DD273449A1

DD273449A1 - Verfahren zur gewinnung von 4-substituierten indolverbindungen

Info

Publication number: DD273449A1
Application number: DD31730688A
Authority: DD
Inventors: Jochen Gartz
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1988-06-29
Filing date: 1988-06-29
Publication date: 1989-11-15

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobielle Gewinnung von 4-substituierten Indolverbindungen. Sie ist anwendbar zur Gewinnung von Wirkstoffen fuer die experimentelle Neurobiologie. Die Erfindung besteht in der Verwendung von festen Naehrmedien, die aus Mischungen komplexer natuerlicher Substrate bestehen, denen jeweils Tryptamin oder dessen Salze zugesetzt werden. Die Kultivierung unter Fruchtkoerperbildung erfolgt bei 16 bis 32C unter diffusem Tages- oder Kunstlicht, die Extraktion und Isolierung der Wirkstoffe nach bekannter Weise. Die erfindungsgemaesse Loesung fuehrt zu hohen Ausbeuten an Psilocin und nur zur sehr geringen Akkumulation anderer Indolderivate in den Biomassen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von 4-substituierten Indolverbindungen, insbesondere Psilosin sowie ein hierfür geeignetes Nährmedium.

Sie kann zur Biosynthese von Wirkstoffen für die experimentelle Neurobiologie in der pharmazeutischen Industrie angewendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß verschiedene höhere Pilze aus der Ordnung der Agaricales 4-substituierte Indolverbindungen bilden. Die Verbindungen Psilocybin, Baeocystin, Norbaeocystin und Psilocin kommen in wechselnden Mengen in Pilzarten der Gattungen Psilocybe, Stropharia, Conocybe, Inocybe, Panaeolus und Pluteus vor.

Die Wirkstoffe lassen sich aus den natürlichen sowie aus künstlich kultivierten Fruchtkörpern und Mycelien isolieren. Verschiedene Verfahren (DE-PS 1087321, WP 255749, WP 254395) beschrieben die Kultivierung von Pilzmycelien oder Fruchtkörpern, aus denen diese 'ndolverbindungen durch bekannte Verfahren wie Extraktion und Chromatographie gewonnen werden können. Der Nachteil dieser Verfahren ist, daß das dephosporylierte Psilocin neben den Psilocybin nur in sehr kleiner Menge anfällt oder gar nicht gebildet wird.

Ein weiteres Verf ihren beschreibt die Ausbeuteerhöhung an Indolalkaloiden durch Biotransformation Tryptamin in Pilzmycelien, die auf flüssigen Nährböden kultiviert wurden. Der Nachteil dieses Verfahrens ist, daß das Psilocin hier ebenfalls nur in Mengen bis maximal 0,3% gebildet wird und die Ausbeuteerhöhung nur bei der phosphorylierten Verbindung, dem Psilocybin resultiert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, eine effektive Herstellu.ig des Psilocin aus Pilzkulturen in hohen Ausbeuten zu erreichen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch ein geeignetes Kultivierungsverfahren die Biosynthese der 4-substituierten Indolverbindungen so zu beeinflussen, daß große Mengen an Psilocin als Hauptalkaloid gebildet werden.

Die Kultivierung erfolgt erfindungsgemäß durch Kultivierung von Pilzfruchtkörpern der Gattungen Psilocybe, Stropharia, Pluteus, Inocybe, Panaeolus und Conocybe auf festen Nährböden auf der Basis von Dung-Reis-Mischungen, wobei die Nähnnedien Tryptamin in Form der freien Base oder der wasserlöslichen Salze enthalten.

Die Tryptaminkonzentrotion liegt dabei im Bereich von 0,02-1 % und beeinflußt die Fruchtkörperbildung auf dun angegebenen Nährmedien nicht nachteilig.

Als Kultivierungsbedingungen sind folgenda Parameter vorteilhaft:

- Medienzusammensetzung: Dung/Reis-Mischung im Verhältnis 4-2:1

- Zusatz von 150-250% Wasser

- Temperatur: 16-32^CC

- Kultivierungszeit bis zur LFruktifikationswalle: 20-30 Tage

- Kultivierung bei diffusem Tages- oder Kunstlicht Die Fruchtkörperbildung erfolgt bis zu 6 Ertragswellen.

Durch das Modium wird eine leichte Fruktifikation ohne Deckschicht erreicht, die Pilze enthalten bis zu 3,3% Psilocin, berechnet auf die Trockenmassen. Durch den Zusatz an Tryptamin wird während des biochemischen Prozesses der Fruktifikation durch Transformation diese hohe Akkumulation des Alkaloids erreicht, wobei nur kleine Mengen weiter zum Psilocybin phosphoryliert werden. Verschiedene Dungkomponenten liefern vergleichbare Ausbeuten hinsichtlich Biomassen und Alkaloidkonzentration, wobei der Lichteinfluß anregend quf die Fruktifikation wirkt.

Man verfährt so, daß man mit einer Suspension von Mycelflocken den autoklavieren Nährboden beimpft und in geeigneten Gefäßen zwischen 16 und 32⁰C 20 bis 30 Tage bebrüten läßt. Nach Abtrennung der erhaltenen Fruchtkörper und deren

Gefriertrocknung, Zerkleinerung und Extraktion nach bekapnten Verfahren werden die Wlrkitoffe mittels bekannter Veifahren chrornatographlsch abgetrennt. Durch Arbeiten unter Schutzgas kann dabei eine teilweise cxydatlve Zersetzung des Psilocln vermieden werden.

Durch diese einfache Arbeitsweise können hohe Ausbeuten an Biomassen mit einem großen Gehalt an Psllocin erhalten werden, wobei nur geringe Mengen an Nebenalkaloiden gebildet worden, Durch die nachfolgenden Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Man legt eine Sporenkultur der subtropischen Art Psilocybe cubensis (Earle) Sing, auf 6%lger.i Malzagar (Agar: 2%) an. Nach 3 Wochen wird aneptisch ein MycelstUck von etwa 2mal 2cm entnommen und in einem 100ml sterilen Kolben, der neben 20ml Wasser 20g Sattelfüllkörper enthalt. 10min geschüttelt, wobei die Füllkörper das Mycel unter Bildung einer feinen Suspension zermalmen.

Je 5ml der Suspension werden aseptisch zur Beimpfung einer autoklavieren Mischung aur 50g trockenem Kuhdung und 25g Reiskörner in 80 ml Wasser verwendet, das noch 0,5 g Tryptaminhydrochlorid enthielt. Nach 14 Tagen war der Nährboden völlig mit weißem Mycel überwachsen, nach 20 Tagen begann die Bildung der Fruchtkörpur. Na ;h 5 Fruktifikationswellen wurden die gefriergetrockneten und bni -10⁰C bis zur Aufarbeitung aufbewahrton Pilze zusammen zermahlen, extrahiert und die Wirkstoffe aus den mittels Petrolether entfetteten methanolischen Lösungen durch Säulenchromatographie an Cellulose mit wassergesättigtem n-Butanol isoliert

Ausbeute: 21g Trockenpilze Psilocingehalt: 3,3%

Psilocybingehalt: 0,02%. Beispiel 2

Bei analoger Arbeitsweise wie im Beispiel 1 angegeben und unter Verwendung von 60g trockenem Pferdedung, 20g Reiskörnern und 100ml Wasser unter Zusatz von 0,25g Tryptaminhydrochlorid wurden 29g Trockenpilzo mit einem Gehalt von Psilocin von 2,1 % erhalten. Außerdem waren in den Pilzen noch 0,15% Psilocybin enthalten.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von 4-substituierten Indolverbindungen, insbesondere Psilocin durch Festphasenfermentation unter Fruchtkörperbildung höherer Pilze der Gattungen Psilocybe, Panaeolus, Stropharia, Inocybe, Conocybe und Pluteus, gekennzeichnet dadurch, daß die Kultivierung au." einem Nährmedium auf der Basis von Dung-Reis-Mischungen unter Zusatz von Tryptamin durchgeführt und das Psilocin mittels bekannter Trenn- und Reinigungsmethoden gewonnen wird.

.2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Kultivierung bei Temperaturen zwischen 16 und 32⁰C im diffusen Tages- oder Kunstlicht durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Nährmedium aus einer Dung-Reis-Mischung im Verhältnis 4 bis 2:1 untor Zusatz von 150 bis 250% Wasser besteht.