DE10259786A1

DE10259786A1 - Kristalle der Glukokinase und Verfahren zu ihrer Züchtung

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Publication number: DE10259786A1
Application number: DE10259786A
Authority: DE
Inventors: Wendy Lea Corbett; Robert Lewis Crowther; Pete William Dunten; Ursulla R Kammlott; Christine Maria Lukacs
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2001-12-19
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2003-07-17
Also published as: FR2834295B1; JP3734472B2; JP2003235551A; US7534593B2; US6911545B2; US20060141599A1; GB0229456D0; GB2385328A; FR2834295A1; US20030219887A1; GB2385328B

Abstract

Kristalline Formen von Säuger-Glucokinase von ausreichender Größe und Qualität und Strukturdaten mit Hilfe von Röntgenkristallographie zu erhalten, werden dargestellt. Verfahren zur Züchtung solcher Kristalline sind ebenfalls offenbart.

Description

Die Erfindung betrifft kristalline Formen der Glucokinase von ausreichender Größe und Qualität um Strukturdaten mittels Röntgenkristallographie zu erhalten und Verfahren zum Züchten solcher Kristalle.

Glucokinase (GK) ist eine von vier Hexokinasen, die in Säugern gefunden worden sind [Colowick, S.P., in The Enzymes, Bd. 9 (P. Boyer, Hrsg.) Academic Press, New York, NY, S. 1-48, 1973]. Die Hexokinasen katalysieren den ersten Schritt des Glucosemetabolismus, d. h. die Umwandlung von Glucose zu Glucose-6-Phosphat. Glucokinase hat eine begrenzte zelluläre Verteilung und wird vornehmlich in pankreatischen β-Zellen oder Parenchymzellen der Leber gefunden. Zusätzlich ist GK ein Geschwindigkeits-kontrollierendes Enzym des Glucosemetabolismus in diesen beiden Zelltypen, von denen bekannt ist, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Glucose-Homöostase des ganzen Körpers spielen [Chipkin, S.R., Kelly, K.L, und Ruderman, N.B. in Joslin's Diabetes (C.R. Khan und G.C. Wier, Hrsg.), Lea und Febiger, Philadelphia, PA, S. 97-115, 1994]. Die Glucosekonzentration bei der die GK eine halbmaximale Aktivität zeigt ist annähernd 8 mM. Die anderen drei Hexokinasen sind bei deutlich geringeren Konzentrationen (<1 mM) gesättigt. Daher steigt der Glucosefluss durch den GK-Stoffwechselweg an, wenn sich die Glucosekonzentration im Blut nach einer kohlenhydrathaltigen Mahlzeit von Fasten(5 mM)- zu Postprandial(~10-15 mM)-Spiegeln erhöht [Printz, R.G., Magnuson, M.A., und Granner, D.K. in Ann. Rev. Nutrifion Bd. 13 (R.E. Olson, D.M. Bier, und D.B. McCormick, Hrsg.), Annual Review, Inc., Palo Alto, CA, S. 463-496, 1993]. Diese Erkenntnisse trugen vor über einem Jahrzehnt zur Hypothese bei, dass GK als Glucosesensor in β-Zellen und Hepatocyten fungiert (Meglasson, M.D. und Matschinsky, F.M. Amer. J. Physiol. 246, E1-E13, 1984). In den letzten Jahren haben Untersuchungen an transgenen Tieren bestätigt, dass GK tatsächlich eine entscheidende Rolle bei der Glucose-Homöostase des ganzen Körpers spielt. Tiere, die keine GK exprimieren sterben innerhalb weniger Tage nach der Geburt mit schwerer Diabetes, während Tiere, die GK überexprimieren eine verbesserte Glucosetoleranz aufweisen (Grupe, A., Hultgren, B., Ryan, A. et al., Cell 83, 69-78, 1995; Ferrie, T., Riu, E., Bosch, F. et al., FASEB J., 10, 1213-1218, 1996). Werden β-Zellen in erhöhtem Maße Glucose ausgesetzt, ist dies über GK-Kopplung in den β- Zellen mit einer erhöhten Insulinausscheidung verbunden. Werden Hepatocyten in erhöhtem Maße Glucose ausgesetzt, ist dies über GK-Kopplung in den Hepatocyten mit erhöhter Glykogenablagerung und vielleicht reduzierter Glucoseproduktion verbunden.

Die Erkenntnis, dass Typ II-Diabetes, das bei jungen Erwachsenen ausbricht (MODY-2, "maturity-onset diabetes of the young") durch Mutationen im GK-Gen verursacht wird, die zum Verlust der Funktion führen, deutet daraufhin, dass GK auch als Glucosesensor im Menschen fungiert (Liang, Y., Kesavan, P., Wang, L. et al., Biochem. J. 309, 167-173, 1995). Ein zusätzlicher Beweis, der die wichtige Rolle von GK bei der Regulierung des Glucose-Metabolismus im Menschen stützt, wird durch die Identifizierung von Patienten geliefert, die eine mutierte Form von GK mit erhöhter Enzymaktivität exprimieren. Diese Patienten zeigen eine Fasten- Hyperglykämie verbunden mit einem unangemessen erhöhten Plasma-Insulinspiegel (Glaser, B., Kesavan, P., Heyman, M. et al., New England J. Med. 338, 226-230, 1998). Obwohl bei einem Großteil der Patienten mit Typ II-Diabetes keine Mutationen des GK Gens gefunden werden, sind Verbindungen die GK aktivieren und dadurch die Empfindlichkeit des GK-Sensorsystem erhöhen immer noch für die Behandlung der hyperglykämischen Charakteristiken aller Typ II-Diabetes nützlich. Glucokinase- Aktivatoren steigern den Fluss des Glucose-Metabolismus in β-Zellen und Hepatocyten, der mit einer erhöhten Insulinausscheidung verbunden ist. Solche Mittel wären für die Behandlung von Typ II-Diabetes nützlich.

Es wird oft versucht die Kristallstruktur solcher Proteine zu bestimmen, insbesondere bei Anstrengungen den Mechanismus aufzuklären, der der Kinase-Aktivierung unterliegt. Die Kristallstrukturen verschiedener Hexokinasen sind veröffentlicht worden. Siehe z. B. A.E. Aleshin, C. Zeng, G.P. Bourenkov, H.D. Bartunik, H.J. Fromm & R.B. Honzatko "The mechanism of regulation of hexokinase: new insights from the crystal structure of recombinant human brain hexokinase complexed with glucose and glucose-6-phosphate" Structure 6, 39-50 (1998); W.S. Bennett, Jr. & T.A. Steitz "Structure of a complex between yeast hexokinase A and glucose I. Structure determination and refinement at 3.5 Å resolution" J. MoLBiol. 140, 183-209 (1978); und S. Ito, S. Fushinobu, I. Yoshioka, S. Koga, H. Matsuzawa & T. Wakagi "Structural Basis for the ADP-Specificity of a Novel Glucokinase from a Hyperthermophilic Archaeon" Structure 9, 205-214 (2001). Trotz dieser Berichte versuchten Forscher, die wussten wie man Kristalle der betreffenden Hexokinasen erhält, erfolglos Kristalle von jeder Säuger-Glucokinase zu erhalten.

Die Anmelder haben Verfahrensanweisungen gefunden, welche die Kristallisation von Säuger-Glucokinase mit oder ohne einen gebundenen allosterischen Liganden ermöglichen. Die Kristallstruktur wurde mit Hilfe von Röntgenkristallographie bei einer Auflösung von 2.7 Å gelöst. Siehe Fig. 3 und 4. Daher betrifft die Erfindung eine kristalline Form der Glucokinase und eine kristalline Form eines Komplexes der Glucokinase mit einem allosterischen Liganden. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung von Glucokinasekristallen mit oder ohne einen gebundenen allosterischen Liganden.

Fig. 1 zeigt Glucokinase-Co-Kristalle mit P6(5)22-Symmetrie.

Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz einer exprimierten Glucokinase, die zur Kristallisation verwendet wurde.

Fig. 3 zeigt ein Bänderdiagramm der Struktur von Glucokinase, das die α-Helices und die β-Faltblätter zeigt.

Fig. 4 zeigt die Atomstrukturkoordinaten der Glucokinase gebunden an 3- Cyklopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2-yl-propionamid.

Die vorliegende Erfindung betrifft kristalline Formen von Säuger-Glucokinase mit oder ohne an der allosterischen Stelle gebundenem Liganden, wobei die Kristalle von ausreichender Qualität und Größe sind um die dreidimensionale Röntgen- Beugungs-Struktur zu einer Auflösung von etwa 2,0 Å bis etwa 3,5 Å zu bestimmen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und Kristallisation der Glucokinase. Die kristallinen Formen der Glucokinase sowie die von ihren Kristallstrukturen abgeleiteten Informationen können verwendet werden um die Glucokinase-Aktivität zu analysieren und zu modifizieren, sowie um Verbindungen zu identifizieren, die mit der allosterischen Stelle in Wechselwirkung treten.

Die Kristalle der Erfindung schließen Apo-Kristalle und Co-Kristalle ein. Die Apo- Kristalle der Erfindung umfassen normalerweise im Wesentlichen reine Glucokinase. Die Co-Kristalle umfassen normalerweise im Wesentlichen reine Glucokinase mit einem an der allosterischen Stelle gebundenen Liganden.

Es ist so zu verstehen, dass die kristallinen Glucokinasen der Erfindung nicht auf natürlich vorkommende oder native Glucokinasen begrenzt sind. Tatsächlich schließen die Kristalle der Erfindung auch Mutanten der nativen Glucokinasen ein. Mutanten der nativen Glucokinasen werden erhalten durch Austausch von mindestens einem Aminosäurerest in einer nativen Glucokinase-Domäne durch einen unterschiedlichen Aminosäurerest, oder durch Hinzufügen oder Deletieren von Aminosäureresten innerhalb des nativen Polypeptids oder am N- oder C-Terminus des nativen Polypeptids, und haben im Wesentlichen die gleiche dreidimensionale Struktur wie die native Glucokinase von der die Mutante abgeleitet ist.

Unter "hat im wesentlichen die gleiche dreidimensionale Struktur" ist zu verstehen, dass man einen Satz von Atomstrukturkoordinaten eines Apo- oder Co-Kristalls hat, deren Standardabweichnung weniger als oder gleich etwa 2 Å ist, wenn sie mit den Atomstrukturkoordinaten der nativen Glucokinase von der die Mutante abgeleitet ist, überlagert werden und wenn mindestens etwa 50% bis etwa 100% der α- Kohlenstoffatome der nativen Glucokinase bei der Überlagerung eingeschlossen sind.

In einigen Fällen, um z. B. die Reinigung des Polypeptids usw. zu unterstützen, kann es besonders vorteilhaft oder günstig sein, Aminosäurereste einer nativen Glucokinase-Domäne zu ersetzen, zu entfernen und/oder hinzuzufügen um passende Clonierungsstellen in der cDNA bereitzustellen, die für das Polypeptid codiert. Solche Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen, welche die dreidimensionale Struktur der nativen Glucokinase im Wesentlichen nicht verändern sind für den Fachmann offensichtlich.

Es sollte angemerkt werden, dass die hier in Erwägung gezogenen Mutanten keine Glucokinase-Aktivität zeigen müssen. Tatsächlich werden Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen, die die Kinase-Aktivität der Glucokinase beeinträchtigen, die aber die dreidimensionale Struktur der Domäne nicht signifikant ändern, bei der Erfindung speziell in Betracht gezogen. Solche kristallinen Polypeptide oder die davon erhaltenen Atomstrukturkoordinaten können verwendet werden um Verbindungen zu identifizieren, die an die native Domäne binden. Diese Verbindungen können die Aktivität oder die native Domäne beeinflussen.

Die abgeleiteten Kristalle der Erfindung umfassen im Allgemeinen ein kristallines Glucokinase-Polypeptid in kovalenter Bindung mit einem oder mehreren Schwermetallatomen. Das Polypeptid kann einer nativen oder einer mutierten Glucokinase entsprechen. Schwermetallatome, die nützlich sind um abgeleitete Kristalle bereitzustellen, schließen beispielhaft und nicht begrenzend Gold und Quecksilber ein. Alternativ können abgeleitete Kristalle aus Proteinen erzeugt werden, die Schwermetallatome in einer oder mehreren Aminosäuren eingebaut haben, uvie bei Selen-Methionin-Substitutionen für Methionin.

Die Co-Kristalle der Erfindung umfassen im Allgemeinen ein kristallines Glucokinase- Polypeptid in Verbindung mit einer oder mehreren Verbindungen an der allosterischen Stelle des Polypeptids. Die Bindung kann kovalent oder nicht kovalent sein.

Die hierin beschriebenen nativen und mutierten Glucokinase-Polypeptide können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder über Verfahren, die dem Fachmann der Molekularbiologie gut bekannt sind, hergestellt werden. Die Expressionsvektoren, die verwendet werden sollen, können eine codierende Sequenz des nativen oder mutierten Glucokinase-Polypeptids und geeignete transkriptionelle und/oder translatorische Kontrollsignale enthalten. Diese Verfahren schließen in vitro-DNA- Rekombinations-Verfahren, synthetische Verfahren und in vivo-Rekombination/genetische Rekombination ein. Siehe z. B. das in Maniatis et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et. al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY beschriebene Verfahren.

Eine Vielzahl von Wirt-Expressionsvektor-Systemen können verwendet werden, um die Glucokinase codierende Sequenz zu exprimieren. Diese schließen ein ohne darauf begrenzt zu sein: Mikroorganismen wie mit rekombinanter Bakteriophagen- DNA transformierte Bakterien; Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, die die Glucokinase codierende Sequenz enthalten; Hefe, transformiert mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren, die die Glucokinase codierende Sequenz enthalten; Insektenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Baculovirus), die die Glucokinase codierende Sequenz enthalten; Pflanzenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV; Tabak-Mosaikvirus, TMV) oder transformiert mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid), die die Glucokinase codierende Sequenz enthalten; oder Tierzellsysteme. Die Expressionselemente dieser Systeme variieren in ihrer Stärke und Spezifitäten. Abhängig vom verwendeten Wirt/Vektor-System können beliebige einer Reihe von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden, einschließlich konstitutive und induzierbare Promotoren wie pL des Bakteriophagen µ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybrid-Prormotor) und ähnliche. Bei der Glonierung in Insekten- Zellsystemen können Promotoren, wie der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor, verwendet werden. Bei der Clonierung in Pflanzenzellsystemen können Promotoren, die von einem Pflanzenzellgenom (z. B. Hitzeschock-Promotoren, der Promotor für die kleine Untereinheit des RUBISCO; der Promotor für das Chlorophyll a/b Bindungsprotein) oder von Pflanzenviren abgeleitet sind (z. B. Wer 35S-RNA- Promotor von CaMV, der Hüllenprotein-Promotor von TMV) verwendet werden. Bei der Clonierung in Säugerzellsystemen können Promotoren, die vom Genom von Säugerzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säuger-Viren abgeleitet sind (z. B. der späte Adenovirus-Promotor; der Vacciniavirus 7.5K-Promotor) verwendet werden. Wenn Zelllinien erzeugt werden, die mehrere Kopien der Glucokinase codierenden Sequenz enthalten, können SV40-, BPV- und EBV- basierende Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.

Die Apo-, abgeleiteten und Co-Kristalle der Erfindung können mit Hilfe der in dem Fachgebiet der Proteinkristallographie gut bekannten Verfahren, einschließlich Batch-, Flüssigbrücken-, Dialyse-, Dampfdiffusionsverfahren und dem Verfahren des hängenden Tropfens erhalten werden (siehe z. B. McPherson, 1982, Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley, NY; McPherson, 1990, Eur. J. Biochem. 189: 1-23; Webber, 1991, Adv. Protein Chem. 41: 1-36; Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, herausgegeben von Arnaud Ducruix and Richard Giege, Oxford University Press; Protein Crystallization Techniques, Strategies, and Tips, herausgegeben von Terese Bergfors, International University Line, 1999). Im Allgemeinen werden die Apo- oder Co-Kristalle der Erfindung gezüchtet durch Einbringen eines im Wesentlichen reinen Glucokinase-Polypeptids in einen wässrigen Puffer, der ein Fällungsmittel in einer Konzentration enthält, die gerade unterhalb derer liegt, die nötig ist um das Protein auszufällen. Das Wasser wird dann aus der Lösung durch kontrollierte Verdampfung entfernt, um Kristallisationsbedingungen zu erzeugen, die aufrechterhalten werden bis das Kristallwachstum beendet ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Apo- oder Co-Kristalle mit Hilfe von Dampfdiffusion gezüchtet. Bei diesem Verfahren wird der Polypeptid/Fällungsmittel-Lösung ermöglicht in einem geschlossenen Behälter mit einem größeren Wasserreservoir, das eine Fällungskonzentration aufweist, die für die Erzeugung des Kristalls optimal ist, zu äquilibrieren. Im Allgemeinen wird weniger als etwa 10 µl der im wesentlichen reinen Polypeptidlösung mit einem gleichen Volumen der Reservoirlösung vermischt, wodurch eine Fällungsmittelkonzentration von etwa der Hälfte der für die Kristallisation erforderlichen erhalten wird. Diese Lösung wird in Form eines Tröpfchens unterhalb eines Deckgläschens suspendiert, das den oberen Teil eines Reservoirs dicht verschließt. Der verschlossene Behälter wird einen Tag bis ein Jahr, normalerweise etwa 2-6 Wochen, stehen gelassen bis Kristalle wachsen.

Für die Kristalle der Erfindung ist gefunden worden, dass hängende Tropfen, die etwa 2-5 µl Glucokinase (9-22 mg/ml in 20 mM Tris, pH 7,1, gemessen bei Raumtemperatur, 50 mM NaCl, 50 mM Glucose, 10 mM DTT und gegebenenfalls 0,2 mM EDTA) und eine gleiche Menge Reservoirlösung (16-25% Gew./Vol. Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 8000 bis etwa 10000 Dalton, 0,1-0,2 M Tris oder Bistris oder Hepes oder Ammoniumphosphat-Puffer, pH 6,9-7,5, 8-10 mM DTT, 0-30% gesättigte Glucose) enthalten und etwa 3-4 Wochen bei 4-6°C über 0,5 bis 1,0 ml Reservoir-Puffer suspendiert wurden, Kristalle bereitstellten, die für hochauflösende Röntgenstrukturanalyse geeignet waren. Besonders bevorzugte Bedingungen waren: etwa 2-5 µl Glucokinase (10 mg/ml in 20 mM Tris, pH 7,1, gemessen bei Raumtemperatur, 50 mM NaCl, 50 mM Glucose, 10 mM DTT und gegebenenfalls 0,2 mM EDTA) und eine gleiche Menge Reservoirlösung (22,5% Gew./Vol. Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 10000 Dalton, 0.1 M Tris, pH 7,08, 10 mM DTT, 20% Glucose) wurden über 0,5 bis 1,0 ml Reservoir-Puffer etwa 3-4 Wochen bei 4-6°C suspendiert.

Das optimale Verfahren zur Züchtung von Kristallen, die groß genug sind um damit Daten zu sammeln, umfasste ein erstes Aufstreifen von 3-4 µl Proteinlösung auf dem Deckgläschen, gefolgt vom Aufstreifen von 3-4 µl Wannenlösung auf den verlängerten Tropfen des Proteins unter Bildung eines Tröpfchens, das wie der Buchstabe "X" geformt war. Vor der Entdeckung der gekreuzten Tropfentechnik lieferten die meisten Tropfen Schauer aus kleinen Kristallen, die für den Zweck der Datensammlung nicht groß genug waren. Durch die gekreuzten Tropfen wird ermöglicht, dass sich Gradienten von Protein und Fällungsmittel bilden, wenn sich die beiden Lösungen langsam vermischen und die resultierende Kinetik der Kristallkeimbildung und des -wachstums sind optimal zur Züchtung einer kleinen Anzahl großer Kristalle in jedem gekreuzten Tropfen. Einfaches Zusammenmischen von Protein- und Fällungsmittel-Lösungen in einem einzelnen runden Tropfen erzeugt oft eine Überfülle von Keimen, die zu einer endgültigen Größe wuchsen, die zum Zweck der Datensammlung zu klein ist. Die Kristalle erscheinen gewöhnlich 5 Tage nach dem Ansetzen. Die Kristalle wachsen in Form von hexagonalen Bipyramiden, die typischerweise Dimensionen von 0,2 × 0,2 × 0,4 mm erreichen, obwohl oftmals größere Kristalle beobachtet werden. Fig. 1 zeigt gezüchtete Kristalle.

Die Kristalle können vor der Datensammlung eingefroren werden. Die Kristalle werden entweder durch (a) 20-30% gesättigte Glucose, anwesend im Kristallisationsansatz, (b) Ethanol zugesetzt zu 15-20%, (c) Ethylenglykol zugesetzt zu 10-20% und PEG 10000 aufgebracht bis 25% oder (d) Glycerin zugesetzt zu 15% vor Frost geschützt werden. Die Kristalle werden entweder kurz in ein Frostschutzmittel eingetaucht oder für Zeitspannen von einem Tag im Frostschutzmittel eingeweicht. Das Einfrieren erfolgt durch Eintauchen des Kristalls in einem Bad aus flüssigem Stickstoff oder durch Einbringen des Kristalls in einen Strom aus Stickstoffgas bei 100 K.

Die Mosaikstreuung der gefrorenen Kristalle konnte manchmal durch Umkristallisieren ("annealing") vermindert werden, wobei der kalte Stickstoffstrom kurzzeitig blockiert wird, wodurch dem gefrorenen Kristall ermöglicht wird, für einen Moment aufzutauen bevor er im Stickstoffgasstrom erneut gefriert. Ein anderes Verfahren, das bei der Datensammlung manchmal hilfreich war, war eher eines der Enden der hexagonalen Bipyramide als den Mittelteil im Röntgenstrahl zu zentrieren. Die Mosaikstreuung kann manchmal mit Hilfe dieses Verfahrens reduziert werden.

Die Beugungsdaten, die sich typischerweise bis 2,7 Å erstreckten, wurden von den gefrorenen Kristallen auf dem Synchroton Beamline X8C der National Synchrotron Light Source in Brookhaven, New York, gesammelt. Unter optimalen Bedingungen wurden Daten aufgenommen, die sich bis 2,2 Å erstrecken. Siehe Fig. 3 und 4 für die Auflösung. Die Raumgruppe der Kristalle wurde als P6(5)22 während dem Lauf für die Auflösung der Kristallstruktur bestimmt. Die Kristalle haben die Elementarzell- Dimensionen a = b = 79,62 +/-0,60 Å, c = 321,73 +/-3,70 Å, αγ = β = 90°, γ = 120°. Die Kristalle sind in einem hexagonalen System mit P6(5)22-Symmetrie.

Der Fachmann wird natürlich erkennen, dass die oben beschriebenen Kristallisationsbedingungen variiert werden können. Solche Variationen können alleine oder in Kombination verwendet werden und schließen ein: Polypeptidlösungen, die Polypep'tidkonzentrationen zwischen 1 mg/ml und 60 mg/ml enthalten, alle im Handel erhältlichen Puffersysteme, die den pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,6 aufrechterhalten können, Tris-HCl-Konzentrationen zwischen 10 mM und 200 mM, Dithiothreit- Konzentrationen zwischen 0 mM und 20 mM, vorzugsweise zwischen 8 und 10 mM, den Austausch von Dithiothreit durch β-Mercaptoethanol oder andere in der Fachwelt bekannte, äquivalente Glucosekonzentrationen zwischen 0% Gew./Vol. und 30% Gew./Vol., oder der Austausch von Glucose durch andere Zucker von denen bekannt ist, dass sie Glucokinase binden und Reservoirlösungen die Polyethylenglykol (PEG)-Konzentrationen zwischen etwa 10% und etwa 30% enthalten, Polyethylenglykol mittlerer Molekulargewichte zwischen etwa 1000 und etwa 20000 Dalton, alle im Handel erhältlichen Puffersysteme, die den pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,6 aufrechterhalten können, Dithiothreit-Konzentrationen zwischen 0 mM und 20 mM, den Austausch von Dithiothreit durch β-Mercaptoethanol oder andere in der Fachwelt bekannte SH-Gruppen enthaltende Äquivalente oder den Austausch von Glucose durch andere Zucker von den bekannt ist, dass sie Glucokinase binden und die Temperatur liegt im Bereich von 4 und 20°C.

Die abgeleiteten Kristalle der Erfindung können durch Einweichen der Apo- oder Co- Kristalle in der Mutterlauge, die Salze der Schwermetallatome enthält, gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren der Röntgenkristallographie erhalten werden.

Die Co-Kristalle der Erfindung können durch Einweichen eines Apo-Kristalls in Mutterlauge, die einen Liganden enthält, der an der allosterischen Stelle bindet, erhalten werden oder kann durch Co-Kristallisieren des Glucokinasepolypeptids in Anwesenheit von einem oder mehreren Liganden, die an der allosterischen Stelle binden, erhalten werden. Co-Kristalle werden vorzugsweise mit einem Glucokinaseaktivator erzeugt, offenbart in: US Pat. Nr. 6,320,050; US Pat. Anm. 09/532,506, eingereicht am 21. März 2000; US Pat. Anm. 09/675,781, eingereicht am 28. September 2000; US Pat. Anm. 09/727,624, eingereicht am 1. Dezember 2000; US Pat. Anm. 09/841,983, eingereicht am 25. April 2001; US Pat. Anm. 09/843,466, eingereicht am 26. April 2001; US Pat. Anm. 09/846,820, eingereicht am 1. Mai 2001; US Pat. Anm. 09/846,821, eingereicht am 1. Mai 2001; US Pat. Anm. 09/905,152, eingereicht am 13. Juli 2001; US Pat. Anm. 09/924,247, eingereicht am 8. August 2001; vorläufige US Pat. Anm. 60/251,637, eingereicht am 6. Dezember 2000; oder vorläufige US Pat. Anm. 60/318,715, eingereicht am 13. September 2001, wovon jede hierin durch Bezugnahme einbezogen ist.

Die hierin beschriebenen Verfahren zum Erhalt der dreidimensionalen Strukturen der kristallinen Glucokinasen, sowie der Atomstrukturkoordinaten sind in dem Fachgebiet gut bekannt (siehe, z. B., D.E. McRee, Practical Protein Crystallography, herausgegeben von Academic Press, San Diego (1993), und die darin zitierten Referenzen).

Die Kristalle der Erfindung und insbesondere die davon erhaltenen Atomstrukturkoordinaten finden eine breite Anwendung. Zum Beispiel sind die hierin beschriebenen Kristalle und Strukturkoordinaten insbesondere zur Identifizierung von Verbindungen nützlich, die Glucokinasen aktivieren, als ein Weg im Hinblick auf die Entwicklung neuer Therapeutika. Eine solche Verbindung ist 3-Cyclopentyl-2-pyridin- 4-yl-N-thiazol-2-yl-propionamid und pharmazeutisch annehmbare Salze davon. Aus diesen Verbindungen können Arzneimittel entwickelt werden und die Verbindungen können zur Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das diese Verbindung zur Behandlung von Hyperglykämie bei Typ-II Diabetes umfasst.

Die hierin beschriebenen Strukturkoordinaten können als Phasenmodelle zur Bestimmung der Kristallstrukturen zusätzlicher, nativer oder mutierter Glucokinasen verwendet werden, ebenso können die Strukturen der Co-Kristalle solcher Glucokinasen mit daran gebundenen allosterischen Inhibitoren oder Aktivatoren bestimmt werden. Die Strukturkoordinaten sowie Modelle der davon erhaltenen dreidimensionalen Struktur können zur Aufklärung der auf der Lösung basierenden Strukturen von nativen oder mutierten Glucokinasen verwendet werden, ebenso wie die über NMR erhaltene. Daher stellen die Kristalle und Atomstrukturkoordinaten der Erfindung ein zweckmässiges Mittel zur Aufklärung der Strukturen und Funktionen der Glucokinasen zur Verfügung.

Zum Zweck der Klarheit und Diskussion werden die Kristalle der Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Glucokinasen durch beispielhafte Apo-Kristalle und Co- Kristalle beschrieben. Der Fachmann wird verstehen, dass die Prinzipien, die hier beschrieben werden, generell auf Kristalle von jeder Säuger-Glucokinase anwendbar sind, einschließlich, aber nicht begrenzt, auf die Glucokinase aus Fig. 2.

So wie hierin verwendet, bezieht sich "allosterische Stelle" im allgemeinen auf jede Ligandenbindungsstelle einer Säuger-Glucokinase, die keine aktive Stelle des Enzyms ist.

So wie hierin verwendet, bezieht sich "Apo-Kristall" auf Kristalle der Säuger- Glucokinase, die ohne gebundenen allosterischen Liganden erzeugt werden.

So wie hierin verwendet, bezieht sich "allosterischer Ligand" auf jedes Molekül, das spezifisclh an der allosterischen Stelle der Säuger-Glucokinase bindet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der Co-Kristall der Erfindung einen an der allosterischen Stelle gebundenen Liganden, ausgewählt aus der Gruppe:
N-(5-Brompyridin-2-yl)-2-(3-chlor-4-methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentyl-propionamid, 2-(3-Chlor-4-methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentyl-N-(5-trifluormethyl-pyridin-2- yl)-propionamid, (2S)-2-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionylamino]-thiazol- 4-carbonsäuremethylester, (2S)-{2-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionylamino]-thiazol-5-yl}oxoessigsäureethylester, (2S)-{3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-ureido}-essigsäuremethylester, (2S)-1-[3-Cyclopentyl-2-(3,4- dichlorphenyl)-propionyl]-3-(3-hydroxypropyl)-harnstoff, (2S)-{3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4- dichlorphenyl)-propionyl]-ureido}-essigsäureethylester oder 3-Cyclopentyl-2-pyridin- 4-yl-N-thiazol-2-yl-propionamid.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung, die ein Ligand ist, der an der allosterischen Stelle der Glucokinase bindet, durch Analysieren der Strukturkoordinaten des Co-Kristalls der Erfindung identifiziert.

Die Erfindung betrifft auch eine Verbindung

und ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

Weiterhin wird mit der Erfindung ein Arzneimittel bereitgestellt, das die hierin beschriebenen Verbindungen umfasst. Diese Verbindungen betreffen Verbindungen, die durch Analysieren der Strukturdaten des Co-Kristalls wie hierin beschrieben identifiziert werden, wobei die Verbindungen Liganden sind, die an der allosterischen Stelle der Glucokinase binden. Besonders bevorzugt ist ein Arzneimittel, das die Verbindung und ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon umfasst.

Die hierin beschriebenen Verbindungen und Arzneimittel sollen vorzugsweise zur Behandlung von Hyperglykämie bei Typ II Diabetes eingesetzt werden. Insbesondere werden die Verbindungen zur Verwendung als therapeutischer Wirkstoff zur Reduzierung von Hyperglykämie bei Typ II Diabetes hierein offenbart.

Beispiele

Beispiel 1

Expression und Reinigung der Glucokinase

Expression von GK

Die Glucokinase (GK) wurde als Glutathion S-Transferase (GST)-Fusionprotein in Escherichia coli exprimiert. Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist in Fig. 2 angegeben. Das Expressionskonstrukt basiert auf dem Vektor pGEX-3X von Pharmacia, wie in Y. Liang, P. Kesavan, L. Wang, K. Niswender, Y. Tanizawa, M.A. Permutt, M.A. Magnuson, F.M. Matschinsky, Biochem. J. 309, 167 (1995) beschrieben. Das Konstrukt codiert eines der beiden Leber-Isozyme der menscHichen GK. Die GST-Markierung ist am N-Terminus des Konstrukts und ist durch eine Faktor-Xa-Spaltsteile von der codierenden Sequenz von GK getrennt. Nach der Reinigung des GST-Fusionsproteins wurde die GST-Fusionsmarkierung mit Faktor Xa-Protease entfernt, die auch fünf Reste vom N-Terminus der GK entfernt.

Reinigung der GK

E. coli Zellen, die GST-GK exprimieren wurden in Lysepuffer (50 mM Tris, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 1% NP-40, pH 7, 7) in Anwesenheit von Proteaseinhibitoren suspendiert, mit Lysozym bei 200 µ/ml 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 4 × 30 sek. bei 4°C beschallt. Nach dem Zentrifugieren, um unlösliches Material zu entfernen, wurde der Überstand auf Glutathion- Sepharose geladen, mit Lysepuffer und dann mit Lysepuffer minus NP-40 gewaschen. GST-GK wurde mit Lysepuffer (minus NP-40), der 50 mM D-Glucose und 20 nnM Glutathion enthielt eluiert. Das eluierte Protein wurde konzentriert und in 20 mM iris, 100 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 50 mM D-Glucose, 1 mM DTT, pH 7,7 dialysiert. Faktor Xa wurde bei einem Proteinverhältnis von 1 : 100 GST-GK zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von CaCl₂ bis 1 mM und die Probe wurde bei 4°C 48 Stunden inkubiert. Die Probe wurde der Glutathionsepharose zugesetzt und die ungebundene Fraktion gesammelt und konzentriert. Die Probe wurde dann mit Benzamidinsepharose inkubiert, um Faktor Xa zu entfernen und die ungebundene Fraktion wurde gesammelt und auf eine Q-Sepharosesäule, die mit 25 mM Bistris- Propan, 50 mM NaCl, 5 mM DTT, 50 mM D-Glucose und 5% Glyzerin (pH 7,0) äquilibriert war geladen. Das Protein wurde mit einem NaCl-Gradienten von 50-400 mM eluiert. Fraktionen, die die gereinigte GK enthielten, wurden vereinigt, konzentriert und filtriert.

Beispiel 2

Erzeugung des Apo-Kristalls

4 µl Glucokinase und 4 µl Fällungsmittel wurden vermischt und gegen die Fällungslösung bei 4°C äquilibriert. Die Glucokinaselösung bestand aus 22 mg/ml Glucokinase, hergestellt in Beispiel 1, in 20 mM Hepes pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM DTT, und 50 mM Glucose. Das Fällungsmittel bestand aus 22,5% PEG10000, 0,1 M Tris pH 7,08, 10 mM DTT, 20% Glucose; die Fällungslösung enthielt Saatkristalle für die Mikrosaat der Tröpfchen. Kristalle erschienen in den Tröpfchen nachdem die Kristallisationsplatten bei 4°C stehen gelassen wurden.

Beispiel 3

Erzeugung des Co-Kristalls mit 3-Cyclopentyl-2-Pyridin-4-yl-N- thiazol-2-yl-propionamid

3(a)

4 µl Glucokinase und 4 µl Fällungsmittel wurden vermischt und gegen die Fällungslösung bei 4°C äquilibriert. Die Glucokinaselösung bestand aus 13 mg7 ml Glucokinase, hergestellt in Beispiel 1, in 20 mM Tris pH 7,0, 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 50 mM Glucose, und dem Glucokinaseaktivator 3-Cyclopentyl-2-Pyridin-4-yl-Nthiazol-2-yl-propionamid bei einer fünffachen Konzentration von derjenigen des Proteins. Das Fällungsmittel bestand aus 22,5% PEG10000, 0,1 M Tris pH 7,08, 10 mM DTT und 20% Glucose. Kristalle erschienen in den Tropfen, nachdem die Kristallisationsplatten bei 4°C stehen gelassen wurden.

3(b)

Alternativ wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: anstelle von 4 µl Glucokinase und 4 µl Fällungsmittel wurden jeweils 2 µl verwendet; die Glucokinaselösung enthielt 11 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von pH 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurden 18% PEG8000 verwendet; die Fällungsmittellösung enthielt Saatkristalle für die Mikrosaat der Tröpfchen.

3(c)

Bei einer anderen Alternative wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: anstelle von 4 µl Glucokinase und 4 µl Fällungsmittel wurden jeweils 2 µl verwendet; die Glucokinaselösung enthielt 11 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von pH 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurden 20% PEG8000 verwendet; die Fällungsmittellösung enthielt Saatkristalle für die Mikrosaat der Tröpfchen.

3(d)

Bei noch einer anderen Alternative wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: anstelle von 4 µl Glucokinase und 4 µl Fällungsmittel wurden jeweils 2 µl verwendet; die Glucokinaselösung enthielt 12 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von pH 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurden 16% PEGI0000 verwendet; Glucose war als Bestandteil des Fällungsmittels nicht vorhanden; die Fällungsmittellösung enthielt Saatkristalle für die Mikrosaat der Tröpfchen.

3(e)

Bei noch einer weiteren Alternative wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 11 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,1 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurden 25% PEG10000 verwendet.

3(f)

Bei noch einer weiteren Alternative wurden Kristalle, wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 11 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,1 anstelle pH 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurden 21,25% PEG10000 verwendet; anstelle von Fällungsmittel das mit Tris auf pH 7,08 gepuffert wurde, wurde Fällungsmittel verwendet, das mit Tris auf pH 7,52 gepuffert wurde.

3(g)

Bei noch einer weiteren Alternative wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 12 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von Fällungsmittel, das mit Tris auf pH 7,08 gepuffert wurde, wurde Fällungsmittel verwendet, das mit Hepes auf pH 6,89 gepuffert wurde; anstelle von 20% Glucose im Fällungsmittel wurde 200 mM Glucose verwendet.

3(h)

Bei noch einer weiteren Alternative wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 12 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von Fällungsmittel, das mit 0,1 M Tris auf pH 7,08 gepuffert war, wurde Fällungsmittel verwendet, das mit 0,2 M Amoniumphosphat auf pH 7,03 gepuffert wurde; anstelle von 20% Glucose im Fällungsmittel wird 200 mM Glucose verwendet.

3(i)

Bei noch einer weiteren Alternative wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 10 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von pH 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurde 20% PEG10000 verwendet; anstelle von Fällungsmittel, das mit 0,1 M Tris auf pH 7,08 gepuffert war, wurde Fällungsmittel verwendet, das mit 0,2 M Tris auf pH 7,05 gepuffert wurde; anstelle von 10 mM DTT im Fällungsmittel wurde 8 mM DTT verwendet; Glucose war als Bestandteil im Fällungsmittel nicht vorhanden.

3(j)

Bei noch einer weiteren Alternative wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 12 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurde 22% PEG8000 verwendet; Glucose war als Bestandteil des Fällungsmittels nicht vorhanden; die Fällungsmittellösung enthielt Saatkristalle für die Mikrosaat der Tröpfchen.

3(k)

In noch einer weiteren Alternative wurden Kristalle wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, jedoch mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 11 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,1 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle von 20% Glucose im Fällungsmittel wurden 30% Glucose verwendet.

Beispiel 4

Erzeugung des Co-Kristalls mit N-(5-Brompyridin-2-yl)-2-(3-chlor-4- methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentyl-propionamid

Kristalle wurden wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 9 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,1 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle des Glucokinaseaktivators von Beispiel 3(a) enthielt die Glucokinaselösung den Glucokinseaktivator N-(5-Brompyridin-2-yl)-2-(3-chlor-4-methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentylpropionamid; anstelle von 20% Glucose im Fällungsmittel wurden 200 mM Glucose verwendet.

Beispiel 5

Erzeugung des Co-Kristalls mit 2-(3-Chlor-4-methansulfonylphenyl)-3-cyclopentyl-N-(5-trifluormethyl-pyridin-2-yl)-propionamid

Kristalle wurden wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 10 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,1 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle des Glucokinaseaktivators aus Beispiel 3(a) enthielt die Glucokinaselösung den Glucokinseaktivator 2-(3-Chlor-4-methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentyl-N-(5-trifluormethyl-pyridin-2-yl)- propionamid; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurde 21,25% PEG10000 verwendet.

Beispiel 6

Erzeugung des Co-Kristalls mit (2S)-2-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionylamino]-thiazol-4-carbonsäuremethylester

Kristalle wurden wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 10 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,1 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle des Glucokinaseaktivators von Beispiel 3(a) enthielt die Glucokinaselösung den Glucokinaseaktivator (2S)-2-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionylamino]-thiazol-4-carbonsäuremethylester; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurde 21,25% PEG10000 verwendet; anstelle von Fällungsmittel, das mit Tris auf pH 7,08 gepuffert wurde, wurde mit Bistris auf pH 7,0 gepuffertes Fällungsmittel verwendet.

Beispiel 7

Erzeugung des Co-Kristalls mit (2S)-{2-[3-Cycfopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionylamino]-thiazol-5-yl}oxoessigsäureethylester

Kristalle wurden wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaseläsung enthielt 10 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,1 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle des Glucokinaseaktivators von Beispiel 3(a) enthielt die Glucokinaselösung den Glucokinseaktivator (2S)-{2-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionylamino]-thiazol-5-yl}-oxo-essigsäureethylester; anstelle von 22,5% PEG10000 als Fällungsmittel wurde 21,25% PEG10000 verwendet.

Beispiel 8

Erzeugung des Co-Kristalls mit (2S)-{3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-ureido}-essigsäuremethylester

Kristalle wurden wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 9 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle des Glucokinaseaktivators von Beispiel 3(a) enthielt die Glucokinaselösung den Glucokinseaktivator (2S)-{3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-ureido}-essigsäuremethylester; anstelle von 20% Glucose im Fällungsmittel wurde 200 mM Glucose verwendet.

Beispiel 9

Erzeugung des Co-Kristalls mif (2S)-1-[3-Cyclopentyl-2-(3,4- dichlorphenyl)-propionyl]-3-(3-hydroxypropyl)-harnstoff

Kristalle wurden wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaselösung enthielt 14 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle des Glucokinaseaktivators von Beispiel 3(a) enthielt die Glucokinaselösung den Glucokinseaktivator (2S)-1-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-3-(3-hydroxypropyl)-harnstoff; anstelle von 20% Glucose im Fällungsmittel wurde 200 mM Glucose verwendet.

Beispiel 10

Erzeugung des Co-Kristalls mit (2S)-{3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4- dichlorphenyl)-propionyl]-ureido}-essigsäureethylester

Kristalle wurden wie in Beispiel 3(a) gezüchtet, mit den folgenden Änderungen: die Glucokinaseläsung enthielt 14 mg/ml Glucokinase in Tris-Puffer bei pH 7,08 anstelle von 7,0; die Glucokinaselösung beinhaltete 0,2 mM EDTA; anstelle des Glucokinaseaktivators von Beispiel 3(a) enthielt die Glucokinaselösung den Glucokinseaktivator (2S)-{3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-ureido}- essigsäureethylester; anstelle von Fällungsmittel, das mit Tris auf pH 7,08 gepuffert wurde, wurde mit Tris auf pH 7,05 gepuffertes Fällungsmittel verwendet.

Beispiel 11

Synthese von 3-Cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2-yl-propionamid

3-Cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2-yl-propionamid kann unter Verwendung gutbekannter organischer Syntheseverfahren nach dem folgenden Reaktionsschema hergestellt werden:
3-Cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2-yl-propionamid ist als allosterischer Aktivator der Glucokinase und zur Unterstützung der Erzeugung von Glucokinase-Co- Kristallen nützlich. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Kristall der Säuger-Glucokinase, wobei der Kristall die Elementarzell- Dimensionen aufweist:
a und b sind von 79,02 Å bis 80,22 Å;
c ist von 318,03 Å bis 325,03 A;
α und β sind 90°; und
γ ist 120°;
und P6(5)22-Symmetrie hat.

2. Co-Kristall der Säuger-Glucokinase und ein Ligand, der an der allosterischen Stelle der Glucokinase gebunden ist, wobei der Co-Kristall die Elementarzell- Dimensionen aufweist:
a und b sind von 79,02 Å bis 80,22 Å;
c ist von 318,03 Å bis 325,03 Å;
α und β sind 90°; und
γ ist 120°;
und P6(5)22-Symmetrie hat.

3. Verfahren zur Co-Kristallisation von Säuger-Glucokinase und einem allosterischen Liganden der Glucokinase, wobei das Verfahren umfasst:

a) Bereitstellen einer gepufferten wässrigen Lösung von 9 bis 22 mg/ml der Säuger-Glucokinase;

b) Hinzufügen eines molaren Überschusses des allosterischen Liganden zur wässrigen Lösung der Säuger-Glucokinase; und

c) Züchten von Kristallen mittels Dampfdiffusion unter Verwendung einer gepufferten Reservoirlösung zwischen etwa 10% und etwa 30% PEG, etwa 0% Gew./Vol, und etwa 30% Gew./Vol. Glucose und zwischen 0 und 20 mM DTT, worin das PEG ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 1.000 und etwa 20.000 aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Schritt (c) des Züchtens der Kristalle mittels Dampfdiffusion umfasst:

a) Aufstreifen der gepufferten wässrigen Lösung der Säuger-Glucokinase mit zugesetztem allosterischem Liganden auf einer Oberfläche zur Erzeugung eines verlängerten Tröpfchens der Proteinlösung, und

b) Aufstreifen von einer etwa gleichen Menge der gepufferten Reservoirlösung über das verlängerte Tröpfchen der Proteinlösung unter Bildung eines kombinierten Tröpfchens, geformt wie der Buchstabe "X".

5. Co-Kristall nach Anspruch 2, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe:
N-(5-Brompyridin-2-yl)-2-(3-chlor-4-methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentylpropionamid, 2-(3-Chlor-4-methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentyl-N-(5-trifluormethyl-pyridin-2-yl)-propionamid, (2S}-2-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)- propionylamino]-thiazol-4-carbonsäuremethylester, (2S)-{2-[3-Cyclopentyl-2- (3,4-dichlorphenyl)-propionylamino]-thiazol-5-yl}oxoessigsäureethylester, (2S)- {3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-ureido}-essigsäuremethylester, (2S)-1-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-3-(3-hydroxypropyl)-harnstoff, (2S)-{3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]- ureido}-essigsäureethylester, 3-Cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2-ylpropionamid.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe:
N-(5-Brompyridin-2-yl)-2-(3-chlor-4-methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentylpropionamid, 2-(3-Chlor-4-methansulfonyl-phenyl)-3-cyclopentyl-N-(5-trifluormethyl-pyridin-2-yl)-propionamid, (2S)-2-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)- propionylamino]-thiazol-4-carbonsäuremethylester, (2S)-{2-[3-Cyclopentyl-2- (3,4-dichlorphenyl)-propionylamino]-thiazol-5-yl}oxoessigsäureethylester, (2S)- {3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-ureido}-essigsäuremethylester, (2S)-1-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]-3-(3-hydroxypropyl)-harnstoff, (2S)-{3-[3-Cyclopentyl-2-(3,4-dichlorphenyl)-propionyl]- ureido}-essigsäureethylester, 3-Cyclopentyl-2-pyridin-4-yl-N-thiazol-2-ylpropionamid.

7. Kristall hergestellt mittels dem Verfahren nach Anspruch 3, 4 oder 6.

8. Verbindung identifiziert durch Analysieren der Strukturkoordinaten des Co- Kristalls nach Anspruch 2, wobei die Verbindung ein Ligand ist, der an der allosterischen Stelle der Glucokinase bindet.

9. Verbindung

und ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

10. Arzneimittel, umfassend die Verbindung nach Anspruch 8.

11. Arzneimittel nach Anspruch 10, worin die Verbindung der Verbindung nach Anspruch 8 entspricht.

12. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 8 oder 9 zur Behandlung von Hyperglykämie bei Typ II Diabetes.

13. Verbindung nach Anspruch 8 oder 9, zur Verwendung als therapeutischer Wirkstoff, insbesondere zur Reduzierung von Hyperglykämie bei Typ II Diabetes.

14. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels umfassend das Vermischen einer Verbindung identifiziert durch Analysieren der Strukturkoordinaten des Co-Kristalls nach Anspruch 2, wobei die Verbindung ein Ligand ist, der an die allosterische Stelle der Glucokinase bindet oder umfassend das Vermischen der Verbindung nach Anspruch 9 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.