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Herstellung und Gewinnung von Paromomycin Die Erfindung bezieht sich
auf die Herstellung und Gewinnung des neuen und wertvollen Antibiotikums Paromomycin.
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Paromomycin ist eine beständige amorphe weiße Substanz, die leicht
löslich in Wasser, mäßig löslich in Methanol und wenig löslich in absolutem Äthanol
ist. Es ist optisch aktiv und besitzt eine optische Drehung [a]ö von etwa -E- 64°
(1 °/o in Wasser).
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Paromomycin enthält nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff
und Sauerstoff. Laut Analyse enthält es 45,170/, Kohlenstoff, 7,440/, Wasserstoff
und 10,350/, Stickstoff. Es besitzt wahrscheinlich die empirische Formel
(C5Hs-iiN0s)x. Paromomycin gibt einen positiven Ninhydrintest, einen positiven Elson-Morgan-Test
für einen Aminozucker nach dem Erhitzen mit Alkali, einen negativen Test für Maltol
und einen negativen Sack-Guchi-Test für Guanidine.
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Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Paromomycin unter Verwendung
eines Mineralölklumpens aus dem gepulverten Material und Mineralöl ist gekennzeichnet
durch Absorptionsspitzen mit Wellenlängen von 2,93 und 6,25 Mikron. Fig. 1 zeigt
das Infrarot-Spektrum von Paromomycin. Paromomycin bildet Additionssalze mit Mineralsäuren,
wie Salzsäure, Schwefelsäure u. dgl.
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Paromomycin bildet ein Hydrochlorid mit einer optischen Drehung [üjD
von etwa -[- 56,5° (1 °/o in Wasser). Laut Analyse enthält Paromomycin-Hydrochlorid
35,710/0 Kohlenstoff, 6,95 °/o Wasserstoff, 8,42 °/a Stickstoff und 21,50/,
Chlor. Es hat wahrscheinlich die empirische Formel (C,H9_.i1N03 - HCl),. Der piz
- 6,3 und 8,35. Das Hydrochlorid ist in kaltem Äthanol löslicher als in heißem.
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Das Infrarot-Spektrum von Paromomycin-Hydrochlorid als Mineralölklumpen
ist gekennzeichnet durch Absorptionsspitzen bei Wellenlängen von 6,23, 6,61, 6,66,
8,72, 9,53 und 9,70 Mikron und eine Richtungsänderung bei 2,95 Mikron. Fig. 2 zeigt
das Ultrarot-Spektrum von Paromomycin-Hydrochlorid.
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Paromomycin bildet ein Sulfat mit einer optischen Drehung [a]ö von
etwa -i- 50,5° (1,5°/o in Wasser). Laut Analyse besitzt es die wahrscheinliche empirische
Formel (CjoHis-22N206 ' H2504), Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Paromomycinsulfat
als Mineralölklumpen ist gekennzeichnet durch hervortretende Absorptionsspitzen
bei Wellenlängen von 6,1 und 6,55 Mikron und eine Richtungsänderung bei 3,10 Mikron.
Fig. 3 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Paromomycinsulfat.
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Paromomycin kann erfindungsgemäß durch mikrobiologische Synthese hergestellt
werden, indem man einen Mikroorganismus, genannt Streptomyces rimosus forma paromomycinus,
unter künstlichen Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium züchtet. Die Herstellung
von Paromomycin durch mikrobiologische Arbeitsweisen wird weiter unten beschrieben.
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Streptomyces rimosus forma paromomycinus ist ein bisher unbekannter
Mikroorganismus, der in Erdböden vorkommt. Er wurde zum erstenmal aus einer Bodenprobe
isoliert, die bei Hazienda Tierradury, Miranda,
Columbien, in Südamerika
gesammelt wurde. Kulturen dieses Mikroorganismus können erhalten werden, indem man
eine Suspension der Bodenprobe, die diesen Organismus enthält, in sterilem Wasser
suspendiert, die schweren Teile sich zu Boden setzen läßt, die überstehende Bodensuspension
in verschiedenen Verdünnungen auf Agar-Nährplatten ausbreitet, die Platten bei 24
bis 28° bebrütet, um ein Wachstum des Mikroorganismus hervorzurufen, und die einzelnen
Wachstumsgruppen, die Streptomyces rimosus forma paromomycinus ähneln, auf frische
Agar-Nährplatten überträgt. Nach wiederholter Auswahl und Übertragung von nicht
verunreinigten und charakteristischen Wachstumsgruppen auf frische Agar-Nährplatten
werden reine Kulturen des gewünschten Mikroorganismus erhalten. Streptomyces rimosus
forma paromomycinus besitzt die folgenden Merkmale: Bei Züchtung auf Glycerin-Asparagin-Agar-Medium
ist das Substratmycel hellgelb bis braun und das Luftmycel weiß. Auf einem synthetischen
Stärke-Agar-Medium ist das Substratmycel hellbraun und das Luftmycel weiß. Auf einem
Calciummalat-Agar-Medium ist das Substratmycel hellgelbbraun und das Luftmycel weiß.
Auf einem Agar-Näbrmedium ist das Substratmycel hellgelb bis orangebraun, und es
wird wenig oder kein Luftmycel gebildet. Auf Glucose-Trypto-Agariyledium ist das
Substratmycel hellgelb bis hellbraun, das Luftmycel weiß, und es tritt eine leichte
Braunfärbung im Agarmedium auf. Die Oberflächenkolonien sind hervortretend, glatt,
mit Runzeln versehen oder faltig oder mit Rissen versehen in Gebieten dichten Wachstums.
Oft ist auch der Agar ebenfalls mit Rissen versehen. Mikroskopisch sind die Lufthyphen
unregelmäßig verzweigt, die Seitensprößlinge sind kurz und spiralig. Die Spiralen
sind auf den meisten Medien zahlreich und treten oft in dichten Haufen auf. Die
Endteile der Lufthyphen unterteilen sich in Sporenketten.
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Streptomyces rimosus forma paromomycinus verflüssigt Gelatine unter
Bildung von wenig oder keiner Färbung im Medium und peptisiert im allgemeinen Lakmusmilche
nicht. Im synthetischen Agarmedium (Pridham und Gottlieb, J. Bact., 56, 108 -1948])
verwertet der Organismus zahlreiche Kohlenstoffquellen einschließlich Adonit, Cellobiose,
Dextrin, Dextrose, d-Galaktose, Glycerin, i-Inosid, Laktose, Lävulose, d-Mannit,
d-Mannose, Mellibiose, Sorbit, Stärke, Trehalose. Weniger leicht verwendet er 1-Arabinose,
Ratfinose und Xylose. Nicht verwertet werden Aesculin, Dulcit, Enolin, Melezitose,
Rhamnose, Salicin und Sukrose. Der Organismus verwertet zahlreiche Stickstoffquellen
einschließlich dlAlanin, 1Arginin, dlAspartinsäure, 1-Cvstin, 1-Cystein, 1-Glutaminsäure,
Glycylglycin, 1-Histidin, 1-Leucin, 1-Lysin, 1-Phenylalanin, 1-Prolin, dl-Serin,
dl-Threonin, dl-Valin, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat; weniger leicht verwertet
es 1-Oxypyrolin, dl-Isoleucin, dl-Methionin, 1-Tryptophan, 1-Tyrosin, 1-Nor-Leucin,
Harnstoff und Ammoniumcarbonat.
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Morphologisch ähnelt Streptomyces rimosus forma paromomycinus dem
Streptomyces rimosus (beschrieben von S o b i n und anderen in der USA.-Patentschrift
2 516 080 und aufbewahrt als NRRL-2234 in der ständigen Kultursammlung des Northern
Utilization Research Brauch in Peoria, Illinois). Diese zwei Organismen weisen sehr
ähnliche Färbungen von Substrat und Luftmycel auf, wie in Tabelle I wiedergegeben
ist. Streptomyces rimosus ist etwas dunkler und färbt oft das Agar stärker als Streptomyces
rimosus forma paromomycinus.
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Bei Versuchen hinsichtlich der Kohlenstoffverwertung verwerten der
Streptomyces rimosus forma paromomycinus und Streptomyces rimosus die gleichen Kohlenstoffquellen
mit Ausnahme von 1Arabinose, die der Streptomyces rimosus forma paromomycinus schlecht
oder gar nicht verwertet, der Streptomyces rimosus aber gut (Tabelle II). Im Hinblick
auf die Stickstoffverwertung sind beide Organismen gleichartig (Tabelle III).
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Mikroskopisch ähnelt Streptomyces rimosus forma paromomycinus sehr
dem Streptomyces rimosus. Beide Organismen bilden dichte Haufen von Spiralen auf
Medien aus Glycerin-Asparagin, synthetischer Stärke, Calciummalat und Glukose-Trypton-Agar.
Auf Agar-Nährmedien bilden beide Organismen nur wenig Luftmycel, und unter dem Mikroskop
sind ihre Lufthyphen meist kurz und gerade mit nur gelegentlichen Spiralen. Bei
beiden Organismen bilden das Oberflächenwachstum und das Agar oft in Gebieten dichten
Wachstums bei verschiedenen Agarmedien Risse.
| Tabelle I |
| Vergleich der Färbung von Streptomyces rimosus forma paromomycinus
und Streptomvces rimosus NRRL 2234 |
| bei Entwicklung auf verschiedenen Agarmedien |
| Agarmedium Aussehen Streptomyces rimosus Streptomyces#rimosus |
| forma paromomycinus N RRL 2..34 |
| Substratmv cel Hellgelb bis Hellbraun Gelb bis Hellbraun |
| Glycerin-Asparagin ... .. Luftmycel Weiß Weiß |
| Substrat keine sehr Hellbraun |
| Substratmycel Hellbraun Hellbraun |
| Synthetische Stärke . . . . Luftmycel Weiß (etwas luftig) Weiß |
| Substrat keine keine |
| Substratmvcel Gelbbraun Gelbbraun |
| Calciummalat ......... Luftmycel- Weiß Weiß |
| Substrat keine sehr hellbraun |
| Substratmycel Hellgeib bis Orangebraun Hellgelb bis Braun |
| Nährmediun . . . . . . . . .. . Luftmycel (kein Luftmycel)
`Feiß (etwas luftig) |
| Substrat keine keine |
| Substratmycel Hellgelb bis Hellbraun Hellbraun bis Orangebraun |
| Glucose-Trypton ....... Luftmycel Weiß Weiß |
| Substrat sehr hellbraun Hellbraun |
| Tabelle Il |
| Vergleich der Kohlenstoffverwertung von Streptomyces rimosus
forma paromomycinus und Streptomyce s rimosus |
| NRRL 2234 |
| Kohlenstoffquellen'-"') Streptomyces rimosus Streptomyces rimosus |
| forma paromomycinus NRRL 2234 |
| Monosaccharide |
| Pentosen |
| 1-Arabinose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 bis -@- -+--<--+- '- |
| Rhamnose ............................................ 0 0 |
| d-Xylose ............................................. 0 bis
-+- 0 bis -1,- |
| Hexosen |
| Dextrose ............................................. ++++
-+--E--+--+- |
| d-Galaktose........................................... |
| Lävulose ............................................. ++++
+-, ++ |
| . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . ++++ ++++ |
| Disaccharide |
| Cellobiose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ++++ +++-+- |
| Laktose . . . . .. . . . .. . ... . . . . . . . .. . . .. .
. . . . .. . . . . . .. . . . . -+--+- bis ++++ +-f-++ |
| Maltose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -+--+--+--!- +-+--+--+- |
| Melibiose . . . .'. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . +++ -+--+- bis ++++ |
| Sucrose............................................... 0 0 |
| Trehalose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -f--+--+- +-+--+--E- |
| Trisaccharide |
| Melezitose ............................................ 0 0 |
| Raffinose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -+- bis +-+- -t- bis ---+- |
| Polysaccharide |
| Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -+--+--+--+-- +-+--+--+- |
| Inulin ................................................ 0 0 |
| Stärke ............................................... ....
.-r+. |
| Mehrwertige Alkohole |
| Adonit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -+- -@ -+-- -- -+--r -+- |
| Dulcit . . . .............................. . .............
0 0 |
| Glycerin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -+--+-+ +-+--+- |
| i-Inosit .... ................. ............ ..............
++-++ ++++ |
| d-Mannit ............................................. -+--E--+--+-
T-+---i--+- |
| d-Sorbit .............................................. +-+--,---^
+++-+- |
| Verschiedene |
| Aesculin ............................................. 0 0 |
| Salicin ............................................... 0 0 |
| Jede Kohlenstoff quelle wurde bei einer Konzentration von 1,0
Gewichtsprozent in dem synthetischen Agarmedium, das von |
| Pridham und Gottlieb, J. Bact., 56, 208 (1948], beschrieben
wurde, untersucht. |
Da der Streptomyces rimosus forma paromomycinus in morphologischer Hinsicht dem
Streptomyces rimosus NRRL 2234 sehr ähnelt, wird der Schluß gezogen, daß der Streptomyces
rimosus forma paromomycinus eine neue bestimmte Form des Streptomyces rimosus darstellt.
Eine Kultur des Streptomyces rimosus forma paromomycinus wird in der Kulturdauersammlung
des Parke, Davis & Co.-Kulturbüro, Detroit, Mich., unter der Nr. 04998 und in
der Kultursammlung der Fermentation Division, Northern Utilization Research Branch,
U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, unter der Nr. NRRL 2455 aufbewahrt.
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Die Herstellung von Paromomycin gemäß der Erfindung wird durchgeführt
durch Impfung eines sterilen wäßrigen Nährmediums mit Streptomyces rimosus forma
paromomycinus, Entwicklung des beimpften Mediums unter aseptischen aeroben Bedingungen
bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 35 °, Entfernung der Feststoffe aus dem
Kulturmedium und Isolierung des gewünschten Paromomycinus aus der wäßrigen Kulturflüssigkeit.
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Für die Beimpfung können Sporen oder Konidien von Streptomyces rimosus
forma paromomycinus verwendet werden. Es können auch wäßrige Suspensionen davon
verwendet werden, die etwas Seife oder ein anderes Netzmittel enthalten. Für große
Gärungen ist es vorzuziehen, kräftige junge Kulturen des Mikroorganismus zu verwenden.
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Geeignete wäßrige Nährmedien sind solche mit einem px-Wert zwischen
6 und 8,5, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und
Mineralstoffe enthalten. Als assimilierbare Kohlenstoffquelle können entweder reine
Kohlenhydrate oder die technisch zur Verfügung stehenden Kohlenhydratgemische verwendet
werden. Einige Beispiele von für diesen Zweck geeigneten Stoffen sind Glukose, d-Mannose,
d-Galaktose, Maissyrup, Stärke, lösliche Stärke, Malzflüssigkeiten, Melassen, hydrolysierte
Stärkesorten, Glycerin u. ä. Die in dem Nährmedium vorliegende Carbohydratmenge
ist nicht besonders kritisch und kann von etwa 0,5 bis 5 Gewichtsprozent des Gesamtgewichtes
des Mediums schwanken.
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Die Stickstoffquelle in dem Nährmedium kann organischer, anorganischer
oder gemischt organisch-anorganischer Natur sein. Einige Beispiele der zahlreichen,
in dem Nährmedium verwendbaren sickstoffhaltigen Stoffe sind
Aminosäuren,
Peptone, hydrolysierte Eiweißmassen, nicht hydrolysierte Eiweißmassen, Fischmehl,
Soyabohnenmehl, Maisschlempe, Fleischextrakte, Erdnußmehl, anorganische Nitrate,
Harnstoff, Ammoniumsalze u. dgl. Infolge Verunreinigungen der meisten der leicht
zugänglichen stickstoffhaltigen Stoffe kann die dem Nährmedium zuzusetzende Menge
etwas schwanken, entsprechend der Reinheit. Jedoch kann für praktische Zwecke gesagt
werden, daß die stickstoffhaltigen Stoffe nicht mehr als 6 Gewichtsprozent des Gesamtgewichtes
des Gärmediums zu betragen brauchen.
| Tabelle III |
| Vergleich der Stickstoffausnutzung von Streptomyces |
| rimosus forma paromomycinus und Streptomyces rimosus |
| N R RL 2234 |
| Streptomyces Streptomyces |
| Stickstoffquellen) rimosus rimosus |
| forma paro- NRRL 2234 |
| momycinus |
| Anorganische |
| Na-Nitrat ...... . ..... . . ++ ; 4- +-.'-+ |
| Ammoniumsulfat . . . . . . . . . ++++ ++++ |
| Ammoniak ............. + + ++ |
| Organische |
| dl-Alanin................ +++ + + + + |
| 1-Arginin .............. ++++ + + ++ |
| dl-Aspartinsäure ........ +=++ -I-+++ |
| 1-Cystin . . . . . . . . . . . . . . . ++ + '-+-- |
| 1-Cystein . .. ... . .... . . . . -++ + ++++ |
| 1-Glutaminsäure . . . . . . . . . ++ '-, + ++++ |
| Glycylglycin ......... ++++ -+++ |
| 1-Histidin .............. ++=+ ++- |
| 1-Oxyprolin . . . . . . . . . . . . . + |
| dl-Isoleucin . . . . . . . . . . . . . . ++ ++ |
| 1-Leucin .............. ++-@- -+++ |
| 1-Lysin . . . . . . . . . . . . . . . + -@--;--=- + + |
| dl-Methionin............. +-;- |
| 1-Phenylalanin .. . . . ... .. +++ |
| 1-Prolin ................ +: r - -+++ |
| dl-Serin . . . . . . ....... . . . . ++ ' + +-' - '-, |
| dl-Threonin ............ +-;-+-@- -++- |
| 1-Tryptophan ........... f-, |
| 1-Tyrosin .............. + + |
| dl-Norleucin ............. '-, + ++ |
| dl-Valin . . . . . . . . . . . . . . . -!--!-+=- -@-+ ++ |
| Harnstoff ............ +- '- |
| 'j Jede Stickstoffquelle wurde untersucht bei einer Konzentra- |
| tion von 0,01 Moläquivalent Stickstoff in dem synthetischen
Agar- |
| medium, äasvon Pri dham und Gottlieb, J. Bact., 56,108.-1948), |
| beschrieben wurde, mit der Abweichung, daß Ammoniumsulfat |
| fortgelassen und 1 Gewichtsprozent Dextrose zugesetzt waren. |
Eine gewisse Menge Mineralsalze sind notwendig, um beste Ausbeuten an Paromomycin
zu erhalten. Im allgemeinen enthalten viele Rohstoffe, wie Maisschlempe, Rückstände
der Butanol-Aceton-Gärung, Hefepräparate, Soyabohnenölkuchen usw., Mineralsalze
in ausreichender Menge. Um jedoch die Anwesenheit einer geeigneten Menge der Mineralbestandteile
des Mediums sicherzustellen, ist es gewöhnlich vorteilhaft, eine kleine Menge anorganischer
Salze, wie Natriumchlorid, Natriumbicarbonat, Calciumcarbonat, Natriumacetat u.
dgl., zuzusetzen. Die bevorzugte Konzentration der Mineralsalze liegt zwischen 0,1
und
10/, des Nährmediums.
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Die Entwicklung von Streptomyces rimosus forma paromomycinus in dem
w äßrigen Nährmedium kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Zum Beispiel
kann der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen auf der Oberfläche des Mediums
gezüchtet werden, oder er kann unterhalb der Oberfläche des Mediums, d. h. unter
submersen Bedingungen, entwickelt werden, wenn gleichzeitig Sauerstoff zugeführt
wird.
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Die bevorzugte Arbeitsweise zur Herstellung von Paromomycin in großem
Maßstab umfaßt die Anwendung von submersen oder Tiefenkulturen von Streptomyces
rimosus forma paromomycinus. Hierzu wird ein steriles wäßriges Nährmedium mit Streptomyces
rimosus forma paromomycinus beimpft und unter Rühren und Belüftung bei einer Temperatur
zwischen etwa 20 und 35°, vorzugsweise in der Nähe von 23 bis 30', bebrütet, bis
eine maximale Konzentration an Paromomycin in der Kulturflüssigkeit gebildet ist.
Die zur Erzeugung eines Maximums an Paromomy ein erforderliche Zeitdauer schwankt
mit der Größe und der Art der verwendeten Vorrichtung. Zum Beispiel ist in einer
großtechnischen Gärung, wie sie in Tankgärbehältern durchgeführt wird, eine Höchstproduktion
an Paromomycin in etwa 3 bis 6 Tagen erreicht. Eine Fermentation kann auf kürzere
Zeitdauer begrenzt werden, aber die Ausbeuten sind gewöhnlich schlechter. Eine längere
Fermentation scheint die in der Kulturflüssigkeit vorhandene Menge Paromomycin nicht
herabzusetzen. Bei Verwendung von Schüttelflaschen kann die Zeit bis zur Impfproduktion
etwas länger sein, als sie für großtechnische Gärbehälter erforderlich ist. Unter
submersen Kulturbedingungen entwickelt der Mikroorganismus mehr oder minder einzelne
Teilchen, die in dem Nährmedium verteilt sind, im Gegensatz zu den mehr oder weniger
zusammenhängenden Häutchen auf der Oberfläche des Mediums beim Oberflächenkulturverfahren.
Dank dieser Verteilung des Organismus durch das Medium können große Volumina des
beimpften Nährmediums gleichzeitig in großen Tanks und Behältern, wie sie üblicherweise
in der Gärindustrie verwendet werden, fermentiert werden. Ortsfeste Gärbehälter,
die mit geeigneten Rühr- und Belüftungseinrichtungen ausgerüstet sind, sowie auch
horizontale Drehtrommelgärbehälter sind besonders wertvoll in dieser Hinsicht. Jedoch
kann für die Herstellung kleinerer Mengen des Antibiotikums oder der Kulturen des
Mikroorganismus das submerse Kulturverfahren in kleinen Flaschen oder Ballons durchgeführt
werden, die entweder geschüttelt oder mit geeigneten mechanischen Mitteln gerührt
werden.
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Eine Bewegung und Belüftung des Kulturgemisches kann auf verschiedene
Weise erreicht werden. Die Bewegung kann vorgesehen sein durch Turbinen, Paddelrührer,
Schlagrührer oder andere mechanische Rühreinrichtungen, durch Umwälzen oder Schütteln
des Gärbehälters durch zahlreiche Pumpeinrichtungen oder durch Hindurchleitung von
Luft durch das 'Medium. Die Belüftung kann bewirkt werden durch Einblasen von Lutt
in das Gärgemisch durch offene Rohre, gelochte Rohre, poröse Diffusionsmedia, wie
Kohlestäbchen, Siliciumcarbid, gesintertes Glas u. dgl., oder es kann durch Versprühen,
Zerstäuben oder Verspritzen der Maische in oder durch eine sauerstoffhaltige Atmosphäre
erreicht werden.
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Das Oberflächenkulturverfahren zur Herstellung von Paromomycin umfaßt
das Beimpfen einer flachen Schicht, gewöhnlich weniger als 2 cm, aus einem sterilen
wasserhaltigen Medium mit Streptomyces rimosus forma paromomycinus und das Entwickeln
des Gemisches unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und
35'. Eine längere Entwicklungszeit, als sie beim Tiefenkulturverfahren angewendet
wird, ist gewöhnlich notwendig, um die Höchstproduktion von Paromomycin zu erzielen.
Im allgemeinen liegt die Fermentationszeit bei 10 bis 15 Tagen. Nachdem diese Phase
des Verfahrens beendet ist, wird das Mycel von der Flüssigkeit, die das Paromomycin
enthält, entfernt und
das Produkt aus der Kulturflüssigkeit nach
den später beschriebenen Verfahren isoliert.
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Nach Beendigung der Gärphase des Verfahrens wird das in dem Kulturgemisch
vorhandene feste Material mit geeigneten Mitteln, wie Filtration, Zentrifugierung
usw., entfernt, und das Paromomycin wird aus der restlichen Kulturflüssigkeit isoliert.
Die Isolierung wird zweckmäßig durch Ionenaustauschverfahren vorgenommen, vorzugsweise
durch Adsorption und Eluierung des Paromomycins unter Verwendung eines Kationenaustauschers
in Salzform. Das in dem Eluat enthaltene Paromomycin kann durch Einengung bis zur
Trockene isoliert werden oder, falls gewünscht, kann es vor der Isolierung weiter
durch erneute Adsorption und Eluierung gereinigt werden.
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Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung von Paromomycin aus dem Kulturgemisch
besteht darin, daß man die zurückbleibende Kulturflüssigkeit einer Adsorption und
Eluierung aus einem Kationenaustauscherharz in der Salzform unterwirft, das Eluat
einengt, das eingeengte Eluat an Aktivkohle adsorbiert, das Paromomycin aus der
Kohle extrahiert und das freie Paromomycin oder seine Additionssalze mit Mineralsäuren
aus dem Extrakt gewinnt. Nach diesen Verfahren wird die Kulturflüssigkeit, die man
durch Entfernung der Feststoffe aus dem Gärkulturgemisch erhält, auf einen pH-Wert
von etwa 6,8 bis 7,5 eingestellt und dann durch eine Adsorptionssäule mit einem
Carbonsäureharz in Form eines Salzes, z. B. des Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalzes,
geleitet. Das Harz mit dem adsorbierten Paromomycin wird mit Wasser gewaschen und
dann mit verdünnter wäßriger Mineralsäure, z. B. Salzsäure, oder einer Base, z.
B. Ammoniumhydroxyd, eluiert. Das Eluat wird eingeengt, und Aktivkohle wird mit
dem Konzentrat vermischt. Die das adsorbierte Paromomycin enthaltende Kohle wird
von dem Gemisch abgetrennt, und das Paromomycin wird dann aus der Kohle mit einem
geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. einem wäßrigen oder wasserfreien niederen
aliphatischen Alkohol oder Keton, herausgelöst. Das Paromomycin kann aus dem Extrakt
durch Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum oder durch Fällung als unlösliches
Säureadditionssalz isoliert werden.
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In einigen Fällen ist es im Anschluß an die Eluierung des Paromomycins
aus dem Kationenaustauscher wünschensivert, insbesondere wenn wesentliche Mengen
Mineralsalze vorhanden sind, den pH-Wert des Eluats durch Zugabe einer Base vor
der Adsorption an Aktivkohle zu erhöhen. In diesen Fällen wird das Eluat auf einen
pH-Wert von etwa 9 bis 9,7 eingestellt, dann wird Aktivkohle mit dem Eluat vermischt,
die Aktivkohle mit dem adsorbierten Paromomycin vom Gemisch abgetrennt, mit Wasser
gewaschen und das Paromomycin dann mit verdünnter Mineralsäure ausgezogen. Das in
dem an= fallenden Eluat enthaltene Paromomycin wird isoliert, indem man das Eluat
zweckmäßig durch einen Austauschermit einem Anionenharz in der Hydroxylform leitet,
das Perkolat auffängt und neutralisiert und das neutrale Perkolat weiter durch Austausch
mit einem Kationenaustauscherharz verarbeitet, dieses mit Ammoniumhydroxyd eluiert
und das Eluat lyophylisiert.
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Nach einem anderen bevorzugten Verfahren zur Eluierung des Paromomycins
wird die Gärkulturflüssigkeit in der oben beschriebenen Weise adsorbiert und eluiert
unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, der pH-Wert des anfallenden Eluats,
falls notwendig, auf etwa 4,5 bis 7 eingestellt und das Eluat durch eine Säule mit
einem Gemisch von etwa gleichen Mengen Aktivkohle und Diatomeenerde geleitet. Das
in der Säure zurückgehaltene Paromomycin wird zweckmäßig durch Waschen mit Wasser
eluiert. Weitere nach dem Waschen mit Wasser in der Säule zurückbleibende Mengen
an Paromomycin können durch weiteres Auswaschen mit verdünnten wäßrigen organischen
Lösungsmitteln oder verdünnter wäßriger Mineralsäure gewonnen werden. Paromomycin
kann aus den Waschwässern gewonnen werden, indem man das Lösungsmittel im Vakuum
entfernt oder das Paromomycin als unlösliches ylineralsäureadditionssalz ausfällt.
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Paromomycin ist durch Hydrolyse mit Mineralsäure, z. B. Salzsäure,
abbaubar zu einem kristallinen Salz mit der Elementaranalyse von etwa 32 bis 33
°/o Kohlenstoff, 70/, Wasserstoff, 9 bis 100/, Stickstoff und 23 bis
240/, Chlor. Die Produkte einer solchen Mineralsäurehydrolyse sind ohne merkliche
antibakterielle Wirksamkeit. Insbesondere ist das in der nachstehenden Weise erhaltene
Hydrolyseprodukt unwirksam gegen B.subtilis: Eine Lösung aus 2,81g Paromomycin-Hydrochlorid
in 280 ccm wasserfreiem Methanol wird 21/2 Stunden mit 60 ccm 1,8 n-Methanol-Salzsäure
unter Rückfluß erhitzt, wobei sich eine kristalline Fällung ausscheidet. Nach dem
Abkühlen über Nacht wird die aus dem Salzsäuresalz der Hydrolyse bestehende Fällung
abfiltriert und durch Umkristallisation aus wäßrigem Äthanol gereinigt. Die freie
Base, die dem Salzsäuresalz des Hydrolyseproduktes entspricht, hat wahrscheinlich
die empirische Formel C12 H25 0 7-'T3 und enthält nach der Elementaranalyse etwa
44 bis 45 %
Kohlenstoff, 80/, Wasserstoff und 130/, Stickstoff.
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Paromomycin ist bakteriostatisch hoch wirksam gegen eine Vielzahl
von pathogenen Organismen. Insbesondere ist Paromomycin voll wirksam in vitro gegen
Staphylococcusstämme, die gegen Oxytetracyclin, Erythromycin und Carbomycin resistent
sind.
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Die Tabelle IV erläutert das antibakterielle Spektrum von Paromomycin,
verwendet als Sulfat in vitro.
| Tabelle IV |
| Antibakterielles Spektrum von Paromomycin-Sulfat*) |
| Mindestliemm- |
| konzentration |
| Kultur von Paromomycin- |
| Sulfat'v'#' @ |
| g/ccm |
| Clostridium perfringens . . . . . . . . . . . . 100,0 |
| Corynebacterium diphtheriae ....... 0,39 |
| Diplococcus pneumoniae . . . . . . . . . . . 100,0 |
| Micrococcus pyogenes var. aureus... 0,78 |
| Streptococcus pyogenes ........... 25,0 |
| Streptococcus salivarius ........... 50,0 |
| Aerobacter aerogenes ............. 6,25 |
| Brucella suis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,13 |
| Escherichia coli .................. 12,5 |
| - Klebsiella pneumoniae ............ 1,56 |
| Neisseria catarrhalis .............. 0,78 |
| Pasteurella multocida ............. 6,25 |
| Proteus vulgaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,13 |
| Pseudomonas aeruginosa .......... 50,0 |
| Salmonella paratyphi ............. 1,56 |
| Salmonella schottmuelleri . . . . . . . . . . 12,5 |
| Salmonella typhosa ............... 6,25 |
| Shigella dysenteriae . .......... .... 12,5 |
| Shigella paradysenteriae ........... 12,5 |
| Shigella sonnei ................... 12,5 |
| Vibrio comma . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . 25,0 |
| Mycobacterium phlei .............. 0,19 |
| Mycobacterium tuberculosis v ar. |
| hominis........................ 0,19 |
| Bestimmt in doppelten Serien Verdünnungsversuche mit |
| Fleischbrühe. |
| *T) Geschätzte Reinheit 60 bis 70°/0. |
Paromomvcin ist ein wirksames Mittel für die Verhütung von Potentialinfektionen
durch pathogene Mikroorganismen. Paromomycin besitzt bemerkenswerte Antiparasiteneigenschaften
und ist besonders wertvoll zur Bekämpfung von Endomoebahistolytica, die die Amoebiasis
hervorruft. Paromomycin ist auch wertvoll für die Behandlung von lokalen Oberflächeninfektionen,
die durch verschiedene pathogene Mikroorganismen hervorgerufen werden, und ist besonders
anv#endbar bei der Behandlung der Infektion, die hervorgerufen wird durch Staphylococcusstämme,
die resistent sind gegenüber zahlreichen gewöhnlich angewendeten Antibioticis, z.
B. Oxytetracyclin, Erythromy cin, Carbomycin u. dgl. Für diese Anwendung kann das
Paromomycin als freie Base oder als Mineralsäure eines Additionssalzes, z. B. die
freie Base oder das Vineralsäureadditionssalz, wie das Hydrochlorid, Sulfat usw.,
angewendet werden. Es kann in zahlreichen geeigneten Zubereitungen, z. B. als Pulver
mit einem inerten Streckmittel, wie Talk, Stärke usw., als Salbe mit einer inerten
Salbengrundlage und kleineren Mengen Paromomycin oder als verdünnte Lösung in Wasser,
gegebenenfalls mit einem verträglichen oberflächenaktiven Mittel, angewendet werden.
In diesen Formen kann das Paromomycin zweckmäßig mit einer Konzentration von etwa
5 mg/ccm in den Lösungen und von etwa 5 mgg bei den Pulvern und Salben angewendet
werden. Paromomy cin hat den Vorteil, daß es relativ ungiftig und unter den schwankenden
Verwendungsbedingungen beständig ist. Bei seiner Verwendung als Bakteriostatikum
wird das Paromomycin direkt der Infektionsstelle zugeführt; eine weitere Zuführung
kann, falls erforderlich, periodisch erfolgen. Auch kann das Paromomycin in Kombination
mit anderen bakteriostatischen Mitteln verwendet werden.
-
Um die technische Bereicherung durch das vorliegende Verfahren des
weiteren darzutun, seien noch folgende Vergleichsversuche mitgeteilt, die die Wirkung
des Paromomy cins mit der des Terramycins gegenüber einer Reihe von pathogenen Mikroorganismen
vergleichen. 1. In vitro
| Pathogener ivEndesthemmkonzentration |
| Mikroorganismus Y%ccm |
| Paromomycin Terramycin |
| Proteus vulgaris ...... 3,13 größer als 1000 |
| Endamoeba histolytica 1,25 bis 5,0 133 |
| E. coli . . . . . . . . . . . . . . 3,1 ' größer als 100 |
| Paracolobactrum sp.. . . 5,0 größer als 100 |
2. In-vivo-Versuche a) Es wurden Mäuse mit Pseudomonas aeruginosa infiziert und
teils gar nicht, teils mit Paromomycin und teils mit Terramycin behandelt. 60°/o
der mit Paromomycin behandelten Mäuse überlebten bei einer Zugabe des Antibiotikums
in einer Menge von 500 mg/kg bei 2tägiger Behandlung den Versuch. Keine der Kontrollmäuse
und der mit Terramycin behandelten Mäuse überlebte den Versuch.
-
b) Ähnliche Versuche wurden an mit Staphylococcen infizierten Mäusen
durchgeführt. Dosierung: 2,5 mg je kg und Tag. Es überlebten 95 °,l, der mit Paromomycin
behandelten Mäuse den Versuch. Bei einer Dosierung von 5 mg je kg und Tag überlebten
alle mit Paromomycin behandelten Mäuse den Versuch. Auf der anderen Seite überlebten
bei Behandlung mit Terramycin bei einer Dosierung von 12,5 mg je kg und Tag nur
5 °a der Mäuse und bei einer Dosierung von 25 mg je kg und "Tag nur 200,!, der Mäuse
den Versuch. c) Bei Behandlung von mit Klebsiena pneumoniae infizierten Mäusen waren
die Mäuse bei einer einzigen Injektion von 25 mg!kg geschützt, und es wurde eine
vollständige Sterilisierung des Blutstroms erzielt. Beim Vergleich mit einer mit
Terramycin behandelten Maus starb diese, und selbst bei einer Dosierung von 200
mg/kg war keine Sterilisierung des Blutes erzielbar.
-
d) Bei Versuchen an Hunden gegenüber E. histolytica ergaben Dosierungen
von 6,25 bis 25 mg je kg und Tag Paromomycin eine vollständige Heilung, während
eine Dosierung von 25 mg je kg und Tag Terramycin ohne Einwirkung auf die Infektion
war.
-
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert Beispiel
1 12 1 Nährmedium mit der folgenden Zusammensetzung:
| 0f |
| Glucose-Monohydrat ................. 0,5 |
| Glycerin ............................ 0,5 |
| Säurehydrolysiertes Casein . . . . . . . . . . . . 0,3 |
| Pepton ............................. 0,25 |
| Brauereihefe ........................ 0,1 |
| Maisschlempenfeststoffe .............. 0,25 |
| Soyabohnenölkuchen ................. 0,25 |
| Rückstand der Aceton-Butanol-Gärung 0,25 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,5 |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 |
| Wasser . . . . . . . . . . . . . zum Auffüllen auf 100,0 |
wird in einen 30-1-Gärbehälter aus rostfreiem Stahl eingebracht, der mit Anschlußstücken,
mit Sprühverteiler, Schlagrührer, Prallblechen und Probeleitungen ausgerüstet war.
Das Medium wird durch 2stündiges Erhitzen auf 121' sterilisiert, dann abgekühlt
und mit 20 ccm einer Sporensuspension aus zwei Moyers Sporen-Agar-Strichkulturen
von Streptomyces rimosus forma paromomycinus in steriler 0,1 °oiger Natriumheptadecylsulfatlösung
beimpft. Das beimpfte Kulturgemisch wird 60 Stunden bei 26' entwickelt, während
welcher Zeit das Gemisch mit 200 Limin gerührt und sterile Luft in das Medium durch
den Sprühverteiler mit einer Geschwindigkeit von 121'min eingeleitet wurde. Ein
Teil des anfallenden entwickelten Kulturgemisches wird für die Beimpfung von 161
Nährmedium mit folgender Zusammensetzung verwendet.-
| ' r |
| Glukose-Monohydrat ................. 1,0 |
| Soyabohnenölkuchen ................. 1,0 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,5 |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 |
| Ammoniumchlorid ................... 0,167 |
| Mit Salzlösung ausgezogener |
| Schu#einemagenrückstand . . . . . . . . .. . 0,5 |
| Wasser . . . . . . . . . . . zum Auffüllen auf 100,0 |
Der pn-Wert dieses Nährmediums wird mit 10 n-Natronlauge auf 7,5 eingestellt und
das Nährmedium in einen 30-1-Nährbehälter aus Glas eingebracht, der mit Verteilerrohr,
Schlagrührer, Prallplatten und Probeleitung ausgestattet ist. Das Medium wird durch
2stündiges Erhitzen auf 121- sterilisiert, abkühlen gelassen und mit 800 ccm des,
wie oben beschrieben, erhaltenen Kulturgemisches beimpft. Das anfallende Kulturgemisch
wird 9.1 Stunden bei 26- entwickelt, während welcher Zeit das Gemisch mit 200 t-
min gerührt wird und sterile Luft in das Medium durch das Verteilerrohr mit einer
Geschwindigkeit von 161 min eingeleitet wird. Während der Entwicklung wird ein Schäumen,
falls notwendig, durch Zugabe von rohem Schmalz und 'Mineralölen mit
Mono-
und Diglyceriden verhindert. Am Ende der Entwicklung wird das Gärkulturgemisch mit
konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt, die vorhandenen festen
Stoffe abfiltriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Die Waschwässer werden
mit dem Hauptfiltrat vereinigt, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und 15,51
der filtrierten Kulturflüssigkeit in eine Austauschersäule (3,75 cm innerer Durchmesser),
die mit 380 ccm Carbonsäureharz gefüllt ist, eingeführt, die vorher nacheinander
mit 21 wäßriger Lösung mit 37,5 g Natriumhydroxyd und mit 21 Wasser gewaschen war.
Die Säule mit dem Paromomycin wird mit 2 Volumina Wasser gewaschen und mit 0,5n-Salzsäure
eluiert. Die ersten 19,41 Perkolat enthalten wenig oder kein Paromomycin und schwanken
im pH-Wert von 6 bis 7,3. Wenn der pH-Wert des Eluats unter 6,0 zu fallen beginnt,
werden 21 Eluat aufgefangen. Die 21 Eluat, die, wie oben angegeben, aufgefangen
wurden, werden bis zum pH-Wert 6 mit 10 n-Natronlauge neutralisiert und filtriert.
Das Filtrat wird durch Eindampfen im Vakuum bis auf etwa 1 1 eingeengt.
-
Eine Adsorptionssäule wird hergestellt, indem man ein breiartiges
Gemisch aus 65g mit Säure gewaschener Aktivkohle und 50 g Diatomeenerde in eine
3,75-cm-Säule gießt und 300 cm3 des eingeengten Filtrates zugibt. Die Säule wird
mit 400 cm3 Wasser gewaschen und nacheinander mit 325 ccm Wasser, 425 cm-3 1%igem
wäßrigem Aceton und 400 cm3 100;'0igem wäßrigem Aceton eluiert. Die Wasser- und
Acetoneluate werden eingeengt und lyophilisiert unter Gewinnung von Paromomycin-Hydrochlorid
als Pulver. Das Produkt wird gereinigt, indem man das Pulver in Methanol aufnimmt,
zur Lösung einen großen Überschuß Aceton zugibt und die sich abscheidende Fällung
durch Filtrieren gewinnt. Das Produkt Paromomycin-Hydrochlorid besitzt eine optische
Drehung a]D = r 56,5° (1% in Wasser).
-
Um Paromomycin als freie Base zu gewinnen, löst man das Hydrochlorid
in Wasser als 3 %ige Lösung, gießt die Lösung in eine Adsorptionssäule mit einem
Anionaustauscherharz in der Hydroxylform und wäscht die Säule mit etwas Wasser.
Der wäßrige Ablauf wird durch Lyophilisieren bis zur Trockene konzentriert und das
erhaltene feste Produkt gereinigt, indem man es in siedendem absolutem Äthanol aufnimmt,
abkühlt und das feste Produkt Paromomycin gewinnt. [a]ö = 64° (1% in Wasser). Beispiel
2 Für die Herstellung eines frischen Impfproduktes für die Herstellung von Paromomycin
in der nachstehend beschriebenen Weise wird Nährmedium mit der folgenden Zusammensetzung
: ",
| Glucose-Monohydrat ................. 1,0 |
| Soyabohnenölkuchen ................. 1,0 |
| Mit Salzlösung ausgezogener Schweine- |
| magenrückstand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 |
| Ammoniumchlorid ....... ... ....... .. 0,167 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,5 |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 |
| Wasser . . . . . . . . . . . zum Auffüllen auf 100,0 |
in einem Nährbehälter aus rostfreiem Stahl eingebracht, und der pH-Wert wird mit
6 n-Natronlauge auf
7,5 eingestellt. Das Medium wird durch 1stündiges Erhitzen
auf 121° sterilisiert, dann abgekühlt und mit 40 cm' Sporensuspension von streptomyces
rimosus forma paromomycinus in 0,1%iger steriler Natriumheptadecylsulfatlösung,
die in gleicher Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, beimpft.
Das Kulturgemisch wird dann 64 Stunden bei 26° entwickelt, während welcher Zeit
sterile Luft durch einen Verteiler zugeführt wurde. Während der Fermentation wurde
ein steriles Gemisch aus rohem Schmalz und Mineralölen, das Mono- und Diglyceride
enthielt, zur Bekämpfung der Schaumbildung zugegeben.
-
Das so erhaltene Kulturgemisch wird verwendet, um die nachstehend
bereitete Hauptkultur zu impfen. Medium mit der Zusammensetzung
| Glucose-Monohydrat ................. 1,0 |
| Soyabohnenölkuchen ................. 1,0 |
| Mit Salzlösung extrahierter Schweine- |
| magenrückstand ................... 0,5 |
| Ammoniumchlorid ................... 0,167 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,5 |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 |
| Wasser . . . . . . . . . . . . zum Auffüllen auf 100,0 |
wird hergestellt in einem Nährbehälter aus rostfreiem Stahl, und der PH-'VVert wird
mit 6 n-Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Das Medium wird durch 1stündiges Erhitzen
auf 121' sterilisiert und abkühlen gelassen. Das sterile Medium wird mit der oben
beschriebenen Kultur beimpft und 72 Stunden bei 26° entwickelt, während welcher
Zeit durch einen Verteiler sterile Luft zugeleitet wurde und das Kulturgemisch mit
einem sich mit einer Geschwindigkeit von 230 U/min drehenden Schlagrührer gerührt
wurde. Um ein übermäßiges Schäumen während der Entwicklung zu verhindern, wurden,
wenn erforderlich,
8,11
steriles Gemisch aus rohem Schmalz und Mineralölen
zugegeben.
-
Am Ende der Entwicklung wird das Kulturgemisch mit konzentrierter
Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt, filtriert und der Filterkuchen mit
Wasser gewaschen. Die kombinierten Filtrate und Waschwässer «erden neutralisiert
und auf eine Adsorptionssäule aufgegeben, die mit 131 Carbonsäureharz gefüllt war,
das vorher durch Perkolieren mit einer Lösung von 1,265 g Natriumhydroxyd in 601
Wasser neutralisiert war. Die Säule mit dem Paromomycin wird mit etwa 401 Wasser
gewaschen und mit 0,5 n-Salzsäure ausgezogen. Wenn der p1,-Wert des Ablaufs aus
der Kolonne unter 6 sinkt, werden 88,5 1 Eluat aufgefangen, mit 6 n-Natronlauge
neutralisiert und durch Eindampfen im Vakuum auf etwa 1!l0 Volumen eingeengt. 1r,31
des konzentrierten Eluats wird auf eine Adsorptionssäule, ein Rohr mit einem Fassungsvermögen
von etwa 360 cm', aufgegeben, die mit einem wäßrigen Brei aus 80 g Aktivkohle und
60 g Diatomeenerde gefüllt war. Das in der Säule enthaltene Paromomycin-Hydrochlorid
wird durch Eluieren mit 11:.'21 Wasser gewonnen. Das Eluat wird konzentriert, ausgefroren
und in gefrorenem Zustand unter hohem Vakuum getrocknet. Das erhaltene feste Produkt
Paromomycin-Hydrochlorid stellt eine 64%ige Ausbeute der ursprünglich im fertigen
Gärkulturgemisch vorhandenen Paromomycinaktivität dar.
-
Um das Paromomycin-Hydrochlorid in das entsprechende Sulfat umzuwandeln,
löst man 1 g Paromomycin-Hydrochlorid in 25 cm-' Wasser und gibt 4,5 cm3 molarer
wäßriger Schwefelsäure zur Lösung. Die entstehende Fällung wird abfiltriert und
der Filterkuchen mit Methanol gewaschen und getrocknet. Das entstehende Produkt
Paromomycin-Sulfat in einer Chlorionen enthaltenden Form wird in Wasser gelöst,
und der pli Wert der Lösung wird auf 6,0 eingestellt durch Vermischen mit einer
ausreichenden Menge Anionenaustauscherharz in der Hydroxylform. Das Harz wird abfiltriert,
und das Filtrat wird durch Lyophilisieren konzentriert. Das zurückbleibende Harz
wird in eine weiße feste Masse durch Digerieren mit Aceton umgewandelt. Das feste
Produkt wird durch Filtrieren isoliert, mit Aceton gewaschen
und
getrocknet. Das Produkt Paromomycin-Sulfat besitzt eine optische Drehung -La]' von
50,5-D (1,50,1, in Wasser).
-
Beispiel 3 Für die Herstellung eines frischen Impfmittels für die
hernach beschriebene Herstellung von Paromomycin in großem Maßstab werden 121 Nährmedium
mit folgender Zusammensetzung
| ` "/o |
| Glucose-Monohydrat ................. 2,0 |
| Soyabohnenölkuchen ................. 1,0 |
| Mit Salzlösung ausgezogener Schweine- |
| magenrückstand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 |
| Ammoniumchlorid ................... 0,167 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,5 |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 |
| Wasser . . . . . . . . . . . . zum Auffüllen auf 100,0 |
in einen 30-1-Gär-Rührbehälter eingebracht, und der pH-Wert wird mit 6 n-Natronlauge
auf 7,5 eingestellt. Das ;Medium wird durch 2stündiges Erhitzen auf 121 ° sterilisiert.
Man läßt das Medium abkühlen und impft mit 20 cm3 Sporensuspension von streptomyces
rimosus forma paromomycinus in 0,1°joiger steriler Natriumheptadecylsulfatlösung,
die, wie im Beispiel l beschrieben, hergestellt wurde. Das Kulturgemisch wird 71
Stunden bei 26° entwickelt, während sterile Luft durch einen Verteiler mit einer
Geschwindigkeit von 121 je Minute eingeleitet und das Gemisch mit Hilfe eines Schlagrührers
mit einer Geschwindigkeit von 200 U/min gerührt wurde.
-
Die so erhaltene entwickelte Kultur wird zum Impfen der wie nachstehend
hergestellten Hauptkultur verwendet. Medium mit der Zusammensetzung
| °/o |
| Glucose-Monohydrat ................. 2,0 |
| Sojabohnenölkuchen.................. 1,0 |
| :Mit Salzlösung ausgezogener Schweine- |
| magenrückstand ................... 0,5 |
| Ammoniumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,16/ |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,5 |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 |
| Wasser . . . . . . . . . . . . zum Auffüllen auf 100,0 |
wird in einen 30-1-Gärbehälter aus rostfreiem Stahl gegeben und durch 1stündiges
Erhitzen auf 121° sterilisiert. Man läßt das Medium abkühlen und imptt dann mit
100 cm3 des frischen, wie oben angegeben, hergestellten Impfmittels. Das geimpfte
Medium wird 24 Stunden bei 26° entwickelt, während sterile Luft durch einen Verteiler
zugeleitet wird.
-
11251 Nährmedium mit der gleichen Zusammensetzung, wie oben beschrieben,
werden hergestellt und in einen 1890-1-Nährbehälter aus rostfreiem Stahl eingebracht,
und das Medium wird durch 1stündiges Erhitzen auf 121' sterilisiert. Das sterile
Medium läßt man abkühlen und impft es mit 38 1 Kulturgemisch aus der vorhergehenden
Gärung. Das beimpfte Medium wird 23 Stunden bei 26° entwickelt, während durch einen
Verteiler Luft zugeführt und das Medium mit einem Schlagrührer mit einer Geschwindigkeit
von 84 U/min gerührt wird. Während der Fermentation werden, um ein übermäßiges Schäumen
zu vermeiden, 3,91 steriles Gemisch aus rohem Schmalz und Mineralölen mit Mono-
und Diglyceriden nach Bedarf zugesetzt.
-
35401 Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie oben wurden angesetzt
und in einen 7570-1-Gärbell:ilter aus rostfreiem Stahl eingebracht. Das Medium wird
durch 1stündiges Erhitzen auf 121- sterilisiert und abkühlen gelassen. Das sterile
Medium wird mit 7501 der oben beschriebenen Kulturmischung beimpft und 49 Stunden
bei 26° entwickelt. Während der Entwicklung wird Luft zugeführt, und das Medium
wird mit einem Schlagrührer von 125 U/min gerührt. Das Kulturgemisch (77601 mit
Paromomycin in einer Konzentration von angenähert 2,2 mg,;cm3) wird filtriert, der
Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen, und die vereinigten Filtrate und Waschwässer
werden auf einen p.-Wert von 7,2 eingestellt. Die Kulturflüssigkeit und Waschwässer
usw. werden auf eine 45-cm-.@dsorptionssäule aufgegeben, die mit 1841 Carbonsäureharz
gefüllt und das Harz durch Perkolieren mit 7761 0,6 n-Natronlauge neutralisiert
wurde. Die Kolonne wird dann mit etwa 12301 Wasser gewaschen und mit 21201 0,5 n-Salzsäure
und dann mit 79510,6 u-Salzsäure gewaschen, wobei nach jedem Eluieren mit
Säure eine Waschung stattfand, «-as ein Gesamteluatvolumen von 37541 ergab.
-
Die vereinigten Eluate der verschiedenen Versuche wurden mit 6 n-Natronlauge
auf einen pii-Wert von 9,5 eingestellt. Es wurde dann Aktivkohle mit einer Geschwindigkeit
von 1,5 Gewichtsprozent je Volumen und Diatomeenerde mit einer Geschwindigkeit von
1 Gewichtsprozent je Volumen zugefügt und das Gemisch 1/3 Stunde gerührt. Das Gemisch
wurde in einer Filtrierpresse filtriert und mit Wasser gewaschen. Das Paromomvcin
wird mit 0,5 n-Schwefelsäure und 0,1 n-Schwefelsäure eluiert. Die Schwefelsäureeluate
werden vereinigt und über Anionaustauscherliarz in der Hydroxvlform geleitet. Der
pn-Wert des Eluats wurde periodisch bestimmt und, wenn er unter pii 9 absinkt, das
Harz regeneriert. Das Perkolat enthält die freie Base Paromomvcin.
-
646 cm3 des konzentrierten Perkolats mit 1,3 bis 1,5 g Paromomvcin
werden mit 1 n-Schwefelsäure auf einen pii-Wert von 7,3 eingestellt und durch 5
cm3 Carbonsäureharz in der Ammoniumform geleitet. Das Harz wird mit Wasser gewaschen
und das Wasser mit geringer Wirksamkeit verworfen. Das Paromomycin wird dann mit
1 n-Ainmoniak eluiert, und das Eluat wird durch Ausfrieren getrocknet. Die Ausbeute
des Paromomycins beträgt 1,125 g.