DE102004038134A1 - Multivalente Chelatoren zum Modifizieren und Organisieren von Zielmolekülen - Google Patents

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Abstract

Es werden neue Verbindungen der allgemeinen Formel DOLLAR A X¶m¶-G-CL¶n¶ DOLLAR A beschrieben sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. Es handelt sich dabei um multivalente Chelator-Verbindungen, die Zielmoleküle mit einem Affinitäts-Tag, der an Metall-Chelator-Komplexe bindet, gezielt durch eine Vielzahl von Sonden oder Funktionseinheiten modifizieren und/oder immobilisieren können.

Description

  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf multivalente Chelator-Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für die Modifizierung und/oder Immobilisierung von Zielmolekülen, die einen Affinitäts-Tag tragen, der an Metall-Chelator-Komplexe bindet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Selektive, nicht-kovalente Modifikation von rekombinanten Proteinen mit spektroskopischen oder mikroskopischen Sonden oder (bio)chemischen Funktionseinheiten ist eine zentrale Herausforderung für Proteom-Analyse und biotechnologische Anwendungen. Prinzipiell lassen sich solche Modifikationen ortsspezifisch über sogenannte Affinitäts-Tags, realisieren, d.h. kurze Peptidsequenzen, welche genetisch in ein Protein eingefügt werden. Diese Affinitäts-Tags werden spezifisch von (bio)chemischen Erkennungseinheiten erkannt. Während verschiedene Affinitäts-Tags sehr erfolgreich zur Aufreinigung eingesetzt wurden, ist ihre Anwendung für die Anbindung von spektroskopischen oder mikroskopischen Sonden und anderen biochemischen Funktionseinheiten in Lösung und an Oberflächen oft kritisch, da die Komplexe eine zu geringe Stabilität besitzen.
  • Der Chelator Iminodiessigsäure (IDA) wurde in Kombination mit verschiedenen Metallionen bereits seit Mitte der 1970er Jahre zur Aufreinigung von Proteinen eingesetzt (Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. 1975. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258(5536):598-9.).
  • Mitte der 1980er Jahre wurde Nitrilotriessigsäure (NTA) als Chelator zur Aufreinigung von Proteinen beschrieben ( EP 0 253 303 B1 , US 4,877,830 ). Weiterhin wurde der (kumulierte) Histidin-Tag zur generischen Aufreinigung von rekombinanten Proteinen beschrieben (Hochuli E, Dobel H, Schacher A. 1987. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr 411:177-84; siehe EP 0 282 042 B1 , US 5,284,933 ). Der Histidin-Tag ist inzwischen der mit Abstand am häufigsten eingesetzte Affinitäts-Tag, und die verschiedensten Matrices und Detektionstechniken, welche auf der Interaktion von Oligohistidin mit Chelator-gebundenen Metallionen beruhen, sind beschrieben (Ueda EK, Gout PW, Morganti L. 2003. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. J Chromatogr A 988(1):1-23.).
  • Die Bindungsaffinität einzelner Ni-NTA-Oligohistidin-Interaktionen ist jedoch zu gering, um eine stabile und stöchiometrisch definierte Anbindung zu gewährleisten. Durch eine hohe Dichte von NTA-Gruppen in einer Affinitätsmatrix oder einer planaren Oberfläche kann teilweise stabile Bindung erreicht werden (siehe z.B. Dorn I.T., Pawlitschko K., Pettinger S.C., Tampe R. 1998. Orientation and two-dimensional organization of proteins at chelator lipid interfaces. Biol Chem. 379(8-9):1151-9.; Frenzel A, Bergemann C, Kohl G, Reinard T. 2003. Novel purification system for 6xHis-tagged proteins by magnetic affinity separation. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 793(2):325-9.; Paborsky LR, Dunn KE, Gibbs CS, Dougherty JP. 1996. A nickel chelate microtiter plate assay for six histidinecontaining proteins. Anal Biochem. 234(1):60-5.; Lauer SA, Nolan JP. 2002. Development and characterization of Ni-NTA-bearing microspheres. Cytometry. 48(3):136-45.) Für viele Anwendungen, insbesondere für die Manipulation von Proteinen in Lösung oder in vivo, wie in lebenden Zellen, wird allerdings hohe Bindungsstabilität auf molekularer Ebene benötigt.
  • Eine Möglichkeit, die Bindung zwischen Affinitäts-Tag und Metall-Chelator zu verstärken, ist zunächst eine Manipulation am Affinitäts-Tag. So werden einerseits verlängerte Histidin-Tags beschrieben, wie von Guiget et al., die 10 Histidin-Reste anstatt der üblichen 6 verwenden (Guignet EG, Hovius R, Vogel H. 2004. Reversible site-selective labeling of membrane proteins in live cells. Nat Biotechnol. 22(4):440-4.). Allerdings lassen sich auf diese Weise weder stöchiometrisch definierte noch stabile Komplexe erhalten. Andererseits werden Proteine und Proteinkomplexe beschrieben, die zwei Histidin-Tags tragen und dadurch stabiler an die Oberflächen von Ni-NTA-Chips binden (Nieba L, Nieba-Axmann SE, Persson A, Hamalainen M, Edebratt F, Hansson A, Lidholm J, Magnusson K, Karlsson AF, Plückthun A. 1997. BIACORE analysis of histidine-tagged proteins using a chelating NTA sensor chip. Anal Biochem. 252(2):217-28.). Nicht alle Proteine können jedoch mit mehr als einem Affinitäts-Tag an ihren Termini versehen werden, ohne ihre biologische Funktion zu sehr zu beeinflussen.
  • Die andere Möglichkeit, die Bindung zu verstärken, besteht in der Verbesserung der Chelator-Gruppe selbst. So beschreiben Ebright and Ebright in WO 03/091689 (und in Kapanidis AN, Ebright YW, Ebright RH. 2001. Site-specific incorporation of fluorescent probes into protein: hexahistidine-tag-mediated fluorescent labeling with (Ni(2+):nitrilotriacetic Acid (n)-fluorochrome conjugates. J Am Chem Soc. 123(48):12123-5.) bivalente Chelator-Komplexe zur in situ Markierung von Proteinen mit einer detektierbaren Gruppe, wie beispielsweise einem Fluorophor. Diese Komplexe zeigen eine verbesserte Affinität zu His-Tags im Vergleich zu den monovalenten Komplexen. Die zwei Chelator-Gruppen (NTA) sind allerdings direkt an der detektierbaren Gruppe gebunden, was sie nicht universell synthetisch zugänglich macht. Vielmehr wird die Möglichkeit zu ihrer Herstellung immer von der synthetischen Kompatibilität der ausgewählten detektierbaren Gruppe abhängen.
  • Andere bifunktionelle Carboxymethyl-substituierte Chelatoren werden von Kline et al. beschrieben (Kline SJ, Betebenner DA, Johnson DK. 1991. Carboxymethyl-substituted bifunctional chelators: preparation of aryl isothiocyanate derivatives of 3-(carboxymethyl)-3-azapentanedioic acid, 3,12-bis(carboxymethyl)6,9-dioxa-3,12-diazatetradecanedioic acid, and 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid for use as protein labels. Bioconjug Chem. 2(1):26-31.). Diese Chelatoren können das Zielprotein kovalent binden und wurden für die Markierung mit Metall-Komplexen mit katalytischer Aktivität entwickelt.
  • Eine andere Strategie zur stabilen und selektiven Markierung bzw. Modifizierung von Zielproteinen wird von Griffin et al. beschrieben (Griffin BA, Adams SR, Tsien RY. 1998. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281(5374):269-72.). Es werden Bi-Arsen-Komplexe offenbart, die spezifisch ein bestimmtes vier Cysteine beinhaltenden Motiv (Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys) in rekombinanten Proteinen erkennen. Die Bi-Arsen-Komplexe können detektierbare Gruppen, wie Fluorophore, enthalten und somit die Zielproteine modifizieren bzw. markieren. Diese Technologie wird ebenfalls von Tsien et al. in US 6,008,378 und von Ebright und Ebright in WO 03/107010 beschrieben. Die Verwendung dieser Bi-Arsen-Komplexe ist jedoch beschränkt durch die aufwendige Synthese der entsprechenden Bi-Arsen-Derivate sowie dadurch, daß nur bestimmte Fluorophore und Chromophore möglich sind. Zudem sind die benötigten Cystein-reichen Affinitäts-Tags bzw. Motive wegen der hohen Reaktivität freier Thiolgruppen für viele Anwendungen ungünstig.
    •
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, multivalente Chelatoren zur Bindung an im Stand der Technik bekannte und weit verbreitete Affinitäts-Tags, wie den Oligohistidin-Tag, zur Verfügung zu stellen, die eine stöchiometrische, stabile Interaktion mit dem Affinitäts-Tag aufweisen und schaltbar und reversibel mit dem Zielmolekül interagieren. Dadurch können Zielmoleküle generisch mit einer Vielzahl von Sonden und anderen biochemischen Funktionseinheiten selektiv und ortsspezifisch modifiziert werden. Weiterhin sollen die multivalenten Chelatoren in einer solchen Weise synthetisch zugänglich sein, dass eine kontrollierte und universelle Konjugation mit einer Vielzahl von Sonden und anderen biochemischen Funktionseinheiten möglich ist.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung Stellen von Verbindungen der allgemeinen Formel Xm-G-CLn gelöst, worin
    G eine Gerüst-Struktur,
    X eine Kupplungsgruppe für eine Sonde oder Funktionseinheit F,
    CL eine Chelator-Gruppe mit mindestens einem Metall-Koordinationszentrum,
    m eine ganze Zahl und mindestens 1 und
    n eine ganze Zahl und mindestens 2 ist,
    und Tautomere, Isomere, Anhydride, Säuren und Salze davon.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Gerüst-Strukturen G eine gesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 25 Kohlenstoff-Atomen, bevorzugt 2 bis 20 und weiter bevorzugt 5 bis 16 Kohlenstoff-Atomen. Weiterhin umfassen Gerüst-Strukturen Amid-, Ester- und/oder Etherbindungen.
  • Die Gerüst-Struktur kann linear, verzweigt oder geschlossen sein. Bei einer bevorzugten geschlossenen Gerüst-Struktur handelt es sich um Cyclam-Ring-Strukturen. Bevorzugte Gerüst-Strukturen umfassen Aminosäure-Bausteine.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist jeweils mindestens ein Metallion an den Chelator-Gruppen der erfindungsgemäßen Verbindungen gebunden. Dabei ist das Metallion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ und alle Lanthanidionen.
  • Die Chelator-Gruppe ist bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nitrilotriessigsäure (NTA), Iminodiessigsäure (IDA), alle Varianten von Porphyrinsystemen, Salicylsäurederivate, 1,2-Diaminoethyldiessigsäure, Diaminoethyltriessigsäure, Hydroxyethyliminodiessigsäure und Salzen davon oder Kombinationen davon und anderen dem Fachmann bekannten Chelator-Gruppen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform tragen die reaktiven Gruppen der Chelator-Gruppe Schutzgruppen. Beispielsweise können Carboxyl-Gruppen, wie die von NTA, durch die OtBu-Gruppe geschützt werden. Es können alle üblichen, dem Fachmann bekannten Schutzgruppen verwendet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform befindet sich zwischen den Chelator-Gruppen und der Gerüst-Struktur eine Abstandsgruppe A. Die Abstandsgruppe A kann linear oder verzweigt sein. Es können die üblichen dem Fachmann bekannten Abstandsgruppen verwendet werden. Bevorzugte Abstandsgruppen umfassen Polyethylenglykole, Oligoethylenglykole, Peptide, (CH2)n, worin n von 1 bis 8 ist, Oligoprolin.
  • Es wird bevorzugt, daß die Chelator-Gruppen über Amid-, Ester- oder Etherbindungen an die Gerüst-Struktur gebunden sind.
  • Erfindungsgemäß wird bevorzugt, daß es sich bei der Gerüst-Struktur G selbst nicht um eine Sonde oder eine andere detektierbare Gruppe handelt. Es handelt sich bei G bevorzugterweise um eine Struktur, an der Chelator-Gruppen und Sonden oder Funktionseinheiten angeknüpft werden.
  • Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen ausgewählt aus
    Figure 00060001
    und aus den Tautomeren, Isomeren, Anhydriden, Säuren und Salzen davon.
  • Bevorzugte Kupplungsgruppen X sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NHR, worin R H, ein Alkyl- oder Arylrest ist, COOH, (CH2)n-COOH, worin n eine ganze Zahl ist, SH, Maleinimid, Iodacetamid, Isothiocyanat oder Cyanat.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Sonde oder Funktionseinheit F an der Kupplungsgruppe X der erfindungsgemäßen Verbindungen gebunden. Die Sonde oder Funktionseinheit F ist bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluorophoren, FRET-Fluorophoren, Fluoreszenzlöschern, phosphoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindungen, absorbierenden Verbindungen, Polymeren, PEG, Oligosacchariden, Oligonukleotiden, PNA, Biotin, Haptenen, Peptiden, Proteinen, Enzymen, quervernetzenden Mitteln, Oligoethylenglykol, Lipiden, Nanopartikeln, Elektronendichteverstärkern, Goldclustern, Metallclustern, Quantum dots und Kombinationen davon.
  • Beispiele für Fluorophore und Chromophore, die als Sonden geeignet sind, finden sich in Haughland R.P. 1996. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 6th Ed. (Spence, MTZ, ed.).
  • Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen ausgewählt aus
    Figure 00070001
    Figure 00080001
    worin (A) Bis-NTA, (B) und (C) Tris-NTA und (D) Tetrakis-NTA ist (siehe auch 1), und Tautomeren, Isomeren, Anhydriden, Säuren und Salzen davon.
  • Allgemein lassen sich diese multivalenten Chelatoren dadurch charakterisieren, daß mehrere (unabhängige) Chelator-Gruppen, bevorzugterweise jedoch 2 bis 4, wie z.B. Nitrilotriessigsäure (NTA) an ein molekulares Scaffold (Gerüst G) geknüpft werden, während gleichzeitig eine funktionelle Gruppe (Kupplungsgruppe X) für die Kupplung an eine Sonde oder Funktionseinheit F bereitgestellt wird. Wichtige Voraussetzung für die Anbindung an Sonden oder Funktionseinheiten ist die chemische Orthogonalität dieser Kupplungsruppe X zu den funktionellen Gruppen der Chelator-Gruppen, wie drei Carboxyl-Gruppen im Fall von NTA. Dies wurde im Fall der in 1 gezeigten multivalenten Chelatoren durch Schutzgruppen an den Carboxyl-Gruppen erreicht (vgl. 2). Nun lassen sich selektiv Kupplungsreaktion an der zusätzlichen funktionellen Gruppe (X) durchführen, ohne daß die Chelator-Gruppen beeinträchtigt werden.
  • Weiterhin wird die Aufgabe durch das zur Verfügung Stellen eines Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen gelöst. Das Verfahren umfasst die Kupplung von mindestens 2 Chelator-Gruppen an die Gerüst-Struktur nach oder während der Synthese der Gerüst-Struktur, wobei die Chelator-Gruppen in geeigneter Weise geschützt sein können. Während des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kupplungsgruppe X auch geeignet geschützt sein.
  • Die erfindungsgemäße Synthese der Gerüst-Struktur umfaßt die Synthese aus einer oder mehreren Ausgangsverbindungen, insbesondere aus Aminosäuren, wie beispielsweise Lysin, Ornithin, 1,3-Diaminobuttersäure, 1,2-Diaminopropionsäure, Glutamat oder Aspartat und/oder deren geschützten Derivaten, wie Z-Lys-OtBu, H-Glu(OtBu)-OBzl, Z-Glu-OH.
  • Weitere bevorzugte Ausgangsstoffe sind Bromessigsäure-tert-Butylester, BOC-ε-Aminocapronsäure sowie makrocyclische Polyamine, wie 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan.
  • Ein bevorzugtes Intermediat ist Nα,Nα-Bis[(tert-butyloxycarbonyl)methyl]L-Lysin-tert-Butylester („Lys-NTA-OtBu", Verbindung 3 in 25).
  • Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren umfaßt bevorzugterweise zunächst eine Synthese der Gerüst-Struktur. An die Gerüst-Struktur werden dann die Chelator-Gruppen gekuppelt. Dabei können die Chelator-Gruppen geeignete Schutzgruppen tragen. Dabei ist die Gerüst-Struktur bevorzugterweise eine cyclische Gerüst-Struktur, wie eine Cyclam-Ring-Struktur.
  • Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren umfaßt, daß die Gerüst-Struktur aus geschützten Aminosäuren oder aus von Aminosäuren abgeleiteten Verbindungen aufgebaut werden kann. Dabei wird bevorzugt, daß bereits während der Synthese der Gerüst-Struktur geschützte Chelator-Gruppen eingebaut werden. Bei den Ausgangsverbindungen für die Gerüst-Struktur kann es sich um dem Fachmann bekannte typische Ausgangsprodukte aus der Peptidsynthese handeln. Dabei ist die bevorzugte Gerüst-Struktur linear oder verzweigt (d.h. dendrimer).
  • Es wird bevorzugt, daß Carboxyl-funktionalisierte Gerüst-Strukturen mit Amino-funktionalisierten, geschützten Chelator-Gruppen oder Amino-funktionalisierte Gerüst-Strukturen mit Carboxyl-funktionalisierten, geschützten Chelator-Gruppen modifiziert werden.
  • In Schema I findet sich eine schematische Darstellung bevorzugter Synthesewege. In (A) wird ein Carboxyl-basiertes Gerüst mit einem Amino-funktionalisierten, geschützten Chelator-Baustein (siehe auch 3A) modifiziert. Die geschützte funktionelle Gruppe (Kupplungsgruppe) X-P wird entweder selektiv (I), oder zusammen mit den Chelatorgruppen (II) entschützt und kann anschließend mit einer Sonde oder Funktionseinheit F gekuppelt werden. (B) zeigt einen analogen Syntheseweg für ein Amino-funktionalisiertes Gerüst, das mit einem Carboxyl-funktionalisierten, geschützten Chelator-Baustein (siehe auch 3B) modifiziert wird. Die Zwischenstufen 1 bzw. 2 lassen sich wiederum als Chelator-Baustein im ersten Schritt der Synthese einsetzen (siehe auch Beispiel 9). Schema I
    Figure 00110001
    worin
    X Kupplungsgruppe,
    P Schutzgruppe,
    F Sonde oder Funktionseinheit und
    CL Chelator-Gruppe ist.
  • Multivalente Chelatoren mit 2, 3 und 4 Metall-Koordinationszentren wurden auf der Basis dendrimerer und cyclischer Scaffolds (d.h. chemischer Grundgerüste) synthetisiert (siehe 1 und Beispiele).
  • Für die Herstellung von Bis-NTA-OtBu, Tetrakis-NTA-OtBu und einem Bis-NTA-Lipid werden die Syntheseschritte bevorzugt, die in Beispiel 9 und 25 dargestellt sind.
  • Für die Herstellung von Tris-NTA-OtBu und dessen Derivaten mit verschiedenen Fluorophoren, umfassend insbesondere die Fluorophore Oregon Green 488, ATTO 565, FEW-S0387 (siehe dazu auch 14), werden die Synthese-Schritte, wie in Beispiel 9 und 26 dargestellt, bevorzugt.
  • Weiterhin wird die Aufgabe durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Bindung an einen Affinitäts-Tag an einem Zielmolekül gelöst, wobei der Affinitäts-Tag an Metall-Chelatoren-Komplexe bindet.
  • Bevorzugterweise handelt es sich bei dem Affinitäts-Tag um einen Peptid-Tag, der 4 bis 15 Aminosäuren umfaßt. Bei den 4 bis 15 Aminosäuren kann es sich bevorzugterweise um 4 bis 15 Histidine handeln. Außerdem können 0 bis 4 basische Aminosäuren, wie Lysin und Arginin, im Peptid-Tag enthalten sein.
  • Ein bevorzugter Affinitäts-Tag ist ein (His)n-Tag, worin n eine ganze Zahl von 4 bis 15 ist.
  • Bevorzugte Zielmoleküle umfassen Peptide, Polypeptide, Proteine sowie Peptid- und Protein-Mimetika und peptidmodifizierte Polymere oder Dendrimere. Dabei wird unter Protein oder Polypeptid auch ein post-translational modifiziertes Protein bzw. Polypeptid verstanden. Peptid- und Protein-Mimetika umfassen Verbindungen, die ähnliche Seitenketten-Funktionalitäten wie Peptide bzw. Proteine enthalten, sich aber im Aufbau des Rückgrates von ihnen unterscheiden. Mögliche Variationen des Rückgrates umfassen eine Veränderung der Rückgrat-Atome (Rückgrat-Mimetika), die Einführung bicyclischer Dipeptid-Analoga und die Anordnung der funktionellen Gruppen an einer nicht-oligomeren Kernstruktur (Gerüst-Mimetika). Zu den Rückgrat-Mimetika gehören beispielsweise die Oligo-N-alkylglycine (Peptoide), die sich von Peptiden bzw. Proteinen im Anknüpfungspunkt der Seitenkette unterscheiden (am N anstatt Cα).
  • Bevorzugterweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Modifizierung, Immobilisierung, Kopplung, Reinigung, Detektion, Beobachtung, Analyse oder zum Nachweis von Zielmolekülen in vitro, in vivo, in situ, in fixierten und lebenden Zellen oder in Lipidvesikeln verwendet werden.
  • Eine weitere bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die kontrollierte und reversible Dimerisierung oder Oligomerisierung von Zielmolekülen, insbesondere Proteinen, zu supramolekularen Funktionseinheiten.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in zahlreichen in vitro und in vivo Testmethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, angewendet werden. Bevorzugte Testmethoden umfassen spektroskopische Methoden wie Absorptionsspektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET), Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), Fluoreszenz-Bleichen (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP), reflektometrische Interferenz-Spektroskopie (RIfS), Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie (surface plasmon resonance)/BIACORE, optische Gitterkoppler, Quarz-Mikrowaage, Surface Accoustic Waves (SAW), x/y-Fluoreszenz-Scanning (FluorImaging) sowie mikroskopische Methoden wie Fluoreszenz-Mikroskopie, konfokale optische Mikroskopie, Totalinterne Reflexions-Mikroskopie, kontrastverstärkende Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, Rastersondenmikroskopie, aber auch andere Methoden wie Magnetresonanz-Spektroskopie, -Mikroskopie und -Tomographie, Impedanz-Spektroskopie, Feldeffekt-Transistoren, Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay (ELISA), Fluoreszenz-aktiviertes Zell- oder Partikel-Sortieren (FACS), Radioimmunoassay (RIA), Autoradiographie, analytische Gelfiltration, stopped-flow Technik, Kalorimetrie, Hochdurchsatz-Verfahren (high throughput screening, HTS), Array- und Chip-Technologien, wie Protein-Arrays.
  • Weiterhin bevorzugt ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Immobilisierung von Zielmolekülen.
  • Dazu können die Verbindungen der Erfindung auf einer Oberfläche gebunden oder in einer Lipid-Mono- oder Doppelschicht eingefügt sind. Dabei ist die Oberfläche bevorzugterweise ausgewählt aus Glastyp-Oberflächen, wie Halbmetalloxiden, Metalloxiden und allen Glastypen/Gläsern, Gold, Silber, DAPEG-modifiziertem Glas, PEG-Polymer-modifiziertem Glas oder Gold, GOPTS-silanisiertem Glas, Glastyp oder Edelmetalloberflächen mit Lipid-Mono- oder Doppelschicht, Metall-Seleniden, -Telluriden und -Sulfiden.
  • Unter einer Glas-Oberfläche soll eine Glastyp-Oberfläche verstanden werden, die neben Glas auch Quarz, Glimmer, Metalloxide, Halbmetalloxide umfaßt.
  • Die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von selbstassemblierten Monoschichten (SAM) auf Edelmetalloberflächen wird bevorzugt. SAM werden bevorzugt in Verfahren basierend auf Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie, Impedanz-Spektroskopie, Rastersondenmikroskopie, und Quarz-Mikrowaage verwendet.
  • Weiterhin können die Verbindungen dieser Erfindung zur Herstellung von funktionell mikro- und/oder nanostrukturierten Oberflächen und von Protein-Arrays verwendet werden.
  • Eine grundlegende Idee der vorliegenden Erfindung ist es, die Redundanz des Oligohistidin-Tags zu nutzen, um durch multivalente Chelatoren (MCH) die Stabilität der Protein-Chelator-Bindung um mehrere Größenordnungen zu steigern.
  • Die Bindung von Oligohistidin-Tags an Metall-Chelator-Komplexe erfolgt allgemein über eine koordinative Bindung der N-Atome der Imidazol-Reste des Oligohistidin-tags an freie Koordinationsstellen im Ni2+, das vom Chelator komplexiert und dadurch teilweise koordinativ abgesättigt ist. Im Fall von Ni-NTA-Komplexen sind vier der insgesamt sechs Koordinationsstellen des Ni2+ durch NTA abgesättigt, so daß zwei freie Koordinationsstellen für die Bindung von 2 Histidin-Resten verbleiben (4A). Die Komplexbildung erfordert damit zwei Schritte (4B): (1) die Aktivierung des Chelators durch Bindung eines Metallions, wie z.B. Ni2+, und (2) die Bindung von Histidin-Resten des Oligohistidin-Tags an die freien Koordinationsstellen. Durch Zugabe von freiem Imidazol im Überschuß kann die Bindung des Oligohistidin-Tags an den Ni(II)-Chelator-Komplex aufgehoben werden, so daß die Protein-Chelator Bindung reversibel und schaltbar ist. Außerdem kann durch Entfernen des Ni2+ aus dem Chelat-Komplex mithilfe von EDTA der Chelator deaktiviert werden (4B).
  • Die Bindung des Oligohistidin-Tags an Metallchelat-Komplexe über lediglich zwei Histidin-Reste ist relativ instabil (siehe Beispiele 4 und 8). Werden Metallchelatoren in hoher Dichte immobilisiert, so können mehrere Histidin-Reste des Oligohistidin-Tags an mehrere Metall-Chelat-Einheiten gleichzeitig binden, was in einer stärkeren Bindung resultiert (5B). Durch die Verwendung multivalenter Chelatoren, die mehrere Metall-Chelat-Einheiten in einem Moleküle enthalten, kann eine stabile Bindung an Oligohistidin-Tags auf molekularer Ebene erzielt werden. Durch Kopplung weiterer Funktionseinheiten an den Chelator können Proteine, die einen Oligohistidin-Tag enthalten, so stabil, jedoch reversibel und schaltbar modifiziert werden (5C).
  • Die in den nachfolgenden Figuren und Beispielen beschriebenen Untersuchungen zeigen, daß die multivalenten Chelator-Verbindungen chemische, hochaffine, schaltbare molekulare Erkennungsstrukturen für Affinitäts-Tags, wie den Histidin-Tag, darstellen. Damit stellen sie nicht nur eine Verbesserung der traditionellen Chelatoren dar, sondern eröffnen prinzipiell neue Anwendungsbereiche. Da sie mit nahezu jeder chemischen Verbindung gekoppelt werden können, läßt sich fast jede Art spektroskopischer oder mikroskopischer Sonde oder Funktionseinheit mit diesen Chelatoren ortsspezifisch und reversibel an Zielmoleküle, wie rekombinante Proteine, anheften. Ebenso können z.B. Oligosaccharide, PEG, oder andere biochemische Funktionseinheiten reversibel an Zielmoleküle gebunden werden, um diese auf diese Weise funktional zu modifizieren. MCH können auch wiederum auf molekulare Gerüste gesetzt werden und so Zielmoleküle, wie z.B. Proteine, räumlich in Dimere oder multimere Strukturen organisieren. Auch hier ist die versatile Schaltbarkeit eine zentrale Eigenschaft. Weitere Möglichkeiten ergeben sich durch eine Kopplung mit Oligonukleotiden oder PNA. So könnten die Multiplexing-Möglichkeiten der DNA-Microarrays für die Herstellung von Protein-Arrays genutzt werden.
  • Folgende Abkürzungen werden verwendet:
    • AU
    Extinktionseinheiten (absorbance units)
    Boc
    tert-Butyloxycarbonyl (Schutzgruppe)
    Bzl
    Benzyl (Schutzgruppe)
    DAPEG
    α,ω-Diaminopolyethylenglycol
    DIC
    Diisopropylcarbodiimid
    DMF
    Dimethylformamid
    DIPEA
    Diisopropylethylamin
    EDTA
    Ethylendiamintetraacetat
    FL
    Fluoreszein
    FRET
    Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (fluorescence resonance energy transfer)
    Glu
    Glutaminsäure
    GOPTS
    Glycidyloxipropyltriethoxysilan
    H10
    Dekahistidin
    H6
    Hexahistidin
    IDA
    Iminodiessigsäure (iminodiacetic acid)
    Ifnar2
    Extrazelluläre Domäne des Typ I Interferon-Rezeptors 2
    IFNα2, IFNβ
    Typ I Interferone α2 und β
    MBP
    Maltosebindeprotein
    MCH
    Multivalenter Chelator
    NTA
    Nitrilotriessigsäure (nitrilotriacetic acid)
    OG
    Oregon Green 488®
    PEG
    Polyethylenglycol
    PNA
    Peptidnukleinsäure (peptide nucleic acid)
    RIfS
    Reflektometrische Interferenz-Spektroskopie
    RT
    Raumtemperatur
    SAM
    Selbst-assemblierende Monoschicht
    TBTU
    O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate
    tBu
    tertiär-Butyl(Schutzgruppe)
    TEA
    Triethylamin
    TFA
    Trifluoressigsäure (trifluoro acetic acid)
    Z
    Benzyloxycarbonyl (Schutzgruppe)
  • Figuren und Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren verdeutlicht werden, ohne jedoch auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
  • In den Figuren zeigen
  • 1 die Strukturformeln der multivalenten Chelatoren (MCH) und deren prinzipiellen Aufbau. Die NTA-Gruppen sind jeweils hellgrau, die Kupplungsgruppen dunkelgrau unterlegt.
  • 2 den Aufbau der multivalenten Chelatoren.
    • (A) Mono-NTA (1) Bis-NTA (2) und Tris-NTA (3) mit OtBu-geschützten NTA-Gruppen. Die freie funktionelle Gruppe (Kupplungsgruppe X) ist grau unterlegt.
    • (B) die gleichen Chelatoren wie in (A) nach Kupplung der funktionellen Gruppe an eine PEG-Sonde und Entschützen der Carboxylgruppen der NTA-Reste.
  • 3 bevorzugte, geschützte Amino-(A) bzw. Carboxyl-funktionalisierte (B) Chelator-Bausteine (X-CL-P), wie insbesondere in Schema I verwendet.
  • 4: Prinzip der schaltbaren, reversiblen Interaktion von Oligohistidin mit Metall-Chelator-Komplexen.
    • (A) Koordination von zwei Histidinresten an die zwei freien Koordinationsstellen des Ni(II)-NTA-Komplexes.
    • (B) Aktivierung von Chelatoren mittels Metallionen und Bindung an Histidin-getagtes Protein; Dissoziation mittels Kompetitor (z.B. Imidazol), und Deaktivierung der Chelatoren z.B. über EDTA
  • 5: Konzept der multivalenten Chelatoren.
    • (A) transiente, monovalente Interaktion immobilisierter Metallchelatoren wie z.B. Ni:NTA mit einem Histidin-getagten Protein.
    • (B) Stabile, multivalente Wechselwirkung mit 2 oder mehreren immobilisierten Metallchelatoren, wie z.B. in einer Affinitätsmatrix.
    • (C) stabile Kopplung an Funktionseinheiten durch multivalente Chelatoren.
  • 6 eine schematische Darstellung der Kupplung von MCH an DAPEG-modifizierte Oberflächen (siehe Beispiel 1).
  • 7 Protein-Immobilisierung auf funktionalisierten Glasoberflächen.
    • (A) schematische Darstellung der Anbindung von Tris-NTA über einen PEG-Polymerrasen (PEG2000) an eine GOPTS-silanisierte Glasoberfläche.
    • (B) Bindung von ifnar2-H10 vor (...) und nach (–) Beladung der Chelatoren mit Ni(II)-Ionen.
  • 8 Funktionalität immobilisierter Proteine auf Chelator-modifizierten Quarzoberflächen (detektiert über RIfS). Bindungskurve für die Immobilisierung von ifnar2-H10 nach Beladung des Chelators mit Ni(II)-Ionen und die Interaktion von immobilisiertem ifnar2-H10 mit seinem Liganden IFNα2.
  • 9 Immobilisierung von Histidin-getagten Proteinen auf Goldoberflächen.
    • (A) Strukturformeln von Alkylthiolen, welche zur Herstellung von gemischten selbstassemblierten Monoschichten (SAM) verwendet wurden.
    • (B) Bindung von ifnar2-H6 (1) vor (...) und nach (–) Beladen der Oberflächengebundenen Chelatoren mit Ni(II)-Ionen, Interaktion mit IFNα2 (2) und Regeneration mit 200 mM Imidazol (3) und 200 mM EDTA (4) (Detektion mittels Oberflächenplasmonen-Resonanz).
  • 10 Vergleich der Interaktion von MBP-H10 in hoher Konzentration (30 μM) mit verschiedenen Chelatoren.
    • (A) Assoziation und Dissoziation von 30 μM MBP-H10 an Mono-NTA.
    • (B) Dissoziation im Vergleich für Mono-, Bis- und Tris-NTA. (–).
  • 11 Induzierte Dissoziation von immobilisiertem MBP-H10 bei verschiedenen Imidazolkonzentrationen.
    • (A) Vergleich der Dissoziationskinetik von ifnar2-H10 von Mono-NTA Oberflächen bei verschiedenen Imidazol-Konzentrationen und Anpassung eines Bindungsmodels.
    • (B) Abhängigkeit der Gleichgewichtsbeladung als Funktion der Imidazol-Konzentration im Vergleich für Mono-, Bis- und Tris-NTA.
  • 12
    • (A) Vergleich der Stabilität der Bindung von MBP-H6 und MBP-H10 an Tris-NTA.
    • (B) Vergleich der Stabilität der Bindung von MBP-H10 an Mono-NTA und MBP-H6 an Tris-NTA.
  • 13 Unspezifische Bindung von Proteinen an Chelator-modifizierte Oberflächen.
    • (A) Bindung von IFNβ vor (...) und nach (–) Immobilisierung von ifnar2-H10 auf Mono-NTA mit hoher Oberflächendichte.
    • (B) Bindung von IFNβ an Tris-NTA mit niedriger Oberflächendichte (...), nach Blockieren der Oberfläche mit MBP-H10 (–), und nach Immobilisierung von ifnar2-H10 und anschließendem Blockieren mit MBP-H10 (–).
  • 14 Blockieren von Histidin-Tags in Lösung mittels Tris-NTA.
    • (A) Bindung von 50 nM ifnar1-H10 ohne (–) und mit (...) 100 nM Tris-NTA auf Tris-NTA modifizierten Oberflächen.
    • (B) Bindung von 100 nM ifnar1-H10 wt (–) und 100 nM ifnar1-H10 W129A (...) mit jeweils 200 nM Tris-NTA-Fluorescein an immobilisiertes IFNβ.
  • 15 Chelator-Lipid Konjugat zur Anbindung von Histidin-getagten Proteinen an Lipidmembranen.
    • (A) Struktur des synthetisierten Bis-NTA Lipid Konjugats.
    • (B) Assemblierung von Festkörper-unterstützten Lipiddoppelschichten über Vesikelfusion, Immobilisierung von ifnar2-H10 und Interaktion mit dem Liganden IFNα2.
  • 16 Untersuchung der lateralen Diffusion von Fluoreszenz-markiertem ifnar2-H10, welcher auf Festkörper-unterstützten Lipiddoppelschichten angebunden wurde, über FRAP.
    • (A) Fluoreszenz-Bilder vor und an verschiedenen Zeitpunkten nach dem Bleichen eines runden Ausschnitts.
    • (B) Intensität im Bleichfleck (–) und an einem Referenzfleck (...) als Funktion der Zeit.
  • 17 Konjugate von Tris-NTA mit verschiedenen Fluorophoren A: Oregon Green 488; B: ATTO 565; C: FEW-S0387.
  • 18 Fluoreszenzmarkierung und Bindungsassay mittels Gelfiltration.
    • (A) Chromatogramm (Absorption bei 280 (Protein) bzw. 490 nm (Oregon Green)) von ifnar2-H10 mit Tris-NTA-Oregon Green markiert vor (–) und nach (...) Zugabe des Liganden IFNα2.
    • (B) Fluoreszenzspektren des Tris-NTA-Oregon Green vor (–) und nach (...) Beladung mit Metallionen, und nach Bindung an ifnar2-H10 (–).
  • 19 Spektroskopische Eigenschaften der Konjugate von Tris-NTA mit Oregon Green 488 (I), ATTO565 (II) und FEW-S0387 (III). Normalisierte Fluoreszenzspektren der Konjugate (–), nach Komplexierung von Ni(II)-Ionen (...) und nach Bindung von ifnar2-H10 (–).
  • 20 Konjugate von Mono- (A), Bis- (B), Tris- (C) und Tetrakis-NTA (D) mit Fluorescein.
  • 21 Untersuchung der nicht-kovalenten Fluoreszenzmarkierung von MBP-H6 (linke Seite) und MBP-H10 (rechte Seite) mit verschiedenen MCH über analytische Gelfiltration (Absorption bei 280 nm (Protein –) und bei 490 nm (Fluorescein ...)).
    • (A) Mono-NTA; (B) Bis-NTA; (C) Tris-NTA; (D) Tetrakis-NTA (Fluorescein-Konjugate).
  • 22 Untersuchung der Assoziationskinetik über Fluoreszenzlöschung. Vergleich der Bindungskurven für Mono-NTA mit H10-Fluorescein (–) und H6-Fluorescein (...).
  • 23 Untersuchung der Dissoziationskinetik.
    • (A) Fluoreszenzänderung beim 10-fachen Verdünnen von 5mM Mono-NTA-H10-Fluorescein Komplex.
    • (B) Vergleich der Dissoziationskinetik für verschiedene MCH mit H10-Fluorescein und H6-Fluorescein normalisiert auf die Gleichgewichts-Amplitude.
  • 24 Vergleich der Komplexbildungskonstanten für Mono-NTA und MCH.
    • (A) Dissoziationsratenkonstanten, (B) Gleichgewichtsdissoziationskonstanten.
  • 25 Syntheseschema zur Darstellung von Bis-NTA-OtBu (6), Tetrakis-NTA-OtBu (8) und einem Bis-NTA-Lipid (12).
  • 26 Syntheseschema zur Darstellung von Tris-NTA-OtBu (17 und 18) und Derivaten mit drei verschiedenen Fluorophoren: Oregon Green 488 (21), ATTO 565 (22), FEW-S0387 (23).
    •
  • Beispiel 1: Anbindung der MCH an Oberflächen
  • Zur Immobilisierung von Histidin-getagten Proteinen auf Oberflächen wurden die Chelatoren kovalent auf Glas- und Goldoberflächen angebunden. Dazu wurden verschiedene Strategien verwendet. Glasoberflächen wurden zunächst mittels einer Monolage α,ω-Diamino-Polyethylenglycol (DAPEG, 2000 g/mol) abgeschirmt. Dies erfolgte nach einem Protokoll gegen unspezifische Proteinbindung, das von Piehler et al. 2000 beschrieben wurde (Piehler J, Brecht A, Valiokas R, Liedberg B, Gauglitz G. 2000. A high-density poly(ethylene glycol) polymer brush for immobilization on glass-type surfaces. Biosensors & Bioelectronics 15(9-10):473-481.)
  • Die chemische Anbindung der Chelatoren an diese Oberflächen ist in 6 schematisch dargestellt. Carboxyl-funktionalisierte Chelatorköpfe (vgl 2A) wurden direkt an die freien Aminogruppen des DAPEG gekuppelt (6, Weg III), wobei die Oberflächenkonzentration über die Kupplungsdauer variiert wurde. Zur Kupplung von Amino-funktionalisierten Chelatoren wurde die Oberfläche zunächst mittels Glutarsäureanhydrid umfunktionalisiert (6, Weg I). Durch gleichzeitige Zugabe von Essigsäureanhydrid wurde die Oberflächenkonzentration an Carboxylgruppe variiert (6, Weg II). Die MCH wurden an die so generierten Carboxylgruppen gekuppelt. Anschließend wurden die Schutzgruppen durch Trifluoressigsäure entfernt.
  • Beispiele 2–5: Immobilisierung von Proteinen über MCH
  • Beispiel 2: Spezifische Immobilisierung und Funktionalität
  • Die Interaktion von Histidin-getagten Proteinen mit den Oberflächen, wie in Beispiel 1 hergestellt, wurde detailliert mittels reflektometrischer Interferenz-Spektroskopie (RIfS) charakterisiert. Mit dieser Methode läßt sich die Bindung von Proteinen an Oberflächen zeitaufgelöst quantifizieren, wie in Piehler und Schreiber 2001 beschrieben (Piehler J, Schreiber G. 2001. Fast transient cytokine-receptor interactions monitored in real time by reflectometric interference spectroscopy. Anal. Biochem. 289(2):173-186.) Die Immobilisierung der extrazellulären Domäne von ifnar2 mit einem C-terminalen Dekahistidin-Tag (ifnar2-H10) auf eine Tris-NTA modifizierte Oberfläche (7A) ist in 7B gezeigt. Während vor Beladung des an die Oberfläche gekoppelten Chelators mit Ni(II)-Ionen keine Bindung detektierbar war, wurde danach eine Bindung von insgesamt ca. 1,5 ng/mm2 Protein beobachtet, welches auch beim Spülen stabil immobilisiert blieb. Dieses Protein konnte jedoch quantitativ mit 200 mM Imidazol als Kompetitor entfernt werden.
  • Die Funktionalität des immobilisierten Proteins wurde über die Bindung des Liganden Interferonα2 (IFNα2) untersucht (8). Dabei zeigte es sich, daß mehr als 90% des immobilisierten ifnar2-H10 aktiv waren und spezifische, reversible Interaktion mit dem Liganden zeigte.
  • Beispiel 3: Selbst-assemblierte Monoschichten (SAM) mit MCH's
  • Auf Goldoberflächen wurde die Technik der selbst-assemblierten Monoschichten (SAM) verwendet (Sigal GB, Bamdad C, Barberis A, Strominger J, Whitesides GM. 1996. A selfassembled monolayer for the binding and study of histidine-tagged proteins by surface plasmon resonance. Anal Chem 68:490-7.).
  • Dazu wurden Alkylthiole mit Bis-NTA Kopfgruppe synthetisiert (9A). Um unspezifische Proteininteraktion mit den funktionalisierten Oberflächen zu minimieren, wurde zwischen Kopfgruppe und Alkylgruppe ein Oligoethylenglykolrest eingebracht. Dieses Bis-NTA-Thiol wurde mit einem Matrixthiol ohne MCH-Kopfgruppe (9A) gemischt, um so SAMs mit unterschiedlichen Oberflächenkonzentrationen von MCH zu generieren. Es ließ sich spezifische, reversible Immobilisierung von ifnar2-H6 sowie spezifische Bindung des Liganden IFNα2 an das immobilisierte Protein nachweisen (9B).
  • Beispiel 4: Stabilität der Anbindung über MCH
  • Die relative niedrige Bindungsstabilität von Mono-NTA läßt sich an Oberflächen durch hohe Oberflächenkonzentrationen des Chelators teilweise kompensieren. Im Gegensatz zu monovalenten Chelatoren ermöglichen MCH eine stabile Anbindung von Histidin-getagten Proteinen an Oberflächen auch bei niedrigen Oberflächenkonzentrationen, was für die Anwendung eine Reihe von Vorteilen bietet. 10A zeigt zunächst die Bindung von MBP-H10 auf Mono-NTA-funktionalisierten Oberflächen.
  • Nach anfänglich vollständiger Beladung der Oberfläche mit Protein (MBP-H10) wurde eine deutliche Dissoziation beobachtet: nach 400 s ist mehr als 50% des ursprünglich gebundenen Proteins von der Oberfläche dissoziiert. Die beobachtete Dissoziationskinetik läßt sich durch Rückbindung und kooperative Effekte an der Oberfläche erklären, welche typisch für die Bindung über Mono-NTA sind.
  • Bei den MCH läßt sich im Vergleich dazu eine sehr stabile Bindung und keine signifikante Dissoziation in dem gleichen Zeitraum beobachten (10B). Da für die MCH keine Dissoziation beobachtet werden konnte, wurden die Bindungsstabilitäten mittels Imidazol herabgesetzt.
  • In 11A ist die Dissoziation von MBP-H10 von Mono-NTA Oberflächen bei verschiedenen Imidazolkonzentrationen gezeigt. Durch Anpassen eines Bindungsmodells wurde die Gleichgewichtsbeladung Req bestimmt.
  • Die Abhängigkeit von Req von der Imidazolkonzentration ist für Mono-, Bis-, und Tris-NTA in 11B im Vergleich gezeigt. Eine deutliche Verschiebung zu höheren Imidazolkonzentrationen zeigt den Anstieg der Bindungsstabilität als Funktion der Multivalenz. Zudem werden steilere Übergänge beobachtet, die auf einen Übergang zu einer molekularen Kooperativität im Gegensatz zur Oberflächen-kooperativität des Mono-NTA hindeuten.
  • Mit der gleichen Methode wurde auch die Stabilität der Bindung über verschiedene Histidintags untersucht. Dazu wurden das Maltosebindeprotein mit C-terminalem Hexa- (MBP-H6) und Dekahistidin-Tag (MBP-H10) verwendet. 12A zeigt einen Vergleich der Imidazolinduzierten Dissoziation für diese Proteine von Tris-NTA modifizierten Oberflächen. Die Unterschiede in der Bindungsstabilität sind so deutlich, daß eine quantitative Unterscheidung bei 30 mM Imidazol möglich ist. Ein deutlich steilerer Übergang im Vergleich zu Interaktion zwischen Mono-NTA und MBP-H10 deutet wiederum auf eine molekulare Interaktion hin (12B).
  • Beispiel 5: Unspezifische Bindung
  • Unspezifische Bindung von Proteinen mit Chelatoren – entweder elektrostatisch oder über koordinierte Metallionen – ist ein zentrales Problem bei der Verwendung von Chelatoren zur Immobilisierung von Proteinen, da eine stabile Immobilisierung über Mono-NTA einen hohen Überschuß von NTA-Gruppen notwendig macht. Dieser Effekt ist in 13A demonstriert.
  • Der Ligand IFNβ bindet in hohem Maße unspezifisch an die hoch mit Mono-NTA funktionalisierte Oberfläche, so daß keine sinnvolle Bindungskinetik bestimmt werden kann. Bei Tris-NTA ist aufgrund der niedrigen Chelator-Konzentration bereits deutlich geringere unspezifische Bindung zu erkennen (13B). Durch Blockieren der Bindungsstellen mit einem indifferenten Protein (MBP-H10) läßt sich die unspezifische Bindung vollständig eliminieren, und so eine ungestörte Bindungskinetik vermessen. Da die Koordinationsstellen an der Oberfläche quantitativ blockiert werden können, lassen sich so auch spezifische Wechselwirkungen mit Histidin-getagten Proteinen untersuchen.
  • Ein weiterer Vorteil der hohen Bindungsstabilität der MCH liegt in der Möglichkeit, die Bindung von Histidin-getagten Proteinen mit der Chelator-modifizierten Oberfläche durch Zugabe von Metallionen-beladenen MCH in Lösung effizient zu blockieren. Dadurch lassen sich spezifische Interaktion mit Histidin-getagten Proteinen untersuchen, ohne daß sie an überschüssige Chelatoren an der Oberfläche binden. Dies ist in 14 demonstriert. Mit einem geringen Überschuss von Tris-NTA in Lösung läßt sich die Bindung von ifnar1-H10 an eine Tris-NTA-modifizierte Oberfläche fast vollständig unterdrücken (14A).
  • Basierend auf diesem Prinzip wurde ein Bindungsassay durchgeführt. Dazu wurde zunächst ifnar2-H10 auf einer Tris-NTA-modifizierten Oberfläche immobilisiert. Nach Blockieren der überschüssigen Chelatoren mit MBP-H10 wurden die Bindungsstellen des ifnar2 mit IFNβ gesättigt. Der anschließende Bindungsassay mit ifnar1-H10, welcher mit Tris-NTA-Fluorescein (siehe unten, Beispiel 8) versetzt wurde, ist in 14B gezeigt. Es wurde ausschließlich spezifische Interaktion nachgewiesen, während für die (inaktive) Mutante W129A in der Bindungsstelle von IFNβ keine Bindung beobachtet wurde.
  • Beispiel 6: Konjugate mit Lipiden
  • Zur Anbindung von Proteinen auf Lipidmembranen wurde ein Lipid-analoges Konjugat von Bis-NTA synthetisiert, das in 15A gezeigt ist.
  • Dieses Lipid wurde in unilaminare Vesikel aus Stearoyl-Oleoyl-Phosphatidylcholin inkorporiert, welche auf Glasoberflächen spontan eine fluide, Festkörper-unterstützte Lipid-Doppelschicht ausbilden (15B). An diese Membranen konnte ifnar2-H10 spezifisch verankert werden, wobei die Bindungsaktivität vollständig erhalten blieb (15B). Die laterale Diffusion des Membran-verankerten ifnar2-H10 wurde über Fluoreszenz-Bleichen (fluorescence recovery after phtotobleaching, FRAP) analysiert (16). Dabei wurde eine Diffusionskonstante von 1 μm2/s bestimmt.
  • Beipiele 7 und 8: Konjugate mit Fluorophoren
  • Beispiel 7: Verschiedene Fluorophore und spektroskopische Eigenschaften
  • Für eine nicht-kovalente Fluoreszenzmarkierung von Histidin-getagten Proteinen in Lösung wurden Konjugate von Tris-NTA mit drei verschiedenen Fluorophoren synthetisiert: Oregon Green 488, ATTO 565, FEW-S0387 (17).
  • Nach Beladung mit Ni(II)-Ionen wurde zu diesen Konjugaten ifnar2-H10 gegeben und das überschüssige Konjugat über Gelfiltration abgetrennt.
  • Für alle Konjugate wurde stabile Markierung von ifnar2-H10 beobachtet: in einem zweiten Gelfiltrationslauf war kein freier Farbstoff detektierbar (18A). Bei Zugabe des Liganden wurde zudem eine Verschiebung zu höheren Wellenlängen beobachtet (18A), und so bestätigt, daß die Funktion des Proteins durch diese ortsspezifische Markierung erhalten blieb. Diese Markierung war vollständig reversibel: durch Zugabe von Imidazol konnte das MCH-Fluorophor-Konjugat vollständig abgetrennt werden.
  • Die verschiedenen Zustände des MCH-Fluorophor-Konjugats konnten über die Fluoreszenzquantenausbeute verfolgt werden. (18B). Nach Beladen der Chelator- Gruppen mit Ni(II)-Ionen wurde ein deutlicher Rückgang der Fluoreszenz auf ca. 50 % beobachtet, und nach Bindung an das Protein auf ca. 40 %. Dieser Effekt war auch bei den übrigen Fluoreszenzfarbstoffen zu beobachten und war bei Fluoreszenzfarbstoff ATTO 565 sogar noch stärker ausgeprägt (19).
  • Beispiel 8: Bindungsstabilität in Lösung
  • Zur Untersuchung der Bindungsstabilität in Lösung wurden von Mono-, Bis-, Tris- und Tetrakis-NTA Konjugate mit Fluorescein synthetisiert und mit Ni(II)-Ionen beladen (20). Die Interaktion dieser Konjugate mit Hexa- und Dekahistidin-getagten Proteinen wurde über analytische Gelfiltration, isotherme Titrationskalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie thermodynamisch und kinetisch charakterisiert.
  • A) Analytische Gelfiltration
  • Für Untersuchungen mittels analytischer Gelfitration wurde MBP-H6 und MBP-H10 mit einem stöchiometrischen Überschuss an Konjugat versetzt und diese Mischung auf die Gelfiltrations-Säule aufgetragen, und die Extinktion am Ausgang der Säule gleichzeitig bei 280nm (Protein) und 490nm (Fluorescein) verfolgt. Über das Verhältnis dieser Signale ließ sich der Markierungsgrad und damit die Bindungsstabilität ungefähr abschätzen. Die Chromatogramme sind in 21 zusammengefaßt. Für Mono-NTA (21A) konnte für MBP-H6 und MBP-H10 nahezu kein gebundenes Konjugat detektiert werden. Für Bis-NTA (21B) ließ sich eine deutlich stabilere Bindung von MBP-H10 als von MBP-H6 feststellen. Für Tris- und Tetrakis-NTA (21c und 21D) waren stöchiometrische Markierungsgrade und geringe Unterschiede zwischen MBP-H6 und MBP-H10 festzustellen.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die Stabilität der Interaktion von Tris- und Tetrakis-NTA mit Hexa- und Dekahistidin-Tags so hoch ist, daß eine stabile und stöchiometrische Fluoreszenzmarkierung erreicht werden kann. Außerdem demonstrieren sie eindrucksvoll die Überlegenheit der MCH gegenüber dem traditionellen Mono-NTA in Hinblick auf die Stabilität der Interaktion mit Histidin-getagten Proteinen.
  • B) Fluoreszenzspektroskopie
  • Die Kinetik der Interaktion zwischen MCH und Histidin-Tags wurde fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Dazu wurden Fluorescein-markierte Oligohistidin-Peptide verwendet. Bei der Bindung dieser Peptide an die MCH wurde eine starke Fluoreszenz-Löschung beobachtet. Die Änderung der Fluoreszenz wurde mittels stopped-flow Technik in hoher Zeitauflösung verfolgt (vgl. 22). Aus diesen Kurven wurden Assoziationsratenkonstanten von 1,5–5·105 M–1s–1 über Kurvenanpassung bestimmt. Dabei waren die Ratenkonstanten für Dekahistidin deutlich höher als für Hexahistidin.
  • Der gleiche Fluoreszenz-Löschungs-Effekt wurde auch zur Untersuchung der Dissoziationskinetik verwendet. Dazu wurde zunächst ein stöchiometrischer Komplex bei hoher Konzentration hergestellt und entweder mit Puffer (für Mono-NTA) oder einem 10-fachen Überschuß MBP-H10 (für MCH) verdünnt. In 23A ist das Fluoreszenz-Signal gezeigt, das beim Verdünnen eines Mono-NTA H10-Fluorescein Komplexes beobachtet wurde. Aus dieser Kurve wurde eine Dissoziationsratenkonstante von 1,5 s–1 ermittelt, was die extrem niedrige Stabilität molekularer Ni:Mono-NTA-Histidin-Tag Komplexe belegt.
  • Die Stabilität der MCH-Oligohistidin-Komplexe war deutlich höher, so daß ein Kompetitor notwendig war, um Dissoziation zu beobachten. Die so erhaltenen Dissoziationskurven sind in 23B gezeigt. Aus diesen Kurven wurden deutlich niedrigere Dissoziationsratenkonstanten erhalten als für Mono-NTA (24A). Die resultierenden Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten sind in 24B gezeigt, welche die Steigerung der Bindungsaffinitäten der MCH um fast 5 Größenordnungen (bis < 1 nM) im Vergleich zu Mono-NTA (ca. 10 μM) eindrucksvoll untermauert.
  • Beispiel 9: Synthesevorschriften
  • A) Synthese von Lys-NTA-OtBu (3) (siehe auch 25)
  • Bromessigsäure Tert-Butylester (1,59 ml; 10,8 mmol) und DIPEA (2,30 ml; 13,5 mmol) werden zu einer Lösung von Nε-benzyloxycarbonyl-L-Lysin tert-butyl ester (1) (1,00 g; 2,7 mmol) in DMF (25 ml) gegeben. Der Reaktionskolben wird mit Stickstoff gespült und dann über Nacht bei 55°C gerührt. Die flüchtigen Komponenten werden in vacuo bei 60°C abgezogen. Der Rückstand wird in Cyclohexan:Ethylacetat (3:1, 15 ml) aufgerührt, abgesaugt und der Niederschlag dreimal mit dem gleichen Solvent gewaschen (3 × 10 ml). Das Filtrat wurde aufkonzentriert und über eine Kieselgelsäule mit Cyclohexan/Ethylacetat (3:1) als Elutionsphase gereinigt. Ausbeute: 1,3 g (2,3 mmol) Nα,Nα-Bis[(tert-butyloxycarbonyl)methyl]-Nε-benzyloxycarbonyl-L-Lysin tert-Butylester (2), 85% d.Th. TLC: Rf = 0.5 in Cyclohexane/Ethylacetat (3:1)
    1H NMR (250MHz, CDCl3); δ:
    1,44 (s, 18H, ((CH3)3COCOCH2)2N-);
    1,47(s, 9H, (CH3)3COCOCH-);
    1,49 (m, 4H, Z-NHCH2-CH2-CH2-);
    1,59 (m, 2H, Z-NH-(CH2)3CH2-);
    3,20 (m, 2H, Z-NHCH2-);
    3,31 (t, 1H, ((CH3)3COCOCH2)2NCH-);
    3,46 (dd, 4H, ((CH3)3COCOCH2)2N-);
    5,07 (s, 2H, (C6H5)CH2OCONH-);
    5,13 (t, 1H, (C6H5)CH2OCONH-);
    7,33 (m, 5H, (C6H5)CH2-);
    MS (MALDI, ESI, C30H48N2O8); MH+ 565
  • Eine Lösung von 1,00 g (1,8 mmol) 2 in Methanol (50 ml), wird mit Stickstoff gespült und dann 20 mg 10% Pd/C hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter Wasserstoff-Athmosphäre 6 Stunden lange bei Raumtemperatur heftig gerührt. Pd/C wird durch Filtration über Celite entfernt und die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt. Ausbeute: 0,74 g (1,7 mmol) Nα,Nα-Bis[(tert-butyloxycarbonyl)methyl]L-Lysin tert-Butylester (3), 94% der Theorie. TLC: Rf = 0,3 in Chloroform/methanol (3:1).
    1H NMR (250MHz, CDCl3); δ:
    1,44 (s, 18H, ((CH3)3COCOOCH2)2N-);
    1,47(s, 9H, (CH3)3COCOCH-);
    1,51 (m, 4H, NH2CH2-CH2-CH2-)
    1,62 (m, 2H, Z-NH-(CH2)3CH2-);
    2,69 (t, 2H, Z-NHCH2-);
    3,31 (t, 1H, ((CH3)3COCOCH2)2NCH-);
    3,47 (dd, 4H, ((CH3)3COCOCH2)2N-);
    MS (MALDI, ESI, C22H42N2O6); MH+ 431
  • B) Synthese von Bis-NTA-OtBu (6) (siehe auch 25)
  • 3 (1,00 g; 2,3 mmol) wird in trockenem Dichlormethan (40 ml) aufgelöst, und dann 4 (0,29 g; 1,0 mmol), TBTU (0,96 g; 2,9 mmol) und DIPEA (0,6 ml; 3,5 mmol) hinzugegeben. Die erhaltene Aufschlämmung wird mit Stickstoff gespült und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Komponenten werden dann im Vakuum entfernt, der Rückstand wird mit Dichlormethan (100 ml) aufgeschlämmt und 3x mit MQ Wasser (jeweils 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über eine Kieselgelsäule mit Ethylacetat/Cyclohexan (3:1) als Laufmittel gereinigt. Ausbeute: 0,99g (0,9 mmol) Z-Bis-NTA-OtBu (5), 90 % d. Theorie. TLC: Rf = 0,3 in Cyclohexan/Ethylacetat (3:1).
    1H NMR (250MHz, CDCl3); δ:
    1,43 (s, 36H, ((CH3)3COCOCH2)2N-);
    1,45(s, 18H, (CH3)3COCOCH-);
    1,47–1,65 (m, 12H, (CH3)3COCOCH(CH2)3-)
    1,96–2,04 (m, 2H, Z-NHCHCH2CH2-);
    2,22–2,30 (m, 2H, Z-NHCHCH2-);
    3,14–3,22 (m, 6H, and ((CH3)3COCOCH2)2NCH(CH2)3CH2-);
    3,46 (dd, 8H, ((CH3)3COCOCH2)2N-);
    4,17 (m, 1H, Z-NHCH-);
    5,03 (s, 2H, (C6H5)CH2OCONH-);
    6,40 (d, 1H, Z-NH)
    6,53 (t, 1H Z-NHCHCONH-)
    6,99 (t, 1H Z-NHCH(CH2)2CONH-)
    7,28 (m, 5H, (C6H5)CH2-);
    MS (MALDI, ESI, C57H95N5O16); MH+ 1107
  • Die Z-Schutzgruppe von 5 (1,00 g; 0,90 mmol) wird hydrogenolytisch entfernt wie oben für 2 beschrieben. Ausbeute: 0,83 g (0,85 mmol) Bis-NTA-OtBu (6), 94 % d.Th.. TLC: Rf = 0,3 in Chloroform/Methanol (5:2).
    1H NMR (250MHz, CDCl3); δ:
    1,43 (s, 36H, ((CH3)3COCOCH2)2N-);
    1,45(s, 18H, (CH3)3COCOCH-);
    1,47–1,65 (m, 12H, (CH3)3COCOCH(CH2)3-)
    2,0–2,1 (m, 2H, Z-NHCHCH2-);
    2,37–2,44 (m, 2H, Z-NHCHCH2CH2-);
    3,2–3,3 (m, 6H, and ((CH3)3COCOCH2)2NCH(CH2)3CH2-);
    3,36–3,50 (dd, 8H, ((CH3)3COCOCH2)2N-);
    3,56 (t, 1H, Z-NHCH-);
    5,03 (s, 2H, (C6H5)CH2OCONH-);
    6,88 (t, 1H Z-NHCH(CH2)2CONH-)
    7,68 (t, 1H Z-NHCHCONH-)
    MS (MALDI, ESI, C49H89N5O14); MH+ 973
  • C) Synthese von Tetrakis-NTA-OtBu (8) (siehe auch 25)
  • 6 (1,00 g; 1,03 mmol) wird in trockenem Dichlormethan (30 ml) aufgelöst, und dann 4 (130 mg; 0,46 mmol), TBTU (1,40 mmol; 450 mg) und DIPEA (0,44 ml; 2,6 mmol) hinzugegeben. Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit Stickstoff gespült und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Komponenten werden dann im Vakuum entfernt, der Rückstand wird mit Dichlormethan (100 ml) aufgeschlämmt und 3x mit MQ Wasser (jeweils 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über eine Kieselgelsäule mit Ethylacetat als Laufmittel gereinigt. Ausbeute: 0,70 g (0,32 mmol) Z-Tetrakis-NTA-OtBu (7), 70% d. Th. TLC: Rf = 0,3 in Ethylacetat.
    MS (MALDI, ESI, C111H189N11O32); MH+ 2189
  • Die Z-Schutzgruppe von 7 (1,00 g; 0,46 mmol) wird hydrogenolytisch entfernt wie oben für 2 beschrieben. Ausbeute: 0,86 g (0,42 mmol), 91%.Tetrakis-NTA-OtBu (8), 91 % d.Th.. TLC: Rf = 0,3 in Chloroform/Methanol (5:3).
    MS (MALDI, ESI, C103H183N11O30); MH+ 2055
  • D) Synthese von Tris-NTA-OtBu (17 bzw. 18) (siehe auch 26)
  • Bromessigsäure tert-Butylester (5,9 ml; 40 mmol) und DIPEA (8,6 ml; 50 mmol) werden zu einer Lösung von H-Glu(OtBu)-OBzl 13 (3,3 g; 10 mmol) in DMF (75 ml) gegeben. Der Reaktionskolben wird mit Stickstoff gespült und dann über Nacht bei 55°C gerührt. Die flüchtigen Komponenten werden in vacuo bei 60°C abgezogen. Der Rückstand wird in Ethylacetat (20 ml) aufgeschlämmt, abfiltriert und dreimal mit Cyclohexan:Ethylacetat (3:1, 3 × 40 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert und über eine Kieselgelsäule mit Cyclohexan/Ethylacetat (3:1) als Laufmittel gereinigt. Ausbeute: 4,6 g (8,8 mmol) Bzl-Glu-NTA (14), 88% d. Th. TLC: Rf = 0,6 in Cyclohexan/Ethylacetat (3:1)
    MS (MALDI, ESI, C28H43NO8); MH+ 522
  • Die Bzl-Schutzgruppe von 14 (1,00 g; 1,9 mmol) wird hydrogenolytisch entfernt, wie oben für die Entfernung der Z-Schutzgruppe von 2 beschrieben. Ausbeute: 0,76 g (1,76 mmol) Glu-NTA (15), 92% d. Th. TLC: Rf = 0,4 in Chloroform/Methanol (3:2)
    MS (MALDI, ESI, C21H37NO8); MH+ 431
  • 15 (431 mg; 1,0 mmol) wird in trockenem Dichlormethan (30 ml) aufgelöst, und dann 16 (67 mg; 0,33 mmol), TBTU (417 mg; 1,3 mmol) und DIPEA (0,3 ml; 1,75 mmol) hinzugegeben. Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit Stickstoff gespült und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Komponenten werden dann im Vakuum entfernt, der Rückstand wird mit Dichlormethan (50 ml) aufgeschlämmt und 3x mit MQ Wasser (jeweils 15 ml) gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über eine Kieselgelsäule mit einem Gradienten von 100% Ethylacetat auf 50% Ethylacetat in Methanol in 5 Säulenvolumen gereinigt.
    Ausbeute: 0,37 g (0,26 mmol) Tris-NTA-OtBu (17), 79% d. Th. TLC: Rf = 0,5 in Ethylacetat/Methanol (3:1)
    MS (MALDI, ESI, C73H129N7O21); MH+ 1441
  • 17 (1,44 g; 1,0 mmol) wird in trockenem Chloroform (30 mL) gelöst, und Bernsteinsäureanhydrid (300 mg; 3,0 mmol) und TEA (0,7 ml; 5,0 mmol) hinzugegeben. Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit Stickstoff gespült und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Komponenten werden dann im Vakuum entfernt, der Rückstand wird mit Dichlormethan (120 ml) aufgeschlämmt und 3x mit MQ Wasser (jeweils 40 ml) gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über eine Kieselgelsäule mit einem Gradienten von 100% Ethylacetat auf 50% Ethylacetat in Methanol in 5 Säulenvolumen gereinigt. Ausbeute: 1,4 g (0,91 mmol) Tris-NTA-OtBu-COOH (18), 91 % d. Th. TLC: Rf = 0,4 in Ethylacetat/Methanol (3:1).
    MS (MALDI, ESI, C76H133N7O24); MH+ 1541
  • E) Synthese der Tris-NTA Fluoreszenz-Konjugate (siehe auch 26)
  • 17 (1,44 g, 1,0 mmol,) wird in trockenem Dichlormethan (30 mL) gelöst und dann BOC-ε-Aminocapronsäure (230 mg; 1,0 mmol), TBTU (450 mg; 1,40 mmol) and DIPEA (0,33 ml; 1,9 mmol) hinzugegeben. Die Reaktionslösung wird mit Stickstoff gespült und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Komponenten werden dann im Vakuum entfernt, der Rückstand wird mit Dichlormethan (70 ml) aufgeschlämmt und 3x mit MQ Wasser (jeweils 25 ml) gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über eine Kieselgelsäule mit einem Gradienten von 100% Ethylacetat auf 10% Ethylacetat in Methanol in 5 Säulenvolumen gereinigt. TLC: Ausbeute: 1,4 g (,84 mmol) Tris-NTA-OtBu-Aminocapronsäure-BOC (19), 84 % d.Th. Rf = 0,3 in Ethylacetat
    MS (MALDI, ESI, C84H148N8O24); MH+ 1654
  • 19 (500 mg; 0,3 mmol) wird in Dichlormethan mit 10% TFA und 1% 1,2-Ethandithiol gelöst und 1 h gerührt. Dann wird das Produkt mit Ether ausgefällt. Ausbeute 300 mg (0,3 mmol) Tris-NTA-Aminocapronsäure (20), 95% d.Th.
    MS (MALDI, ESI, C43H68N8O22); MH+ 1049
  • 20 (10 mg; 0,05 mmol) wird in 100 μl DMF gelöst und mit einer stöchiometrischen Menge eines NHS-Aktivester des entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffs versetzt. Nach 12 Stunden wird das Prdukt zunächst über präparative Dünschichtchromatographie und dann über Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt.
    OG 488-Tris-NTA (21)
    MS (MALDI, ESI, C64H65F2N8O28); MH+ 1432
    ATTO 565-Tris-NTA (22)
    MS (MALDI, ESI, C74H87N10O26); MH+ 1532
    FEW-S0387 Tris-NTA (23)
    MS (MALDI, ESI, C78H101N10O29S2); MH+ 1706
  • F) Synthese des Bis-NTA Lipid-Konjugats (12) (siehe auch 25)
  • Ocatadecylamine (2,7 g; 10 mmol), 1-Bromo-cis-9-octadecen (3,3 g; 10 mmol) und TEA (7 ml, 50 mmol) werden gemischt. Der Reaktionskolben wird mit Stickstoff gespült und bei 55 C 2 Tage gerührt. Das Rohprodukt wird in Chloroform (200 ml) gelöst und 3x mit Wasser gewaschen (jeweils 50 ml). Die organische Phase wird eingeengt und über eine Kieselgelsäule mit einem Gradienten von 100% Chloroform auf 60%Chloroform in Methanol über 5 Säulenvolumen gereinigt. Ausbeute: 2,1 g (4,05 mmol) Steroyl-Oleoyl-Amin, SOA (9), 40% d. Th..
    1H NMR (250MHz, CDCl3); δ:
    0,89 (t, 6H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3);
    1,27 (s, 52H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    1,91 (q, 4, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    2,01 (q, 4, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    2,94 (t, 4, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    5,36 (q, 2, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    MS (MALDI, ESI, C36H73N); MH+ 521
  • Bernsteinsäureanhydrid (0,60 g; 6 mmol) und TEA (2,5 ml; 18 mmol) werden zu einer Lösung von 9 (1,04 g; 2 mmol) in Chloroform (50 ml) gegeben. Der Reaktionskolben wird mit Stickstoff gespült und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Rohprodukt wird mit MQ-Wasser gewaschen (4 × 40mL). Die organische Phase wird getrocknet, aufkonzentriert und mit Aceton gefällt. Ausbeute: 1,18g (1,9 mmol) SOA-COOH (10), 95% d.Th.
    1H NMR (250MHz, CDCl3); δ:
    0,88 (t, 6H,CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3);
    1,27 (s, 52H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    1,54 (q, 4H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    2,00 (q, 4H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    2,69 (t, 4H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    3,22 (t, 2H, OHCOCH2CH2CONH-)
    3,30 (t, 2H, OHCOCH2CH2CONH-)
    5,34 (q, 2, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    MS (MALDI, ESI, C40H77NO3); MH+ 620
  • 10 (530 mg; 0,85 mmol) wurde in trockenem Dichlormethan(30 ml) gelöst, und dann 6 (834 mg; 0,86 mmol), TBTU (413 g, 1,29 mmol) und DIPEA (0,3 ml, 1,76 mmol) hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde mit Stickstoff gespült und für 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Komponenten werden dann im Vakuum entfernt, und der Rückstand mit Dichlormethan (30 ml) aufgenommen. Nach Waschen mit MQ Wasser (3 × 30ml) wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die flüchtigen Komponenten werden dann im Vakuum entfernt und der Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Ethylacetat (3:2) aufgereinigt. Ausbeute: 0,97 g (0,61 mmol) SOA-Bis-NTA-OtBu (11), 71 % d. Th. TLC: Rf = 0,6 in Chloroform/Ethylacetat (3:2).
    1H NMR (250MHz, CDCl3); δ:
    0,87 (t, 6H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    1,25 (s, 52H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    1,45 (s, 36H, ((CH3)3COCOCH2)2N-);
    1,46(s, 18H, (CH3)3COCOCH-);
    1,47–3,5 (H)
    4,37 (m, 1H, NHCH-)
    5,34 (q, 2, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    6, 5 8 (t, 1H, NH)
    7,42 (t, 1H, NH)
    7,61 (t, 1H, NH)
    MS (MALDI, ESI, C89H16 4N6O16); MNa+ 1592
  • 11 (500 mg; 0,32 mmol) wird in Dichlormethan mit 10% TFA und 1% 1,2-Ethandithiol gelöst und 1 h gerührt. Dann wird das Produkt mit Ether ausgefällt. Ausbeute: 370mg (0,3 mmol) SOA-Bis-NTA (12), 94% d.Th.
    1H NMR (250MHz, CDCl3); δ:
    0,87 (t, 6H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    1,25 (s, 52H, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    1,47–3,5 (H)
    5,03 (m, 1H, NHCH-)
    5,34 (q, 2, CH3(CH2)15CH2CH2NHCH2CH2(CH2)5CH2CHCHCH2(CH2)6CH3)
    MS (MALDI, ESI, C65H111N6O16); MH+ 1233

Claims (27)

  1. Verbindung der allgemeinen Formel Xm-G-CLn worin G eine Gerüst-Struktur, umfassend eine gesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 20 Kohlenstoff-Atomen, weiterhin umfassend Amid-, Ester- und/oder Etherbindungen, X eine Kupplungsgruppe für eine Sonde oder Funktionseinheit F, CL eine Chelator-Gruppe mit einem Metall-Koordinationszentrum, m eine ganze Zahl und mindestens 1 und n eine ganze Zahl und mindestens 2 ist, und Tautomere, Isomere, Anhydride, Säuren und Salze davon.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils ein Metallion an den Chelator-Gruppen gebunden ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei das Metallion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn29, Fe2+, Fe3+ und allen Lanthanidionen.
  4. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Chelator-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nitrilotriessigsäure (NTA), Iminodiessigsäure (IDA), Porphyrinsystemen, Salicylsäurederivaten, 1,2-Diaminoethyldiessigsäure, Diaminoethyltriessigsäure, Hydroxyethyliminodiessigsäure und Salzen oder Kombinationen davon sind.
  5. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die reaktiven Gruppen der Chelator-Gruppe Schutzgruppen tragen.
  6. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen CL und G eine Abstandsgruppe A befindet.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, wobei A linear oder verzweigt ist.
  8. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Chelator-Gruppen über Amid-, Ester- oder Etherbindungen an G gebunden sind.
  9. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß G linear, verzweigt oder geschlossen ist.
  10. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche ausgewählt aus
    Figure 00370001
    und Tautomeren, Isomeren, Anhydriden, Säuren und Salzen davon.
  11. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplungsgruppe X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NHR, worin R H, Alkyl oder Aryl ist, COOH, (CH2)n-COOH, worin n eine ganze Zahl ist, SH, Maleimid, Acetamid, Isothiocyanat oder Cyanat.
  12. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Sonde oder Funktionseinheit F an der Kupplungsgruppe X gebunden ist.
  13. Verbindung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde oder Funktionseinheit F ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluorophoren, FRET-Fluorophoren, Fluoreszenzlöschern, phosphoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindungen, absorbierenden Verbindungen, Polymeren, PEG, Oligosacchariden, Oligonukleotiden, PNA, Biotin, Haptenen, Peptiden, Proteinen, Enzymen, quervernetzenden Mitteln, Oligoethylenglykol, Lipiden, Nanopartikeln, Elektronendichteverstärkern, Goldclustern, Metallclustern, Quantendots und Kombinationen davon.
  14. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus
    Figure 00380001
    Figure 00390001
    und Tautomeren, Isomeren, Anhydriden, Säuren und Salzen davon.
  15. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Kupplung von mindestens 2 Chelator-Gruppen an die Gerüst-Struktur nach oder während der Synthese der Gerüst-Struktur.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, umfassend die Synthese der Gerüst-Struktur aus einer oder mehreren Ausgangsverbindungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus geschützten oder ungeschützten Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten, Z-Lys-OtBu, H-Glu(OtBu)-OBzl, Z-Glu-OH, makrocyclischen Polyaminen, 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan, Bromessigsäure-OtBu, BOC-ε-Aminocapronsäure.
  17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Chelator-Gruppen geschützt sind.
  18. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–14 zur Bindung an einen Affinitäts-Tag an einem Zielmolekül, wobei der Affinitäts-Tag an Metall-Chelatoren-Komplexe bindet.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Affinitäts-Tag um einen Peptid-Tag handelt, der 4 bis 15 Aminosäuren umfaßt, umfassend 4–15 Histidine und 0–4 basische Aminisäuren.
  20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei es sich bei dem Zielmolekül um ein Peptid, Polypeptid, Protein, Peptid- oder Protein-Mimetikum oder peptidmodifiziertes Polymer oder Dendrimer handelt.
  21. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–14 zur Modifizierung, Kopplung, Oligomerisierung, Detektion, Beobachtung, Analyse oder zum Nachweis von Zielmolekülen in vitro, in vivo, in situ, in lebenden Zellen oder in Lipidvesikeln.
  22. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–14 zur Immobilisierung von Zielmolekülen.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen auf einer Oberfläche gebunden oder in einer Lipid-Mono- oder Doppelschicht eingefügt sind.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Oberfläche ausgewählt ist aus Glastyp-Oberflächen, Gold, Silber, DAPEG-modifiziertem Glas, PEG-Polymer-modifiziertem Glas oder Gold, GOPTS-silanisiertem Glas, Glastyp- und Goldoberflächen mit Lipid-Mono- oder Doppelschicht, Metall-Seleniden, -Telluriden und -Sulfiden.
  25. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–14 zur Herstellung von selbst-assemblierten Monoschichten (SAM).
  26. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–14 zur Herstellung von funktionell mikro- und nanostrukturierten Oberflächen und/oder vor Protein-Arrays.
  27. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1–14 zur Reinigung von Zielmolekülen.
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