DE10064896A1 - Schaltbare biochemische Pinzetten und synthetische Rezeptoren zur molekularen Organisation und Manipulation von Biomolekülen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Aminosäuren der allgemeinen Formel DOLLAR F1 wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 und DOLLAR A m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist DOLLAR A und die Aminosäure einen kovalent gebundenen Metall-Chelator umfasst und der Chelator eine koordinative Wechselwirkung zu einer Aminosäure aufbauen kann, bevorzugterweise zu Histidin.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine einen kovalent gebundenen Metall-Chelator umfassende Aminosäure, ein diese enthaltendes Polypeptid, diese betreffende Verwendungen sowie diese umfassende Proteinkomplexe.

Moderne strukturbiologische Techniken haben unsere Kenntnisse über die Struktur und Funktion von Biomolekülen dramatisch erhöht. Nichtsdestotrotz ist das Konstruieren eines Proteins mit definierten oder modifizierten Funktionen nach wie vor mit sehr großen Schwierigkeiten verbunden. Einen mit der Proteinstruktur verbundenen, sowohl aus wissenschaftlicher als auch biotechnologischer, d. h. anwendungsorientierter, Sichtweise betrachtet, besonders wichtigen Aspekt stellt die Protein-Protein-Wechselwirkung dar, deren Modifikation und gegebenenfalls Steuerung eine Vielzahl neuer Anwendungen erlauben würde.

Eine erste Form der Anwendung von Protein-Protein-Wechselwirkungen finden sich auf dem Gebiet der Affinitätschromatographie. Dort wird das Wissen ob der für eine Bindung zwischen zwei bekanntermaßen wechselwirkenden Bindungspartnern relevanten Strukturen insoweit ausgenutzt, als daß die für die Wechselwirkung verantwortliche Struktur des einen Partners an ein zu reinigendes Protein gebunden und somit ein Fusionsprotein ausgebildet wird, das dann mit dem typischerweise an eine Oberfläche immobilisierten anderen Wechselwirkungspartner spezifisch bindet. Derartige Beispiele sind die in der Literatur bekannten Glutathion-S-Transferase- (Guan, K. L. et al., Anal Biochem 192, 262-267 (1991)) sowie Strep-Systeme (Skerra, A. et al., Biomol Eng 16, 79-86 (1999).

Eine weitere Form der Affinitätschromatographie, die sich der Wechselwirkung zweier spezifischer Bindungspartner bedient, ist die Immobilisierungsmetall- Affinitätschromatographie (IMAC) (Porath J., Nature 258, 598-599 (1975)). IMAC verwendet im Gegensatz zu den vorstehend vorgestellten Affinitätssystemen ein System, welches kleine organische Moleküle wie Iminodiessigsäure (IDA) oder N-Nitrilo­ triessigsäure (NTA) als Chelatoren verwendet, die vermittels koordinativer Bindungen eine Histidin-Markierung binden können. Eine derartige Histidin-Markierung besteht typischerweise aus 5 bis 12 Histidinresten, die entweder am N- oder am C-Terminus des interessierenden Proteins angeordnet sind. Obwohl IDA und NTA die Histidin-Markierung mit einer Affinität von 1-10 µM binden (Dorn et al., Biol Chem 379: 1152-9; Nieba et al., Anal. Biochem. 252: 217-28), erlauben stärkere Chelatoren wie EDTA oder Kompetitoren wie Imidazol die quantitative Desorption des Fusionsproteins. Es ist jedoch nicht möglich, die Bindung per se oder die Stärkung der Immobilisierung zuverlässig vorherzusagen und damit auch nicht die Menge des erforderlichen Kompetitors für die Deimmobilisierung. Die Optimierung eines Reinigungsprotokolls unter Verwendung von IMAC basiert somit im wesentlichen auf dem Prinzip von Versuch und Irrtum.

Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, Verbindungen bereitzustellen, die eine hochaffine und spezifische Bindung eines Bindungspartners, insbesondere eines Proteins erlauben und gleichzeitig die Elution in zuverlässiger und vorhersagbarer Weise erlauben.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Aminosäure der allgemeinen Formel

wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 und
m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist,
und die Aminosäure einen kovalent gebundenen Metall-Chelator umfasst, wobei der Chelator eine koordinative Wechselwirkung zu einer Aminosäure aufbauen kann, bevorzugterweise zu Histidin.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß auch gelöst durch eine Aminosäure der allgemeinen Formel

wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 und
m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist,
und die Aminosäure einen kovalent gebundenen Metall-Chelator umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die Iminodiessigsäure, alle Salze der Iminodiessigsäure, Iminodiessigsäure- tert.butylester und deren Derivate umfasst.

Des weiteren wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Aminosäure der allgemeinen Formel

wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 und
m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist,
und die Aminosäure einen kovalent gebundenen Metall-Chelator umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die N-Nitrilotriessigsäure, alle Salze der N-Nitrilotriessigsäure, N- Nitrilotriessigsäure-tert.butylester und deren Derivate umfasst.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Aminosäuren ist vorgesehen, dass der Metall-Chelator über die Seitenkette R der Aminosäure gebunden ist, wobei die Seitenkette bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe, die (CH2)_x und (CH2-CH2-O)_y umfasst und x eine ganze Zahl zwischen 0 und 5 und y unabhängig eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Lysin umfasst.

In einer nochweitern Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure Lysin ist und der Metall-Chelator über die ε-Aminogruppe der Lysin-Seitenkette kovalent gebunden ist, wobei der Stickstoff der Iminogruppe des Metall-Chelators aus der ε-Aminogruppe der Lysin- Seitenkette stammt.

Die Aufgabe wird auch gelöst durch eine Aminosäure mit der Formel:

und deren Derivate

Des weiteren wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Aminosäure mit der Formel:

und deren Derivate

Bei den erfindungsgemäßen Aminosäure kann vorgesehen sein, dass die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Benzyloxycarbonylgruppe, die tert.-Butoxycarbonylgruppe, die 9- Fluorenylmethoxycarbonylgruppe die Triphenylmethylgruppe und die Nitrobenzolsulfenylgruppe umfasst, und/oder die Carboxylgruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Methylgruppe, die Ethylgruppe, die Benzylgruppe, die 4-Nitrobenzylgruppe und die tert.-Butylestergruppe umfasst.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß auch durch ein Polypeptid gelöst, das mindestens eine der erfindungsgemäßen Aminosäure umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polypeptid mindestens ein Metall-Kation umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Metall-Kation ausgewählt ist aus der Gruppe, die Ni²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Co³⁺, Fe²⁺ und Fe³⁺ umfasst.

Weiterhin kann vorgesehen sein, dass das erfindungsgemäße Polypeptid einen kovalent gebundenen Fluorophor umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fluorophor ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fluorescein, Rhodamine, Cy3, Cy5, DODIPY-Derivate und NBD-Farbstoffe umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass mindestens ein Metall-Chelator "gecaged" ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, mindestens ein Metall-Chelator mit einem α-Carboxy-2-nitrobenzyl-Rest (CNB) "gecaged" ist.

In einer alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Polypeptidhauptkette über mindestens ein Azobenzolderivat verbrückt ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid kann vorgesehen sein, es kovalent mit einem membranpermeablen Peptid verknüpft ist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch gelöst durch die Verwendung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung zum Markieren von Proteinen.

In einer Ausführungsform ist dabei vorgesehen, die zu markierenden Proteine intrazelluläre Proteine sind.

In einer weiteren Ausführungsform der Verwendung ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Polypeptids zur Dimerisierung und/oder Oligomerisierung von Proteinen verwendet wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, das Polypeptid kovalent an einen Cysteinrest in dem zu dimerisierenden/oligomerisierenden Protein gebunden ist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch gelöst durch die Verwendung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung zur kontrollierten Immobilisierung von Proteinen an Oberflächen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß auch gelöst durch die Verwendung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Rastersonden-mikroskopischen Techniken zur strukturierten Assemblierung von Proteinen an Oberflächen.

Schließlich wird die Aufgabe erfindungsgemäß auch durch einen Proteinkomplex gelöst, der umfasst:

• - ein erstes Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung,
• - mindestens ein Kation, das von einer Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung komplexiert ist, und
• - ein zweites Polypeptid, das mindestens ein Histidin umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Kation ausgewählt ist aus der Gruppe, die Ni²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Co³⁺, Fe²⁺ und Fe³⁺ umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das zweite Polypeptid eine Anzahl von Histidinen umfasst, die im Bereich von 1-8 liegt.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das zweite Polypeptid die Sequenz (His)_x umfasst, wobei x im Bereich von 1-8 liegt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß sich die nicht natürliche Aminosäure nach Formel I

wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 und
m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist,
die einen kovalent gebundenen Chelator aufweist, für die reversible Immobilisierung von Histidin-markierten Fusionsproteinen eignet. Als Chelatoren sind dabei besonders bevorzugt Iminodiessigsäure (hierin auch als IDA bezeichnet) und N-Nitrilotriessigsäure (hierin auch als NTA bezeichnet). Grundsätzlich umfaßt die Erfindung all jene Aminosäurederivate, die in der Lage sind, koordinative Wechselwirkungen zu Aminosäuren, wie z. B. Histidin, aufzubauen. In der aktiven Form liegt die Aminosäure als variabler Baustein von Peptiden und Proteinen in der ungeschützten und unkomplexierten Form vor, beispielsweise als Iminodiessigsäure (IDA)- oder N-Nitrilotriessigsäure (NTA)-Derivat vor. Für den Fall des Einbaus in synthetische Peptide, wie dies in den Beispielen beschrieben ist, werden die erfindungsgemäßen Chelator-Aminosäuren geschützt. Hierfür werden bevorzugt die tert.Butylestergruppen oder andere Schutzgruppen, die in der Technik bekannt sind, eingesetzt. Für die Peptidfestphasen-Synthese (Fmoc- oder Boc-Verfahren) wird typischerweise die Aminogruppe der Chelator-Aminosäure mit Fmoc oder Boc geschützt. Im Rahmen einer in vitro Proteintranslation werden die ungeschützten Chelator-Aminosäuren eingesetzt.

Neben der direkten Anwendung dieser einen Chelator aufweisenden Aminosäure, hierin auch als Chelator-Aminosäure bezeichnet, ist insbesondere auch deren Einbau in eine Aminosäuresequenz, d. h. ein Peptid bzw. Protein möglich. Derartige hierin als Chelator- Peptide bzw. -Proteine bezeichneten Peptide bzw. Proteine erlauben ihrerseits eine gezielte, über Metallionen schaltbare, koordinative intra- und intermolekulare Wechselwirkung mit Histidinen, Oligohistidinen-Sequenzen, Histidin-markierten Proteinen, insbesondere Fusionsproteinen. Diese Wechselwirkung kann beispielsweise für den Nachweis oder die Aufreinigung derartiger Fusionsproteine verwendet werden. Schließlich kann ein derartiges System dazu verwendet werden, Proteine mit einstellbaren Funktionen oder neuen Protein- Protein-Wechselwirkungen zu konstruieren.

Durch die Synthese der erfindungsgemäßen Metall-Chelat-Aminosäuren und den Einbau mehrerer solcher Bausteine in eine Polypeptidstruktur können die Metall-Chelat- Seitengruppen in definierter Orientierung präsentiert werden. So werden multiple Wechselwirkungen zwischen Histidin-markierten Proteinen mit Metall-Chelat-Peptiden ermöglicht. Aus der höheren Bindungsaffinität leitet sich eine besonders stabile Immobilisierung ab. Aufgrund der Reversibilität des Prozesses wird die Voraussetzung zur wiederholten Beladung und Regeneration der Metall-Chelat-Peptide geschaffen, was vor allem im Bereich der Immobilisierung, der Organisation und Manipulation von Proteinen sowie der Sensorik von großer Bedeutung ist. Beispielhaft seien in diesem Zusammenhang genannt Nanobiotechnik, funktionelle Proteomanalyse, Protein-Chips, Biosensorik, High- Throughput-Screeening, Drug Screening (Wirkstoff-Screening), funktionelle Grenzschichten und Proteinassays.

Bei den die erfindungsgemäße Aminosäure enthaltenden Peptiden ist dabei vorgesehen, diese durch Variation von Sequenz und Struktur so auszubilden, daß möglichst viele der freien Koordinationsstellen gleichzeitig mit Histidinen des Bindungspartners wechselwirken. Durch die multivalenten, koordinativen Wechselwirkungen kann die Bindungsaffinität und - spezifität um mehrere Größenordnungen gesteigert werden. Mittels kombinatorischer und evolutiver Methoden und der erfindungsgemäßen Aminosäure werden hochaffine und hochspezifische Paarungssysteme (sogenannte biochemische Pinzetten) aufgebaut. Dabei sind bevorzugt Paarungssysteme mit mindestens zwei Metallkomplexen, die durch eine in Länge und Aminosäureabfolge variable Peptidsequenz voneinander getrennt sind. Somit werden multivalente Wechselwirkungen von definiert in einem Molekül angeordneten Chelator- Gruppen ausgenutzt.

Auf Seiten der rekombinanten, mit einer Histidin-Markierung versehenen Peptiden oder Proteinen wird dabei angestrebt, die Zahl der Histidin-Reste zu minimieren, um dadurch eine maximale Selektivität zu erreichen und die Struktur der Peptide für den Erkennungsvorgang zu optimieren.

Die die erfindungsgemäße Aminosäure enthaltenden Peptide bzw. Proteine werden somit Chelatoren in einem distinkten Abstand zueinander aufweisen, so daß es, vereinfacht ausgedrückt, möglich sein wird, daß die in der Aminosäuresequenz enthaltenden zumindest zwei Chelatoren eine Struktur ausbilden, die das mit Histidin-Resten versehene Molekül umgreifen. Eine derartige Peptid- bzw. Proteinstruktur weist sowohl die Gestalt als auch die Funktion einer Pinzette auf und wird daher hierin auch als molekulare Pinzette bezeichnet. Diesen molekularen Pinzetten kann eine Schaltbarkeit, bevorzugterweise eine optische oder elektrochemische Schaltbarkeit, verliehen werden, um in Abhängigkeit von den Versuchsbedingungen die Relativposition der beiden Chelatoren relativ zueinander bzw. relativ zu den Histidin-Resten zu ändern. Dabei bestehen als drei grundsätzliche Möglichkeiten das sogenannte "caging" der Carboxylgruppen der Chelatorfunktionen, die Strukturumwandlung über optische Anregung und das Schalten der Chelator-Aminosäuren durch Zugabe oder Komplexierung von Metallionen. Durch "Caged-EDTA" als Kompetitor könnten die biochemischen Pinzetten durch Licht abgeschaltet werden. Eine noch weitere Möglichkeit der Schaltung und lateralen Strukturierung der Paarungssysteme besteht in der elektrochemischen Kontrolle und AFM, wie hierin ebenfalls beschrieben.

Im Falle des "caging" ist insbesondere der im Stand der Technik als solches bekannte α- Carboxy-2-nitrobenzyl-Rest (CNB) geeignet, der die Wasserlöslichkeit der Komponenten erhält und sich mit extrem hohen "uncaging"-Raten entfernen lässt. Der CNB-Rest wird zur irreversiblen, photoinduzierten Aktivierung oder Deaktivierung von Verbindungen verwendet. Im Falle der erfindungsgemäßen Chelator-Aminosäuren werden die Carboxygruppen des Chelators zunächst mit CNB geschützt. In dieser Form ist die Chelator- Aminosäure nicht in der Lage, Metallionen zu komplexieren und koordinative Wechselwirkungen auszubilden. Durch einen Lichtblitz (msec) wird die Schutzgruppe entfernt und somit die biochemische Pinzette aktiviert. Aufgrund der extremen Lichtempfindlichkeit und chemischen Labilität dieser Verbindungen ist es sinnvoll, die Chelator-Gruppen erst nach Synthese der biochemischen Pinzetten mit "caging"-Reagenzien umzusetzen.

Als zweite Möglichkeit bietet sich die Verbrückung des Peptidgerüsts über Azobenzol- Derivate an, wobei die Struktur der biochemischen Pinzetten durch optische Isomerisierung moduliert wird (Kumita et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97: 3803-8). Im Gegensatz zur vorstehend beschriebenen "caging"-Strategie, die nichtsdestotrotz in ihrer Anwendung von Vorteil ist und bei der die Chelator-Gruppen irreversibel aktiviert werden, werden bei diesem Verfahren Pinzetten und damit molekulare Werkzeuge bereitgestellt, die sich nahezu beliebig häufig optisch an- und abschalten lassen Da die Wechselwirkung der Paarungssysteme durch optimal zueinander im Raum angeordneten Chelator-Gruppen zustande kommt, gehen Änderungen der Raumstruktur der die Chelator-Aminosäure tragenden Peptide mit einer deutlichen Abnahme der Affinität einher, so dass es zu einem Zerfall des Komplexes aus molekularen Pinzetten und dem mit den Pinzetten gegriffenen Protein kommt. Änderungen in der Affinität um den Faktor 10 bis 100 sollten bei entsprechenden Randbedingungen ausreichen, um ein effektives Schalten zu realisieren. Peptide bzw. Proteine, die die erfindungsgemäße Aminosäure enthalten, eignen sich auch zur nanoskaligen Organisation von Proteinen. Dabei wird eine Konjugation mit molekularen Funktionseinheiten, eine Oberflächenmodifikation und Immobilisierung sowie eine Nano-strukturierte Assemblierung an Oberflächen möglich.

Im Falle der Konjugation mit molekularen Funktionseinheiten kann es zur Ausbildung von supramolekularen Funktionseinheiten kommen, wobei beispielsweise eine universelle Fluoreszenzmarkierung von rekombinanten, d. h. mit einer His-Markierung versehenen Proteinen über Fluorophor-gekoppelte Pinzetten möglich ist, Proteinkonjugierte Pinzetten zur schaltbaren Assemblierung von Proteinkomplexen und schließlich dimere Pinzetten für nicht-invasiv kontrollierte Dimerisierung von Proteinen in vivo verwendet werden können. Im ersten Falle können durch Anbindung von Fluorophoren an die erfindungsgemäßen biochemischen Pinzetten generische Fluoreszenzsonden zur selektiven Markierung von Proteinen realisiert werden. Dabei ist vorgesehen, daß durch Modifikation der biochemischen Pinzetten mit zellpermeablen Peptiden diese durch die Zellmembran in das Cytoplasma transferiert werden, um intrazelluläre Proteine zu markieren.

Die kontrollierte Dimerisierung oder Oligomerisierung von Proteinen in vitro kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung dadurch erfolgen, daß die biochemischen Pinzetten über freie Cysteine ortsspezifisch in Proteine eingeführt werden Die biochemischen Pinzetten sind in diesem Fall die Peptide (optimierte Paarungssysteme) mit mehreren Chelator- Aminosäuren. Durch Einführung einer Cystein-reaktiven Gruppe können die Chelator-Peptide mit Proteinen verknüpft und so neuartige Paarungssysteme aufgebaut werden. In einer hierzu abgewandelten Form werden in Zellen derartige Reaktionen nicht-invasiv gesteuert, indem dimere biochemische Pinzetten verwendet werden, die, wie oben ausgeführt, durch Ergänzung der Sequenz eines zellpermeablen Peptids ins Cytoplasma transportiert werden.

Ein weiterer Verwendungspunkt der Peptide bzw. Proteine, die die erfindungsgemäße Aminosäure enthalten, liegt in der kontrollierten und orientierten Organisation von rekombinanten Proteinen, insbesondere an planaren Oberflächen. Als Substrate bieten sich dabei insbesondere Metalloxidoberflächen, wie Glimmer, Glas, Quarz, Indium-Zinnoxid und Metalloberflächen, wie Gold oder Silber an, insbesondere für die Untersuchung der Schichten mit optischen oder elektrochemischen Sonden. Für die Detektion der spezifischen Wechselwirkung von Proteinen und anderen Substanzen mit immobilisierten Proteinen sind verschiedene markierungsfreie und markierungsbasierte optische und elektrochemische Verfahren publiziert. (Göpel & Sandstede, 1992, DECHEMA Monographs Vol. 126; Brecht et al. 1995, Biosens Bioelectron 10: 923-936; Brecht et al. in Biomolecular Interaction Analysis and Pharmaceutical Drug Screening, Baltes H., Göpel W. and Hesse J. (eds.), Wiley- VCH: Weinheim (D), (1998) Vol. 3 ISBN-No 3 527 29433.3). Dabei ist insbesondere die Immobilisierung der biochemischen Pinzetten an biokompatiblen Oberflächen in definierter Konstellation und Orientierung vorgesehen, wobei es die unspezifische Wechselwirkungen der Proteine mit der Oberfläche zu minimieren gilt. Dabei ist grundsätzlich die Verwendung nicht kovalenter, insbesondere Lipid-basierter Strategien, als auch kovalenter Strategien möglich.

Im Falle der Verwendung Lipid-basierter Strategien werden Konjugate der biochemischen Pinzetten mit Lipiden analog zu Chelator-Lipiden synthetisiert (Dietrich et al., 1996, Biochemistry 35: 1100-5; Dietrich et al., 1995; Proc Natl Acad Sci USA 92: 9014-8; Gritsch et al., 1995; Biosens Bioelctron 10: 805-12; Schmitt et al., 2000; Biophys J 78: 3275-85). Lipidschichten lassen sich mit Filmwaage-Techniken oder Vesikelfusion hochorientiert an Oberflächen assemblieren und lateral nanoskalig über Phasenseparation oder Mikroelektrophorese strukturieren (Dietrich et al., 1995; Proc Natl Acad Sci USA 92: 9014-8). Durch den Anteil an Lipiden, die mit biochemischen Pinzetten, d. h. mit Peptiden bzw. Proteinen, die die erfindungsgemäße Aminosäure nach Formel (I) tragen, verknüpft sind, wird die Konstellation systematisch variiert, um kooperative Effekte an der Oberfläche zu untersuchen und optimale Oberflächenkonstellationen festzulegen. Eine stabile Immobilisierung der biochemischen Pinzetten an Oberflächen wird durch kovalente Anbindung erreicht. Diese Art der Immobilisierung ist im Stand der Technik bekannt (Löfas et al., 1990; Soc Chem Comm 1990, 1526-1528; Prime et al., 1991; Science 252 (1991) 1164-­ 1167; Piehler et al., 1996; Biosens & Bioelectron 11 (1996) 579-590; Holmberg et al., 1991; Immobilization of proteins via PEG chains, in Harris J. M. (ed.), Poly(ehtylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications, Plenum Proess, New York 1992) Als Grenzschichten können molekulare Polymerschichten verwendet werden (z. B. Polyethylenglycol (PEG)), an deren terminalen funktionellen Gruppen die biochemischen Pinzetten selektiv über reaktive Gruppen (z. B. Cysteine) kovalent gekuppelt werden. Durch Anwendung von Printtechnologien (Kane et al., 1999, Biomaterials 20 (1999) 2363-2376; Fan et al., Nature 405 (2000) 56-60) wird auf dieser Basis die Herstellung von hochorientierten und funktionalen Protein-Arrays möglich.

Eine weitere Anwendung der die erfindungsgemäße Aminosäure enthaltenden Peptide bzw. Proteine ist die Nano-strukturierte Assemblierung an Oberflächen. Dabei handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um die Kombination der schaltbaren biochemischen Pinzetten, wie vorstehend dargelegt, mit Rastersonden-mikroskopischen Techniken. Durch die selektive Aktivierung immobilisierte Erkennungsstrukturen (biochemische Pinzetten) mit Rastersonden-mikroskopischen Techniken können Proteine strukturiert an Oberflächen immobilisiert und molekular organisiert werden. Derartige nanostrukturiert-dekorierte Oberflächen sind für die funktionale Charakterisierung von hoch aufgelösten Protein-Arrays sowie die Organisation supramolekularer Funktionseinheiten bedeutsam. Wie in Fig. 5 dargestellt, können durch elektrochemisches Erzeugen von Metallionen an der Spitze des Kantilevers immoblisierte Chelatoren nanostrukturiert dotiert und dadurch aktiviert werden. Proteine binden daraufhin selektiv an die Metallion-aktivierten Chelatoren entsprechend der lateralen Strukturierung, wie sie durch die Dotierung festgelegt wurde. Auf diese Weise lassen sich nahezu beliebig strukturierte Anordnungen erzeugen, deren Dimensionen in der Größenordnungen des Auflösungsvermögens der AFM-Sonde liegen, die als solche kommerziell erhältlich sind. Genauer gesagt werden in einem ersten Schritt Chelatpeptide über eine biokompatible Zwischenschicht (Polyethylenglykol, Lipidschicht) immobilisiert. In einem zweiten Schritt erfolgt eine lateral nanostrukturierte Aktivierung durch elektrochemische Ablösung von Metallionen (Ni²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Co ²⁺, Co³⁺, Fe²⁺, Fe³⁺ etc.) von der Oberfläche einer Metall-bedampften oder mit Metallionenkomplexen beschichteten AFM-Spitze. In einem dritten Schritt erfolgt die selektive Immobilisierung eines Proteins ausschließlich an den Metall-dotierten Chelatorgruppen. Schließlich erfolgt in einem vierten Schritt eine Assemblierung weiterer Proteine durch abwechselnde Wiederholung der Schritte 2 und 3. Neben Anwendungen für eine reine Nano-Strukturierung ermöglicht diese Technik, komplexe Funktionseinheiten an Oberflächen aufzubauen. Als Substrate eignen sich insbesondere Goldschichten und Schichten aus anderen Materialien wie Silber und Indium- Zinnoxid, die auch den Vorteil in sich tragen, daß sie gleichzeitig als Gegenelektroden für den elektrochemischen Prozeß dienen. Die standardmäßig verwendeten Kantilever (Si₃N₄) werden zuerst mit Gold und dann mit Nickel bedampft oder mit Metallionenkomplexen beschichtet, um davon Metallionen gezielt elektrochemisch abzulösen, wodurch die Chelatoren kontrolliert mit lateral nanoskaliger Auflösung aktiviert werden, was hierin gleichbedeutend mit einer lateralen Auflösung von 10 nm ist.

Aufgrund der hohen Affinität der Chelatoren, wie sie in den erfindungsgemäßen Aminosäuren und damit auch in den Chelator-Peptiden und -Proteinen verwendet werden, zu Ni²⁺ (10¹³ l/mol), sind minimale Mengen abgelösten Metalls ausreichend zur Aktivierung. Eine selektive Immobilisierung von Proteinen an den aktivierten Oberflächen kann parallel zur Aktivierung erfolgen und wird dann mit dem AFM abgebildet und kontrolliert. Proteine mit mehreren His₆-Markierungen, d. h. Markierungen bestehend aus sechs Histidin-Resten, wie z. B. das 205 Proteasom, auch rekombinante Antikörper, Enzyme, Rezeptoren u. a. (Baumeister et al., 1998; Cell 92: 367-380; Dorn t al., 1999; J Mol Biol 288: 1027-36) werden auch von einzelnen Chelatoren stabil immobilisiert und bieten sich daher für diese Anwendungen an. Die Methode kann auf kovalent modifizierte Oberflächen und/oder transparente Substrate (Indium-Zinnoxid) übertragen werden. Mit der Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen biochemischen Pinzetten mit hoher Affinität werden diese als Erkennungsstrukturen eingesetzt, um Arrays aus Proteinen verschiedener Eigenschaften zu realisieren.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele und Figuren weiter erläutert werden, aus denen sich weitere Merkmale, Vorteile und Ausführungsformen der Erfindung ergeben. Dabei zeigt

Fig. 1 die Synthese einer erfindungsgemäßen Aminosäure nach Formel (I);

Fig. 2 das HPLC-Analyseergebnis betreffend die Fähigkeit von Metall-chelatierenden Peptiden Metallionen und Modellverbindungen für Histidin-markierte Polypeptide zu komplexieren;

Fig. 3 den Einfluß von Ni²⁺ auf das Fluoreszenzverhalten einer eine erfindungsgemäße Aminosäure enthaltenden Modellverbindung;

Fig. 4 den Nachweis der Bindung eines Histidin-markierten Biomoleküls an ein eine erfindungsgemäße Aminosäure umfassendes Peptid mittels Fluoreszenz- Spektroskopie;

Fig. 5 das Prinzip der nanostrukturierten elektrochemischen Aktivierung von immobilisierten Chelatoren durch einen mit Ni-bedampften AFM-Kantilever und zur selektiven Immobilisierung von Proteinen;

Fig. 6 den schematischen Aufbau einer Festkörper-gestützten Lipidgrenzfläche, die Hexa-Histidinsequenzen präsentiert und die Anbindung von Peptiden mit einem Lys-IDA-Baustein;

Fig. 7 die Veränderung des SPR-Signals während der Immobilisierung des Metall- Chelatpeptids an einer Hexa-Histidingrenzfläche;

Fig. 8 schematisch die möglichen Wechselwirkungen einer Hexa-Histidinsequenz mit der Peptidbibliothek ΨXΨX₃;

Fig. 9 die Veränderung des SPR-Signals während der Immobilisierung verschiedener Lys-EDA-Derivate an einer Hexa-Histidingrenzfläche (0,18 mM SOPC/0,02 mM Lipopeptid mit Hexa-Histidinsequenz, in Puffer 3);

Fig. 10 die Fluoreszenzintensitäten der eluierten Lösungen einzelner Hexapeptid- Bibliotheken;

Fig. 11 eine IDA-Chelator-Aminosäure in komplexierter und unkomplexierter Form;

Fig. 12 eine NTA-Chelator-Aminosäure in komplexierter und unkomplexierter Form;

Fig. 13 eine in das Rückgrat eines Polypeptids eingebaute IDA-Chelator-Aminosäure im komplexierten und unkomplexierten Zustand; und

Fig. 14 eine in das Rückgrat eines Polypeptids eingebaute NTA-Chelator-Aminosäure im komplexierten und unkomplexierten Zustand.

Fig. 11 zeigt eine der erfindungsgemäßen Aminosäuren in Form einer IDA-Chelator- Aminosäure. Die Aminosäure kann dabei in der D- oder der L-Form vorliegen. Das spacer- Element bestehend aus CH₂-Einheiten kann dabei verschieden lang ausgestaltet sein. Typischerweise ist n eine ganze Zahl zwischen 0 und 5. Bei Zugabe eines Metallions, bevorzugterweise eines zweiwertigen Metallions kommt es zur Ausbildung eines Chelator- Metallion-Komplexes. Die in der Figur enthaltenen Pfeile zeigen die Stellen, an denen der Komplex koordinative Bindungen ausbilden kann. Durch Zugabe eines weiteren Komplexbildners wie EDTA kann der Komplex aufgelöst werden.

Fig. 12 zeigt eine der erfindungsgemäßen Aminosäuren in Form einer NTA-Chelator- Aminosäure. Die Ausführungen im Zusammenhang mit Fig. 11 gelten sinngemäß auch hier, insbesondere betreffend die Ausgestaltung des spacer-Elements.

Fig. 13 zeigt die in Fig. 11 dargestellte IDA-Chelator-Aminosäure, wie sie in das Rückgrat eines Polypeptids eingebaut ist und in dieser molekularen Umgebung. ebenfalls einen reversiblen Komplex mit einem Metallion, insbesondere einem zweiwertigen Metallion ausbildet. Bei dieser Anwendung der erfindungsgemäßen Chelator-Aminosäure kommt dem spacer-Element eine besondere sterische Bedeutung zu. Bevorzugte koordinative Wechselwirkungspartner sind dabei Histidin-Reste, die an den durch Pfeile bezeichneten Stellen mit dem Komplex wechselwirken.

Fig. 14 zeigt die in Fig. 12 dargestellt NTA-Chelator-Aminosäure, wie sie in das Rückgrat eines Polypeptids eingebaut ist. Auch hier gilt das zu der in Fig. 13 dargestellten IDA- Chelator-Aminosäure Gesagte sinngemäß.

Beispiel 1 Synthese von mit einer Fmoc-Schutzgruppe versehenem Lys-IDA Die Synthese von Lys-IDA ist schematisch auch in Fig. 1 dargestellt

Die Metallchelataminosäure sollte zum einen die Komplexierung eines zweiwertigen Metallions ermöglichen und zum anderen als Aminosäurederivat in einer Festphasensynthese einsetzbar sein. So kann beispielsweise Lysin, über seine ε-Aminofunktion für die Komplexierung der Metallionen derivatisiert werden und verfügt gleichzeitig über eine reaktive Säure- und α-Aminofunktion.

Die Synthese des Lysinderivates IV erfolgte ausgehend von COO-Benzyl-α-N- Benzyloxycarbonyl-Lysin (Abb. 3). Das Aminosäurederivat IV wird im Weiteren als FMOC- Lys-IDA bezeichnet, da es sich um ein Lysinderivat mit einem Imino-di-(essigsäure-tert- butyl)-Rest handelt. Um den Baustein in der Peptidsynthese verwenden zu können, mußte die α-Aminofunktion geschützt werden. Üblicherweise wird dazu eine Fluorenyl-9- methoxycarbonylgruppe (FMOC) verwendet (Carpino LA et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92: 5748-5752). Versuche, das FMOC-geschützte Produkt direkt aus der Umsetzung von α-N- FMOC-Lysin zu synthetisieren schlugen fehl. Das ist darauf zurückzuführen, daß die FMOC- Schutzgruppe nicht ausreichend basenstabil ist. Bei der Reaktion entstanden daher Komponentengemische, deren Aufarbeitung nicht sinnvoll erschien. α-N-Benzyloxycarbonyl- Lysin als ein anderes mögliches Ausgangsmaterial für die Reaktion löste sich nicht in Dimethylformamid (DMF) und ist daher ebenfalls ungeeignet.

Als Ausgangsprodukt für die Synthese wurde daher ein COO-Benzyl-α-N- Benzyloxycarbonyl-Lysin verwendet (Fig. 1). Die verwendeten Schutzgruppen wurden deshalb gewählt, weil sie simultan in einem Hydrierungsschritt entfernt werden können. Das Ausgangsprodukt I wird mit Bromessigsäure-tert-butylester umgesetzt. Diese Reaktion liefert das Lysinderivat II in guten Ausbeuten (85%). Nachteilig ist die lange Reaktionsdauer von 4 Tagen. Eine Verkürzung der Reaktionsdauer ist jedoch nicht möglich, da ansonsten große Anteile des monoacylierten Produktes isoliert werden. Mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie (DC) und Sprühreagenzien wie Co(SCH)₂ und Fluorescamin läßt sich die Bildung des mono- und später diacylierten Produktes verfolgen. Das gereinigte Lysinderivat II kann an Hand der NMR-Signale der Methylgruppen (¹H-NMR, 18H, 1.47 ppm) und der beiden tertiären C-Atome (¹³C-NMR, 2C, 82.00 ppm) leicht identifiziert werden. Alle Produkte wurden mit ¹H-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektrometrie charakterisiert.

Wie oben erwähnt, ermöglicht die Wahl der Schutzgruppen das gleichzeitige Entschützen der Säure- und der α-Aminofunktion zum ungeschützten Lysinderivat III. Da Benzylgruppen wesentlich hydrogenolysestabiler sind als Z-Schutzgruppen, muß ein benzylgruppenspezifischer Katalysator (10% Pd/C, Aldrich) verwendet werden. Als Lösungsmittel ist reines Methanol den üblichen Methanol/Chloroformgemischen vorzuziehen, da das Produkt in diesen Gemischen nicht gut löslich ist. Nach dem Abfiltrieren des Palladium/Kohlenstoffgemisches über Celithen wird das Produkt säulenchromatographisch gereinigt. Da das entstehende ε-N-di(essigsäure-tert-butylester)-Lysin III keine UV-Aktivität besitzt, kann die Reaktion über die abnehmende UV-Aktivität nach dünschichtchromatographischer Trennung der Mischung verfolgt werden. Die vollständige Abspaltung der Schutzgruppen läßt sich leicht durch das Fehlen der Signale aller aromatischen Protonen im ¹H-NMR überprüfen.

Um die Verwendung des Lysinderivates in der Peptidsynthese zu ermöglichen, mußte die α- Aminofunktion mit einer Fluorenyl-9-methoxycarbonylgruppe geschützt werden. Zur Einführung dieser Schutzgruppe werden üblicherweise deren Succinimidylester (Fluorenyl-9- methyl-N-succinimidyl-carbonat, FMOCONsu) bzw. Säurechloride (Chlorameisensäure- (fluorenyl-9-methyl)-ester FMOCCI) unter schwach basischen Reaktionsbedingungen verwendet (Carpino LA, 1987, Acc. Chem. Res. 20: 401-407). Die Basenmenge muß so gewählt werden, daß die bei der Kopplung freigesetzte Säure abgefangen wird, der pH-Wert der Lösung sich jedoch nicht nach pH ≧ 8,00 verschiebt, da unter diesen Bedingungen die FMOC-Schutzgruppe wieder abgespalten wird. Für die Kopplungsreaktion werden sterisch anspruchsvolle Hilfsbasen, wie Diisopropylethylamin (DIPEA, Hünigbase) verwendet, weil diese die Kopplung der aktivierten Aminosäure mit sich selbst (Dipeptidbildung) verhindern (Chen FMF et al., 1986, Can J. Chem. 65: 221-225).

Es ist aus der Literatur bekannt, daß die Einführung der FMOC-Schutzgruppe bei Aminosäuren in manchen Fällen durch eine Salzbrücke zwischen der Säure- und der Aminofunktion verhindert wird (Bolin DR et al., 1989, Int. J. Peptide Protein Res. 33: 353-­ 359). Dieses Problem wird gelöst, indem beide funktionelle Gruppen zuerst silyliert werden. Im Anschluß wird die Trimethylsilylschutzgruppe (TMS-Schutzgruppe) an der α-Aminofunktion durch eine FMOC-Schutzgruppe substituiert. Bei der anschließenden wäßrigen Aufarbeitung wird die TMS-Schutzgruppe der Säurefunktion abgespalten. Für die Synthese von FMOC-Lys-IDA war diese Strategie der intermediären Silylierung erfolgreich. Nach der Aufarbeitung konnte das Produkt in moderaten Ausbeuten (60%) isoliert werden. Das Produkt ließ sich leicht an Hand der zwei nichtaromatischen Protonen der FMOC-Schutzgruppe bei ca. 4.40 ppm im ¹H-NMR identifizieren.

Die Synthese des Metallchelataminosäure FMOC-Lys-IDA ermöglichte deren Verwendung in einer Peptidsynthese. Die Kopplung des FMOC-Lys-IDA IV Bausteins erfolgte problemlos nach Standardvorschriften. Bei der Abspaltung des Peptides von der Polymermatrix mit Trifluoressigsäure wurden auch die tertiären Butylschutzgruppen des IDA-Lysinderivates abgespalten. Dabei wurde der eigentlich aktive, ungeschützte Baustein ε-N-Imino-di­ essigsäure-Lysin, Lys-IDA, Ψ generiert.

Die vorstehend geschilderten Reaktionen wurden im Detail wie folgt durchgeführt:

• a) Nα-Z-Nε-Di(iminodiessigsäure-tert.-butylester)-L-Lysin-Benzylester (Formel (II) von Fig. 1): 6,5 ml (47 mmol) Triethylamin und 6,2 ml (47 mmol) Bromessigsäure-tert.- Butylester wurden zu 2,5 g (4,7 mmol) Nα-Z-L-Lysin-Benzylester in 100 ml DMF unter einer Argonatmosphäre hinzugegeben und bei 50°C gerührt. Nach zwei Tagen wurden erneut 6,5 ml (47 mmol) Triethylamin und 6,2 ml (47 mmol) Bromessigsäure-tert.-Butylester hinzugefügt und für weitere zwei Tage gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft. Nach Auflösen der rohen Reaktionsmischung in Wasser wurde die Reaktionsmischung dreimal mit CHCl₃ extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde mittels Silicasäulenchromatographie mit einem linearen Gradienten aus CHCl₃/MeOH (100 : 1)-­ CHCl₃/MeOH (10 : 1) als Elutionsmittel gereinigt.
  Ausbeute: 3,4 g (85%)
  TLC (CHCl₃/MeOH (10 : 1)): R_f = 0,3.
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃/TFA): 7,35 (m; 5H-Z; 5H-Bzl); 5,20 (s; 2H-Bzl); 5,12 (s; 2H-Z); 4,45 (m; C2-H); 4,10 (m; 4H; -N-(CH₂)₂-); 3,45 (m; 2H; C6-H); 1,95 - 1,60 (br. m; 4H; C3- H; C5-H); 1,49 (s; 18H(-(CH₃)₃); 1,39 (br. m; 2H; C4-H).
  ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃/TFA): 172,61 (-COO-Bzl); 164,99 (-COO-(CH₃)₃; 135,56 (C- Benzyl); 129,38 (C-Benzyl); 129,16 (C-Benzyl); 128,77 (C-Benzyl); 86,77 (2C; -C-(CH₃)₃); 68,50 (Ar-CH2); 56,62 (2C; -N-CH₂-COO-(CH₃)₃; 56.12 (-N-CH-COOH); 54,98(-CH₂-CH₂- N-(CH₂)₂-); 54,05; 32,57; 31,88 (-CH₂-CH₂-N-(CH₂)₂-); 28,43 (6C; (-CH₃)₃; 24,51(-CH- CH₂-); 22,67 (-CH-CH₂-CH₂-).
  MS (ESI): M + Na⁺ = 622 g/mol.
• b) Nε-(Imino-di-(essigsäure-tert.-butylester))-L-Lysin (Formel (III) von Fig. 2): 1,2 g (2 mmol) Nα-Z-Nε-(Imino-di-(essigsäure-tert.-butylester))-L-Lysin-Benzylester wurden in 100 ml MeOH und 4 ml Essigsäure gelöst und, nach Hinzufügen von 3 Spatelspitzen 10% Pd/C, bei Raumtemperatur und normalem Druck für 5 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Produkt wurde mittels Silikasäulenchromatographie mit CHCl₃/MeOH 3 : 1 als Elutionsmittel gereinigt.
  Ausbeute: 590 mg (76%).
  TLC (CHCl₃/MeOH/30%AcOH; 5 : 3 : 1) R_f = 0,5.
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃/TFA): 4,00 (br. m; 4H; -N-(CH₂)₂-); 3,84 (t; C2-H); 3,29 (m; 2H; C6-H); 1,90 (m; 2H; C₃-H); 1,68 (m; 2H; C5-H); 1,45 (br. m; 2H; C4-H); 1,39 (s; 18H, - (CH₃)₃.
  ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃): 171,40 (-COOH); 82,53 (2C; -C-(CH₃)₃); 56,39 (2C; -N-CH₂- COO-(CH₃)₃); 54,35 (-N-CH-COOH); 30,48 (-CH₂-CH₂-N-(CH₂)₂-); 28,37 (6C; (-CH₃)₃); 26,86 (-CH-CH₂-); 22,97 (-CH-CH₂-CH₂-).
  MS (ESI): M - H⁺ = 375 [M + H]
• c) Nα-FMOC-Nε-(imino-di-(essigsäure tert. butylester))-L-lysin (Formel (IV) von Fig. 1): 0,27 ml (1,6 mmol) di-Isopropylethylamin (DIPEA) wurden zu einer Lösung aus 300 mg (0,8 mmol) Nε-Imino-di-(essigsäure-tert.-butylester)-L-Lysin, gelöst in 2 ml frisch destilliertem CH₂Cl₂, unter Argon gelöst. Nach Abkühlen auf -10°C wurden 0,2 ml (1,6 mmol) Trimethylchlorsilan hinzugefügt. Man ließ sich die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen. Anschließend wurde sie bei 40°C für 1 Stunde unter Rückfluß gekocht. Es wurden 270 mg (0,8 mmol) FMOC-N-Hydroxy-succinimidester hinzugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit 50 ml Ethylacetat verdünnt und mit 50 ml NaHCO₃ (pH 8,7) extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgCl₂ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Produkt (Formel (IV) von Fig. 1) wurde durch Silikasäulenchromatographie unter Verwendung von CHCl₃/MeOH (5 : 1) als Elutionsmittel gereinigt.
  Ausbeute: 200 mg (60%)
  TLC (CHCl₃/MeOH, 5 : 1) R_f = 0,8.
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 7,75 (d; 2H-FMOC); 7,55 (br. m; 2H-FMOC); 7,39 (t; 2H- FMOC); 7,29 (t; 2H-FMOC); 4,95 (br. C2-H); 4,40 (d; 2H-FMOC); 4,19 (t; H-FMOC); 4,10 (br. m; 4H; -N-(CH₂)₂-); 3,38 (m; 2H; C6-H); 1,75 (m; 2H; C3-H); 1,61 (m; 2H; C5-H); 1,47 (s; 18H(-(CH₃)₃); 1,39 (br. m; 2H; C4-H).
  ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃): 171,48 (-COO(CH₃)₃); 163,53 (-COOH); 157,05 (C=O; FMOC; 144,68 (2C; FMOC); 141,87 (2C; FMOC); 128,21 (2C; FMOC); 127,72 (2C; FMOC); 125,60 (2C; FMOC); 120,46 (2C; FMOC); 82,00 (-C-(CH₃)₃); 67,60 (FMOC); 56,40 (2C; N-CH₂-COO-(CH₃)₃); 55,57 (N-CH-COOH); 54,91 (CH₂-CH₂-N-(CH₂)₂-); 47,86 (-CH₂- CH₂O; FMOC); 32,89 (CH₂-CH₂-N-(CH₂)₂-); 32,21 (HOOC-CH-CH₂-); 28,78 (6C; (-CH₃)₃); 23,62 (-CH-CH₂-CH₂-).

Beispiel 2 Einbau der Chelator-Aminosäuren in Polypeptide und Nachweis der spezifischen Wechselwirkung mit Oligohistidin-Proteinen/Peptiden

Als Modellpeptid für die Untersuchung des Transport von Peptiden durch den spezifischen Transportkomplex TAP (transporter associated with antigen processing), hat sich das HLA- B27 Epitop H-Arg-Arg-Tyr-Gln-Lys-Ser-Thr-Glu-Leu-OH (RRYQKSTEL) auf Grund seiner hohen Affinität zu TAP bewährt (Abele R et al., 1999, Biochem. Biophys. Acta 1461: 405- 419; Neumann L et al., 1999, J. Mol. Biol. 294: 1203-1213). Um die regiospezifische Markierung mit Fluoreszein zu ermöglichen, wurden verschiedene Derivate dieses Epitops synthetisiert. Dabei wurde jeweils eine Aminosäure durch ein Cystein ersetzt und die Cysteinreste nachträglich mit einem Fluoreszenzmarker (Fluoreszein) gekoppelt. Dieser fluoreszenzmarkierte Cysteinbaustein wird im weiteren Verlauf hierin mit ∅ bezeichnet. In diesen Untersuchungen erwies sich das Peptid mit der Sequenz RRY∅KSTEL als optimales Substrat für einen Transportassay mit TAP. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde ein Peptid mit der Sequenz RRYCΨSTEL synthetisiert, bei dem das Lysin durch die Metallchelataminosäure Lys-IDA ersetzt wurde. Die Reinheit des Peptides wurde mittels HPLC nachgewiesen und die berechnete molare Masse von 1272 g/mol massenspektrometrisch bestätigt. Experimente zeigen, daß sich die Chelator-Aminosäuren an beliebiger Position und innerhalb beliebiger Sequenzen in Polypeptide einbauen lassen.

Zunächst wurde die Komplexierung zweiwertiger Metallionen durch dieses Peptid und die anschließende Bindung an eine Hexa-Histidinsequenz analysiert. Aufbauend auf Erkentnissen an festkörpergestützten Membranen wurde die Bindung des Metallchelatpeptides an Lipidgrenzflächen, die mit Hexa-Histidinsequenzen derivatisiert sind, mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie untersucht. Die Seitengruppe des Cysteins in dem Peptid RRYCΨSTEL wurde mit Iodacetamid umgesetzt, um unspezifische Wechselwirkungen des Thiols mit den zweiwertigen Metallionen zu verhindern. Für die Untersuchung wurde auf einem Goldchip ein Hybridbilayer assembliert (Fig. 6). Der proximale selbstassemblierende Monolayer wird von hydrophoben Alkylthiolen gebildet (HPA-Chip, Biacore). Durch Vesikelfusion (0,18 mM SOPC/0,02 mM Lipopeptid mit Hexa- Histidinsequenz, in Puffer 2 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5) wird auf diesem hydrophoben Substrat ein Lipidmonolayer assembliert. Diese distale Lipidschicht besteht aus SOPC und bildet die Matrix für 10 Mol% Lipopeptide, die an der Grenzfläche Hexa- Histidinsequenzen präsentieren.

Die Anordnung der zwei Meßzellen im Oberflächenplasmonenspektroskop ermöglicht eine asymmetrische Beschichtung der Substratoberflächen. So konnte in der zweiten Meßzelle eine nahezu identische Lipidarchitektur assembliert werden. Es wurde jedoch ein Lipopeptid ohne Hexa-Histidinsequenz verwendet. Das aufgezeichnete Differenzsignal zeigt so das Bindungsverhalten ohne den Einfluß der Brechungsindexänderung. Fig. 7 zeigt die Veränderung des SPR-Signals bei der Zugabe einer Peptidlösung (20 µM, in Puffer 2) auf einer Hexa-Histidingrenzfläche. In den Experimenten wurde der Einfluß verschiedener Metallionen auf die Bindung des Peptides untersucht. Da viele biologisch relevante Moleküle (Proteine, DNA, usw.) Kalzium- und/oder Magnesiumionen zur Stabilisierung benötigen, sollte deren Anwesenheit im Puffer den Bindungsassay nicht stören.

Die Experimente belegen, daß das mit dem Baustein Chelator-Aminosäure aufgebaute Peptid nur dann an die Grenzfläche bindet, wenn es zuvor mit Metallionen, wie Ni2+ (schwarze Linie) oder Zn2+ (graue Linie) beladen wurde. Das Chelator-Peptid bindet dagegen nicht, wenn zu der Lösung Kalziumionen (gestrichelte Linie) oder Magnesiumionen (Daten nicht gezeigt) zugegeben werden. Auch wenn das Peptid mit der gleichen Sequenz (RRYCKSTEL), aber anstatt Chelator-Aminosäure mit Lysin, mit Nickelionen inkubiert wird, erfolgt keine Bindung des Peptides (Daten nicht gezeigt).

Die Systemarchitektur, bestehend aus immobilisierter Hexa-Histidinsequenz und mobiler Chelator-Polypeptid als Bindungspartner erlaubt keine multivalenten Wechselwirkungen, sodass der Komplex aus dem Chelator-Peptid und der Hexa-Histidinsequenz zerfällt und keine kinetisch stabile Immobilisierung beobachtet werden kann. EDTA (100 mM) induziert die Dissoziation (Daten nicht gezeigt). Der Einfluß verschiedener Bedingungen auf die Bindung des Peptides an die Hexa-Histidingrenzfläche wurde in Kontrollexperimenten untersucht. Die Beobachtungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tab. 1 zeigt eine Zusammenfassung von Bindungsexperimenten verschiedener Substanzen an eine Hexa-Histidingrenzfläche

Beispiel 3 Multivalente, koordinative Wechselwirkung von Peptidbibliotheken mit mehreren Chelator-Aminosäure-Bausteinen

Obwohl die Histidinaffinitätssequenz in der Proteinbiochemie eine breite Anwendung findet, ist über den genauen Bindungsmechanismus und die Bindungsgeometrie zwischen den Imidazolseitenketten und der NTA- respektive IDA-Gruppe wenig bekannt (Chen Y et al., 1999, J. Inorg. Biochem. 76: 211-220). Die NTA- bzw. IDA-Gruppe bildet mit dem zweiwertigen Metallion einen oktaedrischen Komplex. An den verbleibenden Bindungsplätzen des Oktaeders können die Imidazolseitenketten der Hexa-Histidinsequenz gebunden werden. Die genaue räumliche Anordnung dieses Komplexes ist jedoch unbekannt. Aus der Literatur weiß man, daß eine Verkürzung der Affinitätssequenz auf weniger als fünf Histidineinheiten zu einem dramatischen Rückgang der Bindungsstärke führt (Gershon PD et al., 1995, J. Immunol. Methods 183: 65-76). Die Bindungskonstante zwischen dem NTA/Hexa-Histidinsystem wurde im mikromolaren Bereich bestimmt. Die Bindungskonstante für das IDA/Hexa-Histidinsystem sollte die gleiche Größenordnung besitzen. Obwohl die Bindungskonstanten eher niedrig sind, wurde in Untersuchungen an Chelatorlipidmembranen eine stabile Immobilisierung von Hexa-Histidinmarkierten Proteinen nachgewiesen, wenn die laterale Dichte der Chelatorlipide 10 Mol% erreicht (Dorn IT et al., 1998, Biol. Chem. 379, 1151-1159). Wird die Lipidmatrix dagegen nur mit 2 Mol% Chelatorlipid angereichert, findet keine zeitlich stabile Immobilisierung statt. Demnach spielen für die Immobilisierung der Hexa-Histidinmarkierten Proteine sowohl die laterale Dichte, wie die Dynamik der Chelatorlipide eine wesentliche Rolle (Bamdad C, 1998, Biophys. J. 75: 1989-1996).

Die höhere räumliche Dichte der Chelatgruppen ermöglicht multiple Wechselwirkungen mit der Hexa-Histidinsequenz. Die Nickelionen in der Chelat-Gruppe verfügen über mehrere freie Koordinationsstellen, an die die Imidazolseitenketten der Histidine binden können. Durch die mehrfache Verwendung der Chelator-Aminosäure Ψ in einem Peptid ist es möglich, den genauen Abstand der Chelatgruppen zu kontrollieren und so eine "optimale" räumliche Anordnung für die Komplexbildungen mit einer (oder mehreren) Affinitätssequenz(en) zu erzielen.

Um die hier aufgeworfene Frage nach der optimalen räumlichen Anpassung der Hexa- Histidinsequenz an eine Peptidsequenz mit Chelator-Aminosäure-Bausteinen zu untersuchen, wurden Hexa-Peptidbibliotheken synthetisiert. Solche Bibliotheken werden in der kombinatorischen Chemie häufig verwendet (Jung G., 1996, Combinatorial peptide and nonpeptide libraries - A handbook for the search of lead structures). Dabei wurde die Chelator-Aminosäure Ψ in unterschiedlichen Positionen der Peptidsequenzen eingebaut. Es handelt sich bei diesen Bibliotheken also um Gemische aus bis zu 6¹⁹ unterschiedlichen Einzelpeptiden.

Zwei verschiedene Systeme wurden untersucht. Zum einen handelt es sich um lösliche Komponenten, also die reinen Peptide, dazu wurden die Peptidbibliotheken ΨΨX₄ und ΨXΨX₃ synthetisiert. Zum anderen wurden die Bibliotheken ΨX₅, ΨX₄, ΨXΨX₃, ΨXXΨX₂, ΨXXXΨX auf einer Polymermatrix immobilisiert. Für Kontrollexperimente wurde jeweils eine X₆ Peptidbibliothek ohne Chelator-Aminosäure-Baustein Ψ synthetisiert. Eine Kombination aus Kompeptitionsassay und Verwendung von Peptidbibliotheken sollte Aussagen über Bindungsspezifität und -affinität ermöglichen. Durch die Verwendung der Peptidbibliotheken kann zusätzlich der Einfluß der Position der Chelator-Aminosäure Ψ unabhängig von der Sequenz untersucht werden (Uebel S. et al., 1999, Peptide libraries in cellular immune recognition, Winnacker, Wong and Famulok, eds. Current topics in microbiology and immology). Eine solche Verbindung der Form ΨXΨX₃ ist in Fig. 8 zusammen mit einem potentiellen Bindungskandidaten gezeigt. X bezeichnet dabei eine aus 19 zufällig gewählten Aminosäuren (außer Cystein).

Die Bindung der Peptidbibliotheken, die sich aus niedermolekularen Hexapeptiden zusammensetzen, an eine Lipidgrenzfläche wurde mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) untersucht. Dazu wurde eine Grenzfläche generiert, die 10 Mol% eines Lipopeptides mit Hexa-Histidinsequenzen in einer SOPC-Matrix enthielt. Ein Vergleich der SPR-Signale während der Immobilisierung verschiedener Peptidbibliotheken und dem Peptid RRY∅ΨSTEL auf einer Hexa-Histidingrenzfläche ist in Fig. 9 dargestellt, wobei folgende Versuchsbedingung vorlag: je 20 µM mit äquimolaren Mengen Nickelionen in Puffer 3 (10 mM Hepes, 300 mM NaCl, pH 8,00), Flussrate 10 µl/min. Zwei wesentliche Aussagen können hier getroffen werden:

• a) Im Vergleich der Immobilisierung des definierten Peptides RRY∅ΨSTEL und der Peptidbibliotheken ΨXΨX₃ und ΨΨX₄ wurde festgestellt, daß die Dissoziationskinetiken deutlich verschieden sind. Während das Peptid mit nur einem Chelator-Aminosäure-Baustein Ψ von der Grenzfläche dissoziiert (siehe Fig. 7), bleiben die beiden Peptidbibliotheken mit je zwei Chelator-Aminosäure-Bausteinen stabil immobilisiert.
• b) Es konnte gezeigt werden, daß die Referenzpeptid-Bibliothek X₆ ohne den Chelator- Aminosäure-Baustein nicht mit an die 6xHis-Sequenz bindet.

Neben den löslichen Hexa-Peptidbibliotheken wurden auch Bibliotheken synthetisiert, die auf einer Polymermatrix immobilisiert waren. Bei dem Polymer handelt es sich um ein niedermolekulares Polystyren, das mit einem Polyethylenglycol gekoppelt ist. Nach der Festphasensynthese wurden die Peptide nicht von der Matrix abgespalten, sondern die Experimente direkt an den Polymerkugeln mit den Hexa-Peptidbibliotheken durchgeführt.

Die Hexapeptid-Bibliotheken verfügen über Chelator-Aminosäuren in definierten Positionen und sollen so die hochaffine Bindung von Biomolekülen mit einer Hexa-Histidinsequenz über koordinative, multivalente Wechselwirkungen ermöglichen. Die spezifische Binding wurde mit Hilfe eines Tetramethylrhodamin-markierten 6xHis-Peptids der Sequenz H-(Gly-Ser)₅- His₆-OH analysiert. Die Synthese des Rhodamin-markierten Histidinpeptides wurde bereits beschrieben (Dorn IT et al., 1998, J. Am. Chem. Soc. 121: 2753-2763).

Die polymergebundenen Peptidbibliotheken wurden als Säulenmaterial verwendet. Zur Untersuchung der spezifischen Bindung der polymergebundenen Hexapeptid-Bibliotheken wurde folgendes Protokoll etabliert: Nach einem Waschschritt mit Puffer 3 (10 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH 8,0) wurde die Säule mit EDTA gewaschen, um bereits gebundene zweiwertige Ionen aus den Hexa-Peptidbibliotheken zu entfernen. Danach wurden die Peptidbibliotheken mit Puffer 3 gespült und mit Nickelionen "beladen". Um nichtgebundene Nickelionen zu entfernen, wurde erneut mit Puffer gespült und die Säule schließlich mit dem rhodaminmarkierten Histidinpeptid beladen. Um ungebundenes Peptid zu entfernen, wurde wieder mit Puffer 3 gewaschen und das gebundene Peptid anschließend mit einem Imidazolstufengradienten (15 mM bis 500 mM, in Puffer 3) eluiert (Fig. 10), wobei die Fluoreszenzintensitäten der eluierten Lösungen der einzelnen Hexapeptid-Bibliotheken in Fig. 10 dargestellt sind. Die einzelnen Balken repräsentieren die Elution des Rodamin-markierten Histidin-Peptides bei 15-125 mM Imidazol (weißer Balken) und 250-500 mM Imidazol (schwarzer Balken) in Puffer 3. Alle Werte sind normiert auf die Menge an immobilisierten Peptid-Bibliotheken. Die optimalen Bindungskapazitäten werden in den Systemen ΨXΨX₃ und ΨΨX₄ erzielt.

Über eine optimierte, räumliche Anordnung der Chelatgruppen in der Polypeptidkette können multivalente Wechselwirkungen mit eine Histidin-reichen Sequenz ausgebildet werden. Somit wird die Bindungsaffinität zwischen der Affinitätssequenz und dem Chelator um einige Größenordnungen erhöht. An einer Bindung der 6xHis-Sequenz mit dem oktaedrischen Chelatkomplex können bis zu drei Imidazolseitengruppen beteiligt sein. Durch die hohe räumliche Dichte der Chelatoren in den Hexa-Peptidbibliotheken können an einer Affinitätssequenz zwei Chelatoren binden und damit die Bindungsaffinität drastisch erhöhen. Die multivalente Bindung ist kinetisch stabil. Dieser Sachverhalt kann durch folgende, stark vereinfachende Gleichungen beschrieben werden:

Wobei die Laufzahlen der Histidine willkürlich gewählt sind und C₁ und C₂ die beiden Chelatoren bezeichnen. Jede dieser Geichungen besteht aus vielen Einzelprozessen, bei denen jeweils eine bzw. zwei Histidingruppen vom Komplex dissoziieren können, ohne daß die Immobilisierung verloren geht.

Durch die von uns eingeführte Verknüpfung der vorher unabhängigen Ereignisse an den Chelatgruppen C₁ und C₂ bleibt die kinetisch stabile Immobilisierung des Gesamtkomplexes erhalten, auch wenn nur noch eine Bindung vom Typ Chelator_X-Histidin_y bestehen bleibt. Wenn auf Grund der räumlichen Anordnung und innerhalb der Dissoziationszeit dieses Komplexes Chelator_X-Histidin_y wieder eine Bindung mit einem Histidin der Affinitätssequenz gebildet wird, ist die Immobilisierung stabil. Dieser Teil der Betrachtung schließt jedoch nur den dynamischen Charakter und damit die kinetische Stabilisierung der Bindung ein.

Beispiel 4 Quervernetzen von Histidin-markierten Polypeptiden mit Peptiden umfassend Chelator-Aminosäuren

Um die Quervernetzung von Peptiden bzw. Proteinen zu zeigen, wobei eines der Peptide bzw. Proteine eine His-Markierung, d. h. eine Anzahl von konsekutiven, typischerweise sechs oder mehr, Histidin-Resten, aufweist und das andere die erfindungsgemäße Aminosäure, wurde ein Modellpeptid (IDA-Peptid) synthetisiert, das mit K-IDA (ψ) eine der erfindungsgemäßen Aminosäuren nach Formel (I) enthielt. Die Abkürzung K-IDA steht dabei für ein mit IDA modifiziertes Lysin (= K nach dem Einbuchstabencode). Die Sequenz des Peptids lautete wie folgt: RRYC (2-Acetylamid) (ψ) STEL. Die Fähigkeit derartiger Metall-chelatierender Peptide, Metallionen und Modellverbindungen für Histidin-markierte Polypeptide zu komplexieren, wurde mittels HPLC untersucht und die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Die freie Thiolgruppe von Cys wurde durch Iodacetamid blockiert, um eine Dimerisierung vermittels Disulfid-Brückenbildung zu vermeiden. Die RP-HPLC-Analyse wurde wie folgt durchgeführt:

• 1. (A): 50 nmol RRYC(-2-Acetylamid)(ψ)STEL wurden in Abwesenheit (schwarzes Chromatogramm) und Anwesenheit von 500 nmol NiCl₂ (gestricheltes Chromatogramm) oder 500 nmol CaCl₂ (gepunktetes Chromatogramm) in 50 µl Puffer A inkubiert
• 2. (B): Als Kontrollpeptid wurde RRYQKSTEL in Gegenwart (gestricheltes Chromatogramm) und Abwesenheit (schwarzes Chromatogramm) von NiCl₂ analysiert.
• 3. : 50 nmol RRYC(-2-Acetylamid)(ψ)STEL, gemischt mit 5 µmol Imidazol, wurden in Abwesenheit (schwarzes Chromatogramm) und Anwesenheit von 500 nmol NiCl₂ (gestricheltes Chromatogramm) in 50 µl Puffer A^im inkubiert.
• 4. Das Kontrollpepid RRYQKSTEL wurde mit 5 µmol Imidazol gemischt und in Anwesenheit (gestricheltes Chromatogramm) und Abwesenheit (schwarzes Chromatogramm) von NiCl₂ analysiert. Bei allen Experimenten wurde ein linearer Gradient (0% Puffer A oder A^im bis 100% B oder B^im) über 10 Minuten angelegt, wie durch die punktierte Linie in allen Darstellungen angegeben.

Peptidsynthese und Markierung der Peptide

Die Peptide wurden mittels Festphasentechnik unter Verwendung herkömmlicher Fmoc- Chemie hergestellt. Das Fluorescein wurde an die Thiol-Gruppen von RRYCKSTEL und RRYC(ψ)STEL (Chelator-Peptid) durch Inkubation der entsprechenden Peptide mit einem 1,2-fachen molaren Überschuß von 5-Iodacetamidofluorescein (Molecular Probes, Eugene, USA) in PBS, 20% (V/V) DMF, pH 6,0 für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die markierten Peptide wurden mittels RP₁₈-HPLC gereinigt. Die Identität und Reinheit wurde mittels Massenspektrometrie verifiziert.

Ergebnisse

Das Modellpeptid eluierte als ein einzelner Peak bei einer Elutionszeit von 8,5 min (Darstellung A, schwarzes Chromatogramm). Eine Vor-Inkubation des IDA-Peptids mit einem zehnfachen molaren Überschuß von CaCl₂ änderte die Elutionszeit nicht (Darstellung A, gepunktetes Chromatogramm). Die Inkubation des IDA-Peptids mit einem zehnfachen molaren Überschuß von Ni²⁺ führte zum Auftreten zweiter neuer Peaks (Darstellung A, gestricheltes Chromatogramm) mit einer Elutionszeit von 9,4 min bzw. 11,0 min. Zusätzlich war der Peak entsprechend dem IDA-Peptid (Elutionszeit 8,5 Minuten) nicht mehr nachweisbar. Dies zeigt deutlich, daß das Peptid ein stabiles Ni²-Addukt durch koordinative Bindungen zwischen dem IDA-Chelator und dem Schwermetallion bildet. Das Auftreten zweier Peaks nach dem Ni²-Inkubationsschritt beruht wahrscheinlich auf der Anwesenheit erreichen, bei dem eine Komplexbildung möglich ist. Andererseits können Ammoniumionen an die freien Koordinationsstellen des Ni²⁺-IDA-Komplexes binden. Eine derartige Molekülspezies wird natürlich andere Molekulareigenschaften als das Ni²⁺-IDA-tragende Peptid aufweisen, was zu dem zweiten, kleineren Peak mit einer Elutionszeit von 11,0 min führt. Diese beobachtete Wechselwirkung zwischen Ni²⁺ und dem IDA-Peptid könnte alternativ durch eine Wechselwirkung zwischen dem Peptid-Rückgrat und dem Schwermetallion erklärt werden. Ein derartiges Szenario kann jedoch ausgeschlossen werden, da keine Verschiebung der Elutionszeit eines IDA-freien Peptids (RRYC(-2- Acetylamid)KSTEL) nach Inkubation mit Ni²⁺ vor der HPLC (Fig. 2, Darstellung B) beobachtet wurde.

Das einfachste Modell für eine Histidin-Markierung ist Imidazol, das der Seitenkette eines isolierten Histidins ähnlich sieht. Entsprechend wurden die Möglichkeiten des Ni²⁺-IDA- Peptids untersucht, mit dieser Modellverbindung in Wechselwirkung zu treten (Fig. 2, Darstellungen C und D).

Die Wechselwirkung von RRYC(K*-IDA)STEL, Ni²⁺ und Imidazol wurde analysiert unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographie (SMART system, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany; Säule µRPC C2/C18 Sc 2.1/10). Um Dimerisierung von RRYC(ψ)STEL durch Disulfid-Brückenbindung zu verhindern, wurden die freien SH- Gruppen durch eine fünfstündige Inkubation bei Raumtemperatur in 150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, pH 6,5, enthaltend einen 12-fachen molaren Überschuß von 2- Iodacetamid (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) blockiert. In 50 µl Puffer A (300 mM NaCl, 100 mM NH₄Ac, H₂O, pH 8,0) wurden 50 nmol RRYC(2-Acetylamid)(ψ)STEL für 15 Minuten bei Raumtemperatur in Anwesenheit oder Abwesenheit von 500 nmol NiCl₂ prä­ inkubiert. Die Mischungen wurden mittels RP-HPLC unter Verwendung eines Flusses von 200 µl/min und einem linearen Gradienten (0-100% Puffer B (300 mM NaCl, 100 mM NH₄Ac, 50% Acetonitril, pH 8,0) über 10 Minuten) analysiert. Die Produkte wurden überwacht bei OD₂₈₀. Zur Analyse der Wechselwirkung zwischen Imidazol und Ni²⁺- RRYC(2-Acetylamid)(ψ)STEL-Komplex wurden 100 mM Imidazol zu Puffer A und B hinzugefügt, was zu den Puffern A^im und B^im führte. In 50 µmol Puffer A^im wurden 500 nmol RRYC(-2-Acetylamid)(ψ)STEL, 500 nmol NiCl₂ und 5 µmol Imidazol für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Produkte wurden mittels RP-HPLC unter Verwendung eines linearen Gradienten aus den Puffern A^im und B^im analysiert.

Im Falle des IDA-Peptids führte nur die Inkubation mit Ni²⁺ und Bildung des Ni²⁺-IDA- Peptids zu einer Verschiebung der Elutionszeit nach Wechselwirkung mit Imidazol, wohingegen für das IDA-freie Peptid keine Verschiebung nachweisbar war. Diese Beobachtung zeigt eine stabile Bindung von Imidazol durch das freie Elektronenpaar des Ringstickstoffatoms an den Ni²⁺-IDA-Komplex und impliziert, daß die erfindungsgemäße Aminosäure und ein diese enthaltendes Peptid, d. h. ein IDA-Peptid, auch in der Lage ist, Histidin-markierte Biomoleküle zu binden. Diese Interpretation wird weiter durch die Tatsache gestützt, daß keine Peptid-Imidazol-Wechselwirkung bei Abwesenheit von Ni²⁺ (Darstellung D) oder dem IDA-Chelator (nicht gezeigt) beobachtet wurde, was die Spezifität des Erkennungsprozesses belegt.

Beispiel 5 Wechselwirkung und Komplexbildung von Ni²⁺ und IDA

In den im folgenden beschriebenen Beispielen wird auf die Beobachtung zurückgegriffen, dass ein Schwermetall in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem fluoreszierenden Molekülteil dazu führt, die Fluoreszenz wirksam zu löschen. Dies wurde angewandt, um die Wechselwirkung und Komplexbildung von Ni²⁺ und IDA zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.

Der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein wurde durch Thiol-spezifisches Kuppeln an das Cys benachbart der Chelator-Aminosäure Lys-IDA gebunden.

Alle Fluoreszenzspektren wurden bei Raumtemperatur (λ_ex = 470 nm) in 1 M NaCl, 40 mM Hepes, pH 7,4 unter Verwendung eines FLUOLOG-3-Spektrometers (Instruments, S. A., HORIBA Group, Paris, Frankreich) bei einer konstanten Temperatur von 20°C aufgezeichnet. Um Lichtstreuung zu vermeiden, wurden Doppelmonochromatoren und engen Spalten (3 nm) verwendet.

Die Emissionsspektren von 50 nM RRYC(-Fluorescein)(ψ)STEL in Abwesenheit (schwarzes Spektrum) und Anwesenheit (gepunktetes Spektrum) von 10 µM NiCl₂ (A) oder 1 mM CaCl₂ (B) wurden verglichen. Zusätzlich wurden die Fluoreszenzsignale von 50 nM RRYC(- Fluorescein) KSTEL, dem die IDA-Gruppe fehlte, in Abwesenheit (schwarze Spektren) und Anwesenheit (gepunktete Spektren) von 10 µM NiCh aufgezeichnet (C). Die Konzentrationsabhängigkeit zwischen Ni²⁺ (ausgefüllte Quadrate) und RRYC(- Fluorescein)(ψ)STEL wurde durch Messen des Fluoreszenzsignals (λ_ex/em = 480/535 nm) quantifiziert. Die hinsichtlich des Hintergrundes korrigierten Fluoreszenzsignale wurden auf maximale Fluoreszenz F₀ normalisiert. Die Dissoziationskonstante K_d = 23,7 ± 31 nM wurde durch Anpassung der Daten gemäß Gleichung (1) bestimmt. Als Kontrolle wurden Ca²⁺ (ausgefüllte Kreise) und RRYC(-Fluorescein)KSTEL verwendet (offene Quadrate). Die Fehlerbalken stellen ± SD (n = 2 oder 3) dar.

Die Inkubation mit einem 20-fachen molaren Überschuß von Ni²⁺ in Puffer führte zu einer vierfachen Verringerung der emittierten Fluoreszenz (Fig. 3A, gepunktetes Spektrum) verglichen mit der Fluoreszenz des markierten Peptids bei Abwesenheit von Ni²⁺ (Fig. 3A, schwarze Spektren). Im Gegensatz dazu wurde keine Änderung der Fluoreszenzspektren hinsichtlich des Intensitäts- oder Wellenlängenmaximums der Emission bei Anwesenheit von Ca²⁺ (Fig. 3B) oder in der Abwesenheit der Chelator-Aminosäure Lys-IDA innerhalb des Peptides nachgewiesen (Fig. 3C). Somit wurde sogar unter Anwendung einer solch hochsensiblen Technik wie der Fluoreszenzspektroskopie bewiesen, dass die Komplexierung von Ni²⁺ hochspezifisch ist.

Die vom Schwermetallion induzierte Fluoreszenzlöschung des Fluorophoren wurde schließlich verwendet, um die Ni²⁺-IDA-Komplex-Dissoziationskonstante zu bestimmen (Fig. 3D). Titration zunehmender Mengen von Ni²⁺ und quantitative Messung des sich ergebenden Fluoreszenzlöschens führte zu einer sigmoiden Kurve mit einer Dissoziationskonstante von 23,7 ± 3,1 nM (Fig. 3D, ausgefüllte Quadrate).

Bei der Bestimmung der Dissoziationskonstanten K_d von Ni²⁺-RRYC(-Fluorescein)(ψ)STEL wurde so vorgegangen, dass die Fluoreszenzlöschung bei verschiedenen NiCl₂- Konzentrationen gemessen wurde (λ_ex,em = 480/535 nm). 50 nM RRYC(- Fluorescein)(ψ)STEL wurden mit einer zunehmenden Konzentration von NiCl₂ in 1M NaCl, 40 mM Hepes, pH 7,4 über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenzsignale wurden hinsichtlich des Hintergrundes korrigiert (mittels Proben, die nur den Puffer enthielten) und auf maximale Fluoreszenz F₀ bei Abwesenheit von NiCl₂ normalisiert.

Beispiel 6

Bindung eines Histidin-markierten Biomoleküls an das erfindungsgemäße Chelatorpeptid Um zu zeigen, dass der hierin offenbarte Ansatz unter Verwendung der erfindungsgemäßen Chelator-Aminosäure geeignet ist, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu konstruieren, wurde wiederum Fluoreszenzspektroskopie angewandt, um das Binden eines Histidin-markierten Biomoleküls an ein Chelator-Peptid, d. h. an Peptid, welches die erfindungsgemäße Chelator- Aminosäure umfasst, nachzuweisen. Als Modellpeptid wurde (GS)₁₀H₆ verwendet, welches geeignet ist, Chelator-Grenzflächen oder -Übergänge und deren Fähigkeit zu charakterisieren, Histidin-markierte Biomoleküle zu erkennen und in einer stabilen Art und Weise zu immobilisieren. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in Fig. 4 dargestellt.

Die Aufnahme der Fluoreszenzspektren erfolgte dabei unter praktisch den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Wechselwirkung zwischen RRYC(- Fluorescein)(ψ)STEL und (GS)₁₀H₆ wurde ähnlich der Vorgehensweise von Beispiel 3 analysiert. 50 nM RRYC(-Fluorescein)(ψ)STEL wurden mit einer zunehmenden Konzentration von (GS)₁₀H₆ in Abwesenheit und Anwesenheit von 10 µM Ni²⁺ über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz wurde hinsichtlich des Hintergrundes korrigiert und auf die Maximalfluoreszenz F₀ bei infinit hohen Konzentrationen von (GS)₁₀H₆ normalisiert. Die Daten wurden gemäß Gleichung 2 analysiert.

L steht für die Ligandenkonzentration ((GS)₁₀H₆), F_max für die maximale Änderung der Fluoreszenz, F_min für die minimale Fluoreszenz bei Abwesenheit von GS₁₀H₆ und K_d für die Dissoziationskonstante. F₀ wurde bestimmt durch Anpassen des Konzentrations-abhängigen Emissions-Fluoreszenzsignals F nach Hintergrundkorrektur gemäß Gleichung 3.

F₀ wird durch die Summe aus F_min und ΔF_max angegeben.

Fig. 4 ist im wesentlichen identisch mit Fig. 3, wobei jedoch zusätzliche Emissionsspektren mit 9 mM (GS)₁₀H₆ (gepunktete Linien in den Darstellungen A, B und C) und mit 9 mM Kontrollpeptid (RRYQKSTEL, graue Linie) aufgenommen wurden. Die Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenzlöschung (λ_ex/em = 480/535 nm) wurde in Anwesenheit (ausgefüllte Quadrate) und Abwesenheit (offene Quadrate) von 10 µM Ni²⁺ beobachtet (D). Die Hintergrund-korrigierten Fluoreszenzsignale wurden auf die maximale Fluoreszenz F₀ normalisiert. Das Verwenden von Gleichung (2) liefert eine Dissoziationskonstante von K_d = 96 ± 15 µM für die (GS)₁₀H₆-RRYC(- Fluorescein)(ψ)STEL-Wechselwirkung in Anwesenheit von Ni²⁺. Die Fehlerbalken stellen ± SD (n = 2 oder 3) dar.

Nach Inkubation des Chelator-Peptids mit einem 20-fachen molaren Überschuß von Ni²⁺ wurde das erwartete Löschen der Fluoreszenz nachgewiesen (Fig. 4A, schwarzes bzw. schraffiertes Spektrum). Das Hinzufügen des Histidin-Peptids führte zu einer nahezu vollständigen Wiederherstellung der Fluoreszenzemission (~ 95%) (Fig. 4A, gepunktetes Spektrum). Die Tatsache, dass keine vollständige Wiederherstellung erhalten wurde, beruht wahrscheinlich auf einem unvollständigen Binden des Histidin-Peptids oder einem Restlöschen. Ein Kontrollpeptid, welches jedoch keine His-Markierung trug (Sequenz: RRYQKSTEL) führte zu keinerlei Wiederherstellung der Fluoreszenz (Fig. 4A, graues Chromatogramm). Innerhalb der Sequenz können zwei Arg und ein Glu zusammen mit dem freien N-Terminus als potentielle Elektron-Donor-Gruppierungen für die freien Koordinierungsstellen des Ni²⁺-IDA-Komplexes dienen. Die Abwesenheit einer Wechselwirkung bei dem vorstehenden Ansatz zeigt eindrucksvoll die Selektivität des Erkennungsprozesses zwischen der His-Markierung und der Chelator-Aminosäure. Dies stützt auch die Eignung des hierin beschriebenen Ansatzes, Proteindomänen ohne unspezifische Wechselwirkung in reversibler Weise querzuvernetzen.

Es wurden auch Kontrollexperimente in Anwesenheit von Ca²⁺ (Fig. 4B) oder in Abwesenheit der Chelator-Aminosäure (Fig. 4C) durchgeführt, die zeigten, dass keine Wechselwirkung des Histidin-Peptids mit dem Chelator-Peptid auftrat. Um schließlich die Dissoziationskonstante des Systems zu bestimmen, wurden zunehmende Mengen von Histidin-Peptid gegenüber dem Chelator-Peptid in Anwesenheit von Ni²⁺ titriert (Fig. 4D). Die erhaltene sigmoide Kurve (Fig. 4D, ausgefüllte Quadrate) wurde wie vorstehend beschrieben analysiert und ergab eine Dissoziationskonstante von 96 ± 15 µM. Bei Abwesenheit von Ni²⁺ wurde keine Änderung des Fluoreszenzspektrums innerhalb des experimentellen Fehlers erhalten (Fig. 4D, offene Quadrate).

Die hierin offenbarten Ergebnisse zeigen schlüssig, dass die erfindungsgemäße Chelator- Aminosäure Schwermetallionen, aber nicht Ca²⁺ oder Mg²⁺ mit hoher Effizienz bindet. Die Tatsache, dass weder Ca²⁺ noch Mg²⁺ die tatsächliche Messung stören, ist für das Studium von Proteinen wichtig, wo die Funktion oder Stabilität von der Anwesenheit von Ca²⁺ oder Mg²⁺ abhängt. Infolge des Wahrnehmens oder Detektierens von Schwermetallionenbindung durch Fluoreszenzspektroskopie und der hohen Affinität kann ein hoch empfindlicher Aufbau, Meßsystem oder Sensor entwickelt werden zum Nachweis von Schwermetallionen, insbesondere Ni²⁺-Ionen, welcher nur ein geringes Probenvolumen und/oder eine geringe Probenkonzentration benötigt. Zusätzlich wird die Wiederherstellung der Fluoreszenz eines typischerweise artifiziellen Fluorophoren nach Bindung mit einem Histidin-markierten (Fusions-)Protein ein neues und wertvolles Werkzeug u. a. in der Affinitätsreinigung derartiger Fusionsproteine sein. In diesem Zusammenhang soll festgehalten werden, dass ein Kontrollpeptid ohne His-Markierung nicht an den IDA-Komplex bindet, was die hohe Spezifität und Selektivität des Erkennungsprozesses belegt. Vor einem Reinigungsschritt unter Verwendung von Affinitätschromatographie-Systemen können nun solch wichtige Fragen wie die Bindung des Proteins an den immobilisierten Komplexbildner und die für das De-Immobilisieren des Proteins erforderliche Konzentration des Kompetitors einfach und schnell vorhergesagt werden.

Darüber hinaus sind jedoch weitergehende Anwendungen der erfindungsgemäßen Chelator- Aminosäure bzw. der diese enthaltende Peptide oder Proteine möglich. So wird es infolge des Anordnens der Chelator-Aminosäure an bestimmten Stellen eines Polypeptids durch in vitro- Translation (Hanes et al., 1997; Proc Natl Acad Sci USA 94: 4937-42) oder durch die intein- Strategie (Evans et al., 1999; J Biol Chem 274: 3923-6) möglich sein, Protein-Protein- Interfaces oder schaltbare Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erzeugen, die definiert und in vorhersagbarer Weise an- oder ausgeschaltet werden können. Auch bei dieser Anwendung wird die selektive Wechselwirkung zwischen der His-Markierung und der Chelator- Aminosäure definierte Bedingungen schaffen für den Wechselwirkungsprozeß unabhängig vom jeweils verwendeten Protein. In Anwendung der hierin beschriebenen technischen Lehre können auch Helix-Bündel, coiled-coils oder andere Sekundär-Strukturelemente rational erzeugt werden. Deren Anwendung führt auch weiter zur Konstruktion von Proteinen mit neuen Eigenschaften oder Funktionen oder der Erzeugung und Stabilisierung von Multi- Enzym-Komplexen.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (28)

1. Aminosäure der allgemeinen Formel
wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 und
m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Aminosäure einen kovalent gebundenen Metall-Chelator umfasst, wobei der Chelator eine koordinative Wechselwirkung zu einer Aminosäure aufbauen kann, bevorzugterweise zu Histidin.

2. Aminosäure der allgemeinen Formel
wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 und
m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Aminosäure einen kovalent gebundenen Metall-Chelator umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die Iminodiessigsäure, alle Salze der Iminodiessigsäure, Iminodies­ sigsäure-tert.butylester und deren Derivate umfasst.

3. Aminosäure der allgemeinen Formel
wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 und
m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Aminosäure einen kovalent gebundenen Metall-Chelator umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die N-Nitrilotriessigsäure, alle Salze der N-Nitrilotriessigsäure, N- Nitrilotriessigsäure-tert.butylester und deren Derivate umfasst.

4. Aminosäure nach einem der Ansprüch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Me­ tall-Chelator über die Seitenkette R der Aminosäure gebunden ist, wobei die Seiten­ kette bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe, die (CH2)_x und (CH2-CH2- O)_y umfasst und x eine ganze Zahl zwischen 0 und 5 und y unabhängig eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 ist.

5. Aminosäure nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus­ gewählt ist aus der Gruppe, die Lysin umfasst.

6. Aminosäure nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass sie Lysin ist und der Metall-Chelator über die ε-Aminogruppe der Lysin-Seitenkette kovalent gebunden ist, wobei der Stickstoff der Iminogruppe des Metall-Chelators aus der ε- Aminogruppe der Lysin-Seitenkette stammt.

7. Aminosäure mit der Formel:
und deren Derivate

8. Aminosäure mit der Formel:
und deren Derivate

9. Aminosäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Benzyloxycarbonylgruppe, die tert.-Butoxycarbonylgruppe, die 9- Fluorenylmethoxycarbonylgruppe die Triphenylmethylgruppe und die Nitrobenzolsulfenylgruppe umfasst, und/oder die Carboxylgruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Methylgruppe, die Ethylgruppe, die Benzylgruppe, die 4-Nitrobenzylgruppe und die tert.-Butylestergruppe umfasst.

10. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Aminosäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst.

11. Polypeptid nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Metall- Kation umfasst.

12. Polypeptid nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass das Metall-Kation ausge­ wählt ist aus der Gruppe, die Ni²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Co³⁺, Fe²⁺ und Fe³⁺ umfasst.

13. Polypeptid nach einem der Ansprüche 10-12 dadurch gekennzeichnet, dass es einen kovalent gebundenen Fluorophor umfasst.

14. Polypeptid nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, dass der Fluorophor ausge­ wählt ist aus der Gruppe, die Fluorescein, Rhodamin, Cy3, Cy5, DODIPY-Derivate und NBD-Farbstoffe umfasst.

15. Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass min­ destens ein Metall-Chelator "gecaged" ist.

16. Polypeptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Metall- Chelator mit einem α-Carboxy-2-nitrobenzyl-Rest (CNB) "gecaged" ist.

17. Polypeptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptidhauptkette über mindestens ein Azobenzolderivat verbrückt ist.

18. Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass es ko­ valent mit einem membranpermeablen Peptid verknüpft ist.

19. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10 bis 18 zum Markieren von Proteinen.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die zu markierenden Proteine intrazelluläre Proteine sind.

21. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10 bis 18 zur Dimerisierung und/oder Oligomerisierung von Proteinen.

22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid kova­ lent an einen Cysteinrest in dem zu dimerisierenden/oligomerisierenden Protein ge­ bunden ist.

23. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10 bis 18 zur kontrollierten Immobilisierung von Proteinen an Oberflächen.

24. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 10 bis 18 in Verbindung mit Rastersonden-mikroskopischen Techniken zur strukturierten Assemblierung von Proteinen an Oberflächen.

25. Proteinkomplex, umfassend:
ein erstes Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 18,
mindestens ein Kation, das von einer Aminosäure nach einem der Ansprüche 1 -9 komplexiert ist, und
ein zweites Polypeptid, das mindestens ein Histidin umfasst.

26. Proteinkomplex nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Kation ausge­ wählt ist aus der Gruppe, die Ni²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Co³⁺, Fe²⁺ und Fe³⁺ umfasst.

27. Proteinkomplex nach einem der Ansprüche 25-26, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Polypeptid eine Anzahl von Histidinen umfasst, die im Bereich von 1-8 liegt.

28. Proteinkomplex nach einem der Ansprüche 25-27, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Polypeptid die Sequenz (His)_x umfasst, wobei x im Bereich von 1-8 liegt.