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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von multipotenten
Stammzellen aus Zahngewebe, bei dem die Stammzellen aus einem Gewebeverbund
gewonnen und anschließend
kultiviert werden. Die Erfindung betrifft ferner mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
isolierte Stammzellen sowie Knochenzellen und neuronale Zellen,
die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
hergestellt wurden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur
Herstellung einer Bank von Stammzellen, bei dem die Zellen mittels
des erfindungsgemäßen Verfahrens
gelagert werden.
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Als
Stammzellen bezeichnet man Körperzellen,
die nicht differenziert sind, d. h. Stammzellen sind noch nicht
für eine
Aufgabe im Organismus spezialisiert, beispielsweise als Haut- oder
Leberzelle. Aus Stammzellen können
durch Teilung weitere Stammzellen entstehen und/oder ausdifferenzierte Zellen
hervorgehen, d. h. Stammzellen sind in der Lage sich asymmetrisch
zu teilen. Eine Stammzelle behält
ihre Teilungsfähigkeit
dabei über
einen sehr langen Zeitraum, oft sogar während des gesamten Lebens des
Organismus. Ausgelöst
durch spezifische Signale während
der Entwicklung des Organismus kann eine Stammzelle in unterschiedliche
Zelltypen differenzieren, die dann den Organismus bilden. Man unterscheidet
im Allgemeinen zwischen embryonalen und adulten Stammzellen.
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Embryonale
Stammzellen (ES-Zellen), aus denen ein Embryo bis zum 8-Zell-Stadium besteht, werden
als totipotent bezeichnet. Aus diesen Zellen entwickeln sich später sämtliche
Zellformen des entstehenden Organismus. Embryonale Stammzellen aus
den Blastozysten-Stadien bezeichnet man als pluripotent, da sich
aus ihnen in der Regel noch sämtliche
Arten von Körperzellen
der Hauptgewebetypen Endoderm (Wandzellen des Verdauungstraktes),
Meso derm (Muskeln, Knochen, Blutzellen) und Ektoderm (Hautzellen
und Nervengewebe) differenzieren können. Aus ethischen Gründen und
aufgrund von Problemen mit der molekularen Kontrolle der Zelldifferenzierung
sind ES-Zellen aber bisher therapeutisch nicht anwendbar.
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Adulte
Stammzellen (AS-Zellen) dagegen entstehen nach dem embryonalen Stadium,
sind also undifferenzierte Zellen, die in einem differenzierten Gewebe
angesiedelt sind und aus denen spezialisierte Zellen hervorgehen,
die denen des differenzierten Gewebes entsprechen. ES-Zellen können aber
auch in Zelltypen differenzieren, die einem anderen Gewebe zuzuordnen
sind. Adulte Stammzellen, die in Organen, im Knochenmark oder auch
in der Nabelschnur zu finden sind, können sich aber nicht mehr so
frei differenzieren wie embryonale Stammzellen. Obwohl adulte Stammzellen
nicht das gleiche Differenzierungspotential wie embryonale Stammzellen
besitzen, haben sie dennoch keimblattüberschreitendes Differenzierungspotential.
Man bezeichnet sie daher als multipotent. So können sich zum Beispiel mesenchymale
Stammzellen auch zu neuronalen Zellen differenzieren, welche sich
sonst aus ektodermalem Gewebe entwickeln. AS-Zellen sind also in
der Lage, nach Übersiedlung
in einen anderen Gewebetyp in einen Zelltyp zu differenzieren, der
nicht dem ihres Stammgewebes entspricht. Adulte Stammzellen sind
in jedem Individuum verfügbar, beispielsweise
im Knochenmark. Die Entnahme von Knochenmark ist aber eine komplizierte
und riskante Operationstechnik. Die Gewinnung von Stammzellen aus
Zahngewebe ist im Gegensatz hierzu eine weniger aufwendige Alternative,
wie für
AS-Zellen aus Zahnfollikel in der
WO 03/066840 A2 beschrieben. Solche Stammzellen
aus leicht zugänglichem
Gewebe eröffnen
beispielsweise die Perspektive des Gewebeersatzes durch körpereigene
Zellen. Auch scheint die Neigung zur malignen Entartung bei Implantation
adulter Stammzellen kleiner zu sein als bei embryonalen Stammzellen.
Adulte Stammzellen sind also für
die Entwicklung innovativer therapeutischer Ansätze von steigender Bedeutung.
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Unter
Kryokonservierung versteht am das Einfrieren und Lagern von biologischem
Material, wie beispielsweise lebenden Zellen oder Geweben, in oder über flüssigem Stickstoff,
d. h. bei Temperaturen unter –130 °C. Flüssiger Stickstoff
hat eine Temperatur von –196 °C und geht
bei höheren
Temperaturen unter Normaldruck in den gasförmigen Aggregatzustand über. Durch
das Einfrieren bei solch niedrigen Temperaturen kommt es zu einem
Stillstand der wesentlichen biologischen Funktionen der Zellen,
so dass eine langfristige Lagerung ohne bzw. bei nur geringer Schädigung des
Materials möglich
ist. Dabei werden spezielle Kryokonservierungsverfahren eingesetzt,
bei denen die Zellen in einem zellmembranschützenden Medium (Kryoprotektivum)
aufgenommen und unter Anwendung spezifischer Temperaturprogramme
computergesteuert eingefroren werden. Die Kryokonservierung findet
häufig
in der Kinderwunschbehandlung Anwendung, indem Spermien oder befruchtete
Eizellen eingefroren und gelagert werden. Aber auch Stammzellen
lassen sich durch Kryokonservierung lagern.
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Die
bekannten Verfahren der Kryokonservierung von ganzen Zähnen haben
aber den Nachteil, dass Zelltod und drastische Zellverluste im Gewebe auftreten
und damit die Vitalitätsrate
der Zellen nach dem Auftauen nur sehr gering ist.
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Aus
der
WO 2005/052140
A2 ist beispielsweise ein Verfahren zur Kryokonservierung
von Zahngewebe bekannt, aus dem nach dem Auftauen Stammzellen isoliert
werden können.
Dabei wird der Zahnhalteapparat (= Periodontalligament) als zu konservierendes
Teilgewebe eines Zahns unkritisch, d.h. ohne kontrolliertes Vorgehen,
eingefroren und aufgetaut. Als Kryoprotektivum wird Serum mit 1
bis 20% Dimethylsulfoxyd (DMSO) vorgeschlagen. Das Gewebe wird in
das Kryoprotektivum aufgenommen und blitzartig in flüssigem Stickstoff
eingefroren. Das so eingefrorene und gelagerte Gewebe wird anschließend bei
35-39 °C
wieder aufgetaut. Allerdings führt dieses
bekannte Verfahren in dem Gewebe zu einem hohen Zellverlust und
die wenigen isolierbaren Zellen weisen zudem eine nur sehr geringe
Stammzellkolonie-Rate auf (
Seo et al., 2005).
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Papaccio
et al. (2006) fanden heraus, dass vereinzelle Stammzellen
aus Pulpa (Pulpa dentis) durch Kryokonservierung auch nach zwei
Jahren Lagerung ihre Stammzell-Eigenschaften nicht verlieren und
noch in Knochenzellen differenzieren können. Unter Anwendung des in
der
WO 2005/052140
A2 (
Seo et al., 2005) beschriebenen Verfahrens
konnten allerdings aus kryokonserviertem Pulpa-Gewebe überhaupt
keine Stammzellen mehr isoliert werden.
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Es
ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Isolierung von Stammzellen
aus Zahngewebe bereit zu stellen, das eine hohe Ausbeute an multipotenten
adulten Stammzellen gewährleistet.
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein
Verfahren zur Isolierung von multipotenten Stammzellen der eingangs
genannten Art gelöst,
bei dem die Zellen eines kissenartigen Weichgewebes, das unmittelbar
an der apikalen Seite eines extrahierten unreifen Zahns unterhalb
der Papille lokalisierbar ist, im Gewebeverbund kryokonserviert
werden und der Gewebeverbund erst nach dem Auftauen zum Gewinnen
der Stammzellen aufgelöst
wird. Dieses erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
in vorteilhafter Weise die Isolierung von multipotenten ektomesenchymalen
Stamm-/Progenitorzellen aus einem speziellen Zahngewebe (apikales
Kissen), aus dem sich besonders leicht ektomesenchymale Stamm-/Progenitorzellen
isolieren lassen. Es hat sich dabei überraschender Weise herausgestellt, dass
auch nach der Kryokonservierung des kissenartigen Weichgewebes im
Gewebeverbund Stamm- bzw. Vorläuferzellen
isoliert werden können.
Dabei fällt
die Reaktion der Zellen auf eine osteogene Stimulierung nach Kryokonservierung überraschender Weise
sogar höher
aus als ohne den Zwischenschritt der Kryokonservierung. Die Kryokonservierung
dient also praktisch als Stimulus für die Fähigkeit der isolierten Stammzellen
zu differenzieren. Die Multipotenz der isolierten Stammzellen wird
offenbar durch das erfindungsgemäße Verfahren
und insbesondere die Kryokonservierung stimuliert bzw. optimiert.
Das als Quelle für
die Stammzellen ausgewählte
Gewebe, das beispielsweise bei der Extraktion von Weisheitszähnen anfällt, eröffnet im
Fall der Lagerung die Möglichkeit,
auch in Zukunft noch Zugriff auf (eigenes) stammzellhaltiges Ursprungsgewebe
zu haben. Das erfindungsgemäße Verfahren
hält vor
allem die Möglichkeit
offen, im Rahmen einer Zellersatztherapie, wenn Isolierungsprotokolle
für besondere
Zellpopulationen etabliert sein werden, immer noch Zugriff auf die
Gesamtpopulation aller Zellen im Ursprungsgewebe zu haben. Damit
ergibt sich der Vorteil der langfristigen Lagerung und schnellen
Verfügbarkeit von
hochpotentem Gewebe für
spätere
therapeutische Zwecke im Bedarfsfall.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen,
dass die Zellen des Gewebeverbundes zur Kryokonservierung in einem
Einfriermedium derart kontrolliert abgekühlt werden, dass die intrazelluläre Eisbildung
bei einer Temperatur von ungefähr –7 bis –12 °C, vorzugsweise –10 °C, einsetzt
und die Zellen nach erfolgter Eisbildung weiter bis zu einer Temperatur
von höchstens –80 °C abgekühlt und über oder
in flüssigem
Stickstoff gelagert werden. Durch das kontrollierte Einfrieren werden
die Zellen geschont und somit die Ausbeute an lebensfähigen Stammzellen
erhöht.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden
die Zellen dabei derart abgekühlt,
dass die Eisbildung nach 20-25 Minuten, vorzugsweise 25-30 Minuten,
insbesondere 27-29 Minuten, einsetzt. Durch die Wahl des Zeitpunkts
der intrazellulären
Eisbildung kann das erfindungsgemäße Verfahren an einzelne Zell-
bzw. Gewebetypen angepasst und hinsichtlich der Ausbeute weiter
optimiert werden.
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Überraschender
Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren
ferner dadurch weiter optimiert werden, dass die Eisbildung durch
gezieltes Setzen eines Kristallisationskeims ausgelöst wird.
Bei dieser Ausführungsform
wird das Kryoprotektivum mit dem einzufrierenden Gewebe auf eine
Temperatur von –10
bis –12 °C heruntergekühlt und
dann durch Berühren
des Gefäßes mit
einem Gegenstand von außen
gezielt ein Kristallisationskeim gesetzt, der zu einem schlagartigen
Gefrieren des Kryoprotektivums führt.
Diese Vorgehensweise hat den Vorteil, dass der Zeitpunkt der Eisbildung
gezielt gewählt
und darüber
hinaus der Ort des Beginns der Eisbildung, der vorzugsweise in unmittelbarer
Nähe des
einzufrierenden Gewebes liegen sollte, beeinflusst werden können. Hierdurch
wird der Stress, dem die Zellen während des Einfiervorgangs ausgesetzt
sind, deutlich reduziert, was sich wiederum in einer weiteren Erhöhung der
Ausbeute an lebensfähigen
Stammzellen bemerkbar macht.
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Die
Zellen des Gewebeverbundes können dann
nach erfolgter Eisbildung zur dauerhaften Lagerung bis zu einer
Temperatur zwischen –90 °C und –160 °C, vorzugsweise
zwischen –100 °C und –150 °C, insbesondere
zwischen –120 °C und –130 °C, abgekühlt und
nach der Kryokonservierung durch Erwärmen auf 35-39 °C aufgetaut
werden.
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Es
hat sich im Hinblick auf die Überlebensrate
der Zellen als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn die Zellen
des Gewebeverbundes in mehreren Schritten durch Verdünnen des
Einfriermediums aufgetaut werden. Dabei kann das Einfriermedium
beispielsweise schrittweise gegen ein Medium mit 50, 25, 12.5, 6.25
und 0% foetalem Kälberserum
(FCS) ausgetauscht werden. Durch dieses schonende Auftauen kann
die Überlebensrate
der Stammzellen weiter gesteigert werden.
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In
einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst das Einfriermedium eine Salzlösung, vorzugsweise PBS, mit
10 mg/ml Serumalbumin, 0,1 M Sucrose und 1,5 M PrOH. Selbstverständlich kann
das Kryoprotektivum in seiner Zusammensetzung an das jeweils einzufrierende
Gewebe adaptiert und somit das erfindungsgemäße Verfahren weiter optimiert werden.
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Im
Hinblick auf die Multipotenz der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
zu isolierenden Stammzellen ist es besonders vorteilhaft, wenn das kissenartige
Weichgewebe aus einer Anlage eines impaktierten und/oder retinierten
Zahns in der Entwicklungsphase zwischen dem Auftreten des knöchernen
Alveolarfundus und dem Abschluss der Wurzelbildung gewonnen wird.
Um die gewünschten
multipotenten Stammzellen isolieren zu können, sollte das kissenartige
Weichgewebe nach dem chirurgischen Entfernen des Zahns entlang einer
makroskopisch sichtbaren Grenze zwischen dem kissenartigen Weichgewebe
und der Papille, vorzugsweise unterhalb einer gedachten Linie zwischen
den sich entwickelnden Wurzelfortsätzen, von dem Zahn getrennt werden.
Das derart ausgewählte
Gewebe ermöglicht die
Isolierung ektomesenchymaler Stamm- bzw. Vorläuferzellen, die sich aufgrund
ihrer Multipotenz in unterschiedliche Zelltypen, beispielsweise
Knochen- oder Nervenzellen, differenzieren lassen. Die Wahl des
richtigen Ursprungsgewebes für
die Isolierung der Stammzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist also ein wesentlicher Faktor für eine hohe Ausbeute an multipotenten
Stammzellen.
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Nach
dem Auftauen kann der Gewebeverbund durch enzymatische Behandlung,
vorzugsweise mit Collagenase/Dispase, aufgelöst werden. Dabei können die
Zellen nach der Gewinnung aus dem Gewebeverbund auch vereinzelt
werden.
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Die
mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
isolierten Zellen sind ektomesenchymale Stamm- und/oder Vorläuferzellen,
die nach der Isolierung aus dem Gewebeverbund ostengen und/oder neurogen
stimuliert werden können.
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Die
Erfindung betrifft auch Knochenzellen und neuronale Zellen, die
mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
isoliert wurden. Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isolierten Stammzellen sind
ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Die
erfindungsgemäßen Stammzellen
eignen sich aufgrund ihrer Multipotenz insbesondere für therapeutische
Zwecke im Rahmen einer Zell- und/oder Gewebeersatztherapie. Das
erfindungsgemäße Verfahren
hält also
die Möglichkeit
offen, Zugriff auf die Gesamtpopulation aller Zellen im Ursprungsgewebe
zu haben. Damit ergibt sich der Vorteil der langfristigen Lagerung
und schnellen Verfügbarkeit
von hochpotentem Gewebe für
spätere
therapeutische Zwecke im Bedarfsfall. Zu diesem Zweck ist ein Verfahren
zur Herstellung einer Bank von Stammzellen vorgesehen, bei dem die
Zellen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
gelagert werden, wobei die kissenartigen Weichgewebe einer Vielzahl
von Zähnen
separat kryokonserviert und katalogisiert werden, um bei Bedarf
bestimmte Stammzellen gezielt auswählen und isolieren zu können. Die Erfindung
betrifft auch eine nach diesem Verfahren hergestellte Stammzell-Bank.
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Die
Erfindung wird im Weiteren anhand der Abbildungen und Ausführungsbeispiele
beispielhaft näher
erläutert.
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In den Abbildungen zeigt
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1 eine
perspektivische Ansicht eines extrahierten Weisheitszahns mit apikalem
Weichgewebe (apikalem Kissen),
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2 Abbildungen
der Darstellungen eines Monitors, die den Verlauf der Temperatur
während des
kontrollierten Einfrierens des Gewebes gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
zeigen, mit
- a) spontaner Eisbildung und
- b) stimulierter Eisbildung,
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3 eine
mikroskopische Darstellung einer Zellkolonie mit fibroblastoiden
Zellen, die im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens eingefroren
und aufgetaut wurden,
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4 einen
Vergleich des Proliferationsverhaltens von unterschiedlich behandelten
Proben (PKI: DMSO mit schnellem Auftauverfahren, PKII: DMSO mit
langsamem Auftauverfahren (Verdünnung),
PKIII: Sucrose mit schnellem Auftauverfahren, PKIV: Sucrose mit
langsamem Auftau-Verfahren (Verdünnung)),
F = frische, nicht kryokonservierte Zellen, N2 = kryokonservierte
Zellen, a) Tabelle, b) Balkendiagramm,
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5 das
Ergebnis einer FACS-Analyse der unterschiedlich behandelten Proben
(PKI-PKIV), Positivkontrolle: humane Stammzellen aus Knochenmark
(hBMSC), und
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6 Balkendiagramme
zur Differenzierung der erfindungsgemäßen Stamm-/Progenitorzellen nach
21 Tagen mit und ohne osteogene Stimulation, Negativkontrolle: Fibroblasten
(EU2A), Positivkontrolle: humane Stammzellen aus Knochenmark (hBMSC).
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1 zeigt
einen extrahierten Weisheitszahn, der an seiner apikalen Seite ein
kissenartiges Weichgewebe (pad-like tissue) aufweist, das als einzufrierendes
Gewebekompartiment des Zahns in Einfriermedium (Kryoprotektivum;
eine Mischung aus Medium, FCS 10% und 10% DMSO 10% oder eine Mischung
aus PBS, Serumalbumin, Sucrose und PrOH) gelegt und anschließend in
einem Einfrierautomaten (IceCube) bei festgelegten Einfrierparametern
(Kühlrate)
kontrolliert eingefroren wird. Die eingefrorenen Proben werden bei –196 °C (über flüssigem Stickstoff)
für längere Zeit
gelagert. Das ebenfalls kritische Auftauen des Gewebes auf 37 °C wird entweder
schnell oder langsam mit schrittweisem Austausch des Kryoprotektivums
gegen Normalmedium (Einfriermedium mit 50, 25, 12.5, 6.25 und 0%
FCS) durchgeführt.
Nach dem Auftauen wird das Gewebe analog zum frischen Gewebe mit
Collagenase/Dispase aufgeschlossen. Die isolierten Zellen werden
in DMEM + 10% FCS bei 37 °C
kultiviert und nach Parametern wie Vitalität, Proliferationsvermögen, Expression
von Oberflächenmarkern
und Differenzierungspotential (u.a. Osteogenese) beurteilt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Isolierung von multipotenten Stammzellen durch Kryokonservierung
von lebendem Zahngewebe umfasst das apikale kissenartige Weichgewebe
als einzufrierendes Gewebe eines Weisheitszahns, zwei Lösungen, die
als Kryoprotektivum für
dieses Gewebe geeignet sind, einen adaptierten Einfrierschritt,
eine Apparatur (IceCube), die das Einfrieren automatisiert ausführt, einen
ebenfalls adaptierten Auftauschritt und eine Auswahl von Merkmalen,
mit deren Hilfe die Qualität des
Gewebes nach dem Auftauen praktisch überprüft werden kann.
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Der
extrahierte, d. h. einem Menschen chirurgisch entnommene, Weisheitszahn
gemäß 1 wird
in einem mit Transportmedium (DMEM + Penicillin + Streptomycin)
gefüllten
Behälter
(Zahnbox) bei Raumtemperatur in ein Zellkulturlabor gebracht. Das apikale
Kissen (pad-like tissue) wird entlang der makroskopisch sichtbaren
Grenze zwischen dem kissenartigen Weichgewebe und der Papille unterhalb der
gedachten Linie zwischen den Zahnwurzeln von dem Zahn getrennt,
mit PBS (steril) mehrmals gewaschen und dann mit einem Skalpell
zerkleinert. Die eine Hälfte
der Gewebepräparation
(N2) wird mit Einfriermedium (eine Mischung aus DMEM, FCS 10% und
DMSO 10% oder eine Mischung aus PBS, Serumalbumin, Sucrose und PrOH)
versetzt und mit einem Computergesteuerten Einfriergerät kontrolliert vorgekühlt und
anschließend
eingefroren. Die Eisbildung erfolgt in diesem Ausführungsbeispiel
nach 27-29 Minuten bei einer Temperatur von ca. –10 °C entweder spontan durch extremes
Kühlen,
d. h. Einleiten von flüssigem
Stickstoff in die Kühlkammer, oder
durch gezieltes Setzen eines Kristallisationskeimes im Einfriergefäß. Bei der
letztgenannten Ausführungsform
wird in dem Kryoprotektivum mit dem einzufrierenden Gewebe durch
Berühren
der Oberfläche
des Gefäßes mit
einem vorgekühlten
Metall gezielt ein Kristallisationskeim gesetzt, der zu einem schlagartigen
Gefrieren des Kryoprotektivums führt. Das
Einsetzen der Eisbildung wird durch das Freiwerden der latenten
Wärme im
Probengefäß angezeigt. 2 zeigt
den Verlauf der Temperatur (Kühlrate)
während
des kontrollierten Einfrierens des Gewebes gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Nach
erfolgter Eisbildung wird die Probe weiter gekühlt und bei Erreichen von –90 °C bzw. –150 °C über flüssigem Stickstoff
gelagert. Nach der Lagerung wird das Gewebe entweder in einem einstufigen,
raschen oder mehrstufigen, langsamen Auftauprozess (zuerst Einfriermedium
mit 50% FCS verdünnt,
dann mit 25, 12.5, 6.25 und 0%) auf 37 °C erwärmt. Nach Verdau des Gewebes
mit Collagenase/Dispase für
2 h bei 37 °C
werden die isolierten Zellen mehrmals gewaschen und anschließend in
10% FCS + DMEM (LG beinhaltete T25 Flaschen) kultiviert. Ein Mediumwechsel wird
jeden 3.-4. Tag durchgeführt.
Die zweite Hälfte der
Gewebepräperation
(F, s. o.) wird direkt aufgearbeitet, ohne den vorherigen Einfriervorgang
durchlaufen zu haben.
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Die
aus dem Gewebe isolierten Zellen werden anhand verschiedener Kriterien
analysiert:
- 1. Dauer der Zellschichtbildung
bis zur Konfluenz
- 2. Zellzahl nach 7 Tagen
- 3. Analyse der Oberflächenmarker
- 4. Osteogene Differenzierbarkeit der isolierten Stamm-/Progenitorzellen
Bei Kultivierung der Zellen aus kryokonserviertem Gewebe lassen
sich nach 1-3 Wochen
erste Kolonien beobachten (3). Unterschiede
zwischen den Protokollvarianten (PKI: DMSO mit schnellem Auftau-Verfahren,
PKII: DMSO mit langsamem Auftau-Verfahren (Verdünnung), PKIII: Sucrose mit
schnellem Auftau-Verfahren, PKIV: Sucrose mit langsamem Auftau-Verfahren
(Verdünnung))
sind nicht signifikant. Hinsichtlich ihres Proliferationsverhaltens sind
die Zellen aus kryokonserviertem Gewebe (N2) mit denen aus nativem
Material (F = frisch) vergleichbar, wobei die Zellen aus kryokonserviertem
Gewebe teilweise sogar höhere
Wachstumsraten aufweisen als die frischen Zellen, was ebenfalls
dafür spricht,
dass die Kryokonservierung den Zellen zumindest nicht schadet (4).
Die Analyse der Oberflächenmarker
der isolierten Zellen zeigt ebenfalls nur geringe Unterschiede im Expressionsmuster
zwischen kryokonserviertem und nativem Ursprungsgewebe (5).
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6 zeigt
Balkendiagramme des osteogenen Differenzierungsvermögens der
Zellen nach entsprechender Stimulierung, wobei der Grad der Kalzifizierung
durch Bestimmung der Kalziumionen-Konzentration erfasst wurde. Die
Ergebnisse zeigen, dass auch nach der Kryokonservierung des Ursprungsgewebes
Stamm-/Progenitorzellen isoliert werden können und diese Stamm-/Progenitorzellen auf
osteogene Stimulierung reagieren. Darüber hinaus fällt die
Reaktion der Zellen nach Kryokonservierung überraschender Weise sogar höher aus
als ohne Kryokonservierung. Dabei zeigt die Protokollvariante IV
(PKIV) die höchste
osteogene Antwort bei den isolierten Zellen, d. h. das höchste Differenzierungsvermögen bzw.
die höchste
Ausbeute an Stammzellen ergibt sich bei Verwendung des Sucrose-haltigen
Kryoprotektivums in Verbindung mit dem langsamen Auftauverfahren
(Auftauen durch Verdünnen
des Kryoprotektivums).
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Literatur:
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- Seo BM, Miura M, Sonoyama W, Coppe C, Stanyon R, Shi S.:
Recovery of stem cells from cryopreserved periodontal ligament;
J Dent Res. 2005 Oct; 84(10): 907-12
- Papaccio G, Graziano A, d'Aquino
R, Graziano MF, Pirozzi G, Menditti D, De Rosa A, Carinci F, Laino
G: Long-term cryopreservation of dental pulp stem cells (SBP-DPSCs)
and their differentiated osteoblasts: A cell source for tissue repair;
Journal of cellular physiology Vol: 208 (2): 319-25, 2006