (1B) die Anzahl der Zellen, die am Laminin V hafteten, größer war als bei der Kontrolle (1A). Diese sind weiter ausgebreitet und das Netz von Aktin, das für das zellulare Zytoskelett repräsentativ ist, ist viel besser organisiert. Diese morphologischen Veränderungen, die auf der Gegenwart des Aktivs (im Vergleich mit der Kontrolle) beruhen, zei gen, daß dieses wahrscheinlich die Ausbildung und Aktivierung des Integrins α6β4 begünstigt.

– Haftung am Kollagen IV

In Abwesenheit (2A) oder in Gegenwart des Aktivs (2B) haften die Zellen am Kollagen IV. Jedoch kann man in Gegenwart des Aktivs (2B) bemerken, daß die Zellen größer, von mehr abgerundeter Form mit einer sehr guten kortikalen Organisation des Aktins sind. In diesem Fall sind die Zellen miteinander verbunden, gegeneinander angedrückt, was anzeigt, daß das Aktiv die Zell-Zell-Kontakte und die intrazellulare Kohäsion stimuliert.
Als Folgerung scheint die Erhöhung der Haftung der Zellen an das LamininV in Gegenwart des Aktivs über eine Erhöhung der Expression von α6β4 zu verlaufen. Die Morphologie und die Ausbreitung der Zellen über das Kollagen IV in Gegenwart des Aktivs zeig, daß es sich um eine Ausbildung von Integrinen α2β1 (spezifisch für das Kollagen IV) handelt und daß im übrigen eine bessere Kohäsion zwischen den Keratinozyten vorhanden ist.
III Einsatz in einer kosmetischen Formulierung

Im Trockenäquivalent können die Oligogalakturonide mit einer Dosis von 0,01 bis 5 %, vorzugsweise mit einer Dosis von 0,5 % eingearbeitet werden. 1) Beispiel einer Zusammensetzung in Form von Emulsion

Wasser	QSP
Oligogalakturonide dp 1 bis 5 (Trockensubstanz)	0,01 bis 5 %
Gemisch von Konservierungsmitteln	1,5 %
Propylenglykol	5, %
Xanthangummi	0,30 %
Acryl/Acrylat-Kopolymer	0,50 %
Stearinsäure 100 OE**	3,00 %
Sorbitanstearat	2,00 %
Sorbitanlaurat 20 OE	3,00 %
Cetylstearinalkohol	1,50 %
Bienenwachs	1,00 %
Weizenkeimöl	5,00 %

Dimethicon	2,00 %
Cyclomethicon	5,00 %
Polyacrylamidgel	2,00 %
Parfum	0,10 %

** Stearinsäure mit 100 Molen OE.

Wasser	QSP
Oligogalakturonide dp 1 bis 5 (Trockensubstanz)	0,01 % bis 5 %
Xanthangummi	0,30 %
Sequestrierungsmittel (z.B. EDTA)	0,05 %
Konservierungsmittel	1,50 %
C18-Säure	2,50 %
C16-Säure	2,50 %
Trilaurin	1,00 %
Karite-Butter	3,00 %
Tocopherylacetat	0,05 %
ß-Bisabolol	0,05 %
Pflanzenöl (Weizenkeim)	5,00 %
Dimetheticon	3,00 %
Polyacrylsäure	0,30 %
Triethanolamin (TEA)	1,50 %
Parfum	0,10 %

Wasser	QSP
Oligogalakturonide dp 1 bis 5 (Trockensubstanz)	0,001 bis 0,1 %
Sequestrierungsmittel	0,05 %
Propylenglykol	2,00 %

Konservierungsmittelgemisch	1,5 %
Alkohol	5 bis 50 %
Oleinalkohol 20 OE	1,00 %
Parfum	0,05 %

Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft die Anwendung von Oligogalakturoniden in der Kosmetik oder zur Herstellung einer pharmazeutischen, besonders dermatologischen Zusammensetzung als Mittel zur Stimulierung der Haftung der basalen Keratinozyten an den zwei Hauptproteinen der Lederhaut-Epidermis-Verbindung, welche das Laminin V und das Kollagen IV sindund welches dazu dient, die Störungen der Kommunikation zwischen der Lederhaut und der Epidermis und die Verringerung der inter-keratinozytären Kohäsion im Bereich der Epidermis zu lindern, welche im Verlauf der Hautalterung auftreten.

Claims

Anwendung von Oligogalakturonid in der Kosmetik oder zur Herstellung einer dermatologischen Zusammensetzung als Mittel zur Stimulierung der Haftung von basalen Keratinozyten an zwei Hauptproteinen der JDE, welche das Laminin V und das Kollagen IV sind, zum Lindern von Unregelmäßigkeiten der Kommunikation zwischen der Lederhaut und der Epidermis und der Verringerung der interkeratinozytären Kohäsion im Bereich der Epidermis, welche im Verlauf der Hautalterung auftreten.
Anwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligogalakturonide einen Polymerisationsgrad zwischen 1 und 5 aufweisen.
Anwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligogalakturonide erhalten werden durch enzymatische Hydrolyse eines Pektins, wobei diese Hydrolyse durch einen Enzymcocktail erfolgt, der Pektinasen enthält, die hautpsächlich Polygalakturonase-, Methylesterase- und Polygalakturonaselyase-Aktivitäten aufweisen.
Anwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligogalakturonide erhalten sind nach dem Verfahren, welches die folgenden Schritte aufweist: – Hydrolyse einer Lösung von Pektin wie mit einer Konzentration von 0,1 bis 10 % und vorzugsweise 1 % bei einem pH in der Größenordnung von 4,5 durch Zugabe einer Enzymlösung, die 10 bis 1000 und vorzugsweise 100 Einheiten Polygalakturonase enthält, zu der genannten Pektinlösung, um in der Endlösung 1 bis 10 und vorzugsweise 4 Einheiten Pektinase zu erhalten; – Abbruch der Hydrolyse; – Abtrennung der Polymeren mit hohen Molekulargewichten und Gewinnung der Oligogalakturonide.
Anwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse der Pektinlösung mit einer Enzymlösung durchgeführt wird, die Pektinasen enthält, die hauptsächlich Polygalakturonase-, Methylesterase- und Polygalakturonaselyase-Aktivitäten haben.
Anwendung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse bei 50°C während 2 Stunden durchgeführt und dann durch Erhitzen auf 70°C während 1 Stunde oder 100°C während 5 Minuten abgebrochen wird.
Anwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Abkühlen die Polymeren mit hohen Molekulargewichten durch Zugabe von 1 N HCl gefällt und dann durch Zentrifugieren bei beispielsweise 5000 g während 30 Minuten oder Filtration entfernt werden und daß der pH des Überstands am Ende wieder auf einen Wert zwischen 6 und 8, beispielsweise in der Größenordnung von 6,9 eingestellt wird.
Anwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung einer kosmetischen oder dermatologischen Zusammensetzung zum Stimulieren der Haftung der basalen Keratinozyten an den zwei Hauptproteinen der JDE, welche das Laminin V und das Kollagen IV sind, und bestimmt zum Lindern der Unregelmäßigkeiten der Kommunikation zwischen der Lederhaut und der Epidermis im Verlauf der Hautalterung.
Anwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Trockenäquivalent in Bezug auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung 0,01 bis 0,5 % und vorzugsweise 0,5 % der Oligogalakturonide enthält.
Kosmetische Methode zum Lindern der Unregelmäßigkeiten der Kommunikation zwischen der Lederhaut und der Epidermis und der Verringerung der inter-keratinozytären Kohäsion im Bereich der Epidermis, welche im Verlauf der Hautalterung auftreten, bestehend in dem Aufbringen auf die Haut einer genügenden Menge Oligogalakturonide oder einer solche enthaltenden Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert.