DD273449A1

DD273449A1 - METHOD FOR OBTAINING 4-SUBSTITUTED INDOL COMPOUNDS

Info

Publication number: DD273449A1
Application number: DD31730688A
Authority: DD
Inventors: Jochen Gartz
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1988-06-29
Filing date: 1988-06-29
Publication date: 1989-11-15

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobielle Gewinnung von 4-substituierten Indolverbindungen. Sie ist anwendbar zur Gewinnung von Wirkstoffen fuer die experimentelle Neurobiologie. Die Erfindung besteht in der Verwendung von festen Naehrmedien, die aus Mischungen komplexer natuerlicher Substrate bestehen, denen jeweils Tryptamin oder dessen Salze zugesetzt werden. Die Kultivierung unter Fruchtkoerperbildung erfolgt bei 16 bis 32C unter diffusem Tages- oder Kunstlicht, die Extraktion und Isolierung der Wirkstoffe nach bekannter Weise. Die erfindungsgemaesse Loesung fuehrt zu hohen Ausbeuten an Psilocin und nur zur sehr geringen Akkumulation anderer Indolderivate in den Biomassen.The invention relates to the microbial recovery of 4-substituted indole compounds. It is applicable for the production of drugs for experimental neurobiology. The invention consists in the use of solid nutrient media which consist of mixtures of complex natural substrates to which tryptamine or its salts are added in each case. The cultivation under Fruchtkoerperbildung takes place at 16 to 32C under diffuse daylight or artificial light, the extraction and isolation of the active ingredients in a known manner. The solution according to the invention leads to high yields of psilocin and only to very low accumulation of other indole derivatives in the biomass.

Description

Field of application of the invention

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von 4-substituierten Indolverbindungen, insbesondere Psilosin sowie ein hierfür geeignetes Nährmedium.This invention relates to a process for the production of 4-substituted indole compounds, in particular psilosin, as well as a nutrient medium suitable for this purpose.

Sie kann zur Biosynthese von Wirkstoffen für die experimentelle Neurobiologie in der pharmazeutischen Industrie angewendet werden.It can be used for the biosynthesis of drugs for experimental neurobiology in the pharmaceutical industry.

Characteristic of the known state of the art

Es ist bekannt, daß verschiedene höhere Pilze aus der Ordnung der Agaricales 4-substituierte Indolverbindungen bilden. Die Verbindungen Psilocybin, Baeocystin, Norbaeocystin und Psilocin kommen in wechselnden Mengen in Pilzarten der Gattungen Psilocybe, Stropharia, Conocybe, Inocybe, Panaeolus und Pluteus vor.It is known that several higher fungi of the order of agaricals form 4-substituted indole compounds. The compounds Psilocybin, Baeocystin, Norbaeocystin and Psilocin occur in varying amounts in fungus species of the genera Psilocybe, Stropharia, Conocybe, Inocybe, Panaeolus and Pluteus.

Die Wirkstoffe lassen sich aus den natürlichen sowie aus künstlich kultivierten Fruchtkörpern und Mycelien isolieren. Verschiedene Verfahren (DE-PS 1087321, WP 255749, WP 254395) beschrieben die Kultivierung von Pilzmycelien oder Fruchtkörpern, aus denen diese 'ndolverbindungen durch bekannte Verfahren wie Extraktion und Chromatographie gewonnen werden können. Der Nachteil dieser Verfahren ist, daß das dephosporylierte Psilocin neben den Psilocybin nur in sehr kleiner Menge anfällt oder gar nicht gebildet wird.The active ingredients can be isolated from natural and artificially cultivated fruiting bodies and mycelia. Various methods (DE-PS 1087321, WP 255749, WP 254395) described the cultivation of fungal mycelia or fruiting bodies from which these 'ndolverbindungen can be obtained by known methods such as extraction and chromatography. The disadvantage of this method is that the dephosporylated psilocin is obtained in addition to the psilocybin only in very small amount or not formed.

Ein weiteres Verf ihren beschreibt die Ausbeuteerhöhung an Indolalkaloiden durch Biotransformation Tryptamin in Pilzmycelien, die auf flüssigen Nährböden kultiviert wurden. Der Nachteil dieses Verfahrens ist, daß das Psilocin hier ebenfalls nur in Mengen bis maximal 0,3% gebildet wird und die Ausbeuteerhöhung nur bei der phosphorylierten Verbindung, dem Psilocybin resultiert.Another Verf describes the yield increase of indole alkaloids by biotransformation tryptamine in mushroom mycelia, which were cultivated on liquid nutrient media. The disadvantage of this method is that the psilocin is also formed here only in amounts up to a maximum of 0.3% and the yield increase results only in the phosphorylated compound, the psilocybin.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, eine effektive Herstellu.ig des Psilocin aus Pilzkulturen in hohen Ausbeuten zu erreichen.The aim of the invention is to achieve an effective Herstellu.ig of psilocin from fungal cultures in high yields.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch ein geeignetes Kultivierungsverfahren die Biosynthese der 4-substituierten Indolverbindungen so zu beeinflussen, daß große Mengen an Psilocin als Hauptalkaloid gebildet werden.The invention has for its object to influence by a suitable cultivation method, the biosynthesis of 4-substituted indole compounds so that large amounts of psilocin are formed as Hauptalkaloid.

Die Kultivierung erfolgt erfindungsgemäß durch Kultivierung von Pilzfruchtkörpern der Gattungen Psilocybe, Stropharia, Pluteus, Inocybe, Panaeolus und Conocybe auf festen Nährböden auf der Basis von Dung-Reis-Mischungen, wobei die Nähnnedien Tryptamin in Form der freien Base oder der wasserlöslichen Salze enthalten.The cultivation is carried out according to the invention by cultivating fungi of the genera Psilocybe, Stropharia, Pluteus, Inocybe, Panaeolus and Conocybe on solid nutrient media based on dung-rice mixtures, the nutrient media containing tryptamine in the form of the free base or the water-soluble salts.

Die Tryptaminkonzentrotion liegt dabei im Bereich von 0,02-1 % und beeinflußt die Fruchtkörperbildung auf dun angegebenen Nährmedien nicht nachteilig.The tryptamine concentration is in the range of 0.02-1% and does not adversely affect the fruit body formation on dun specified nutrient media.

Als Kultivierungsbedingungen sind folgenda Parameter vorteilhaft:As culturing conditions, the following parameters are advantageous:

- Medienzusammensetzung: Dung/Reis-Mischung im Verhältnis 4-2:1- Media composition: manure / rice mixture in the ratio 4-2: 1

- Zusatz von 150-250% Wasser- Addition of 150-250% water

- Temperatur: 16-32^CC- Temperature: 16-32 ^C C

- Kultivierungszeit bis zur LFruktifikationswalle: 20-30 Tage- Cultivation time to the L refruc- tive ramparts: 20-30 days

- Kultivierung bei diffusem Tages- oder Kunstlicht Die Fruchtkörperbildung erfolgt bis zu 6 Ertragswellen.- Cultivation with diffuse daylight or artificial light The fruit body formation takes place up to 6 yield waves.

Durch das Modium wird eine leichte Fruktifikation ohne Deckschicht erreicht, die Pilze enthalten bis zu 3,3% Psilocin, berechnet auf die Trockenmassen. Durch den Zusatz an Tryptamin wird während des biochemischen Prozesses der Fruktifikation durch Transformation diese hohe Akkumulation des Alkaloids erreicht, wobei nur kleine Mengen weiter zum Psilocybin phosphoryliert werden. Verschiedene Dungkomponenten liefern vergleichbare Ausbeuten hinsichtlich Biomassen und Alkaloidkonzentration, wobei der Lichteinfluß anregend quf die Fruktifikation wirkt.The modium achieves a slight fructification without top layer, the mushrooms contain up to 3.3% psilocin, calculated on the dry masses. Through the addition of tryptamine, this high accumulation of the alkaloid is achieved during the biochemical process of fructification by transformation, with only small amounts being further phosphorylated to psilocybin. Various manure components provide comparable yields in terms of biomass and alkaloid concentration, with light influence stimulating quf the fructification.

Man verfährt so, daß man mit einer Suspension von Mycelflocken den autoklavieren Nährboden beimpft und in geeigneten Gefäßen zwischen 16 und 32⁰C 20 bis 30 Tage bebrüten läßt. Nach Abtrennung der erhaltenen Fruchtkörper und derenThe procedure is such that is inoculated with a suspension of the Mycelflocken autoclaved soil and can incubate C 20 to 30 days in suitable containers between 16 and 32 ^{the 0th} After separation of the fruiting bodies obtained and their

Gefriertrocknung, Zerkleinerung und Extraktion nach bekapnten Verfahren werden die Wlrkitoffe mittels bekannter Veifahren chrornatographlsch abgetrennt. Durch Arbeiten unter Schutzgas kann dabei eine teilweise cxydatlve Zersetzung des Psilocln vermieden werden.Freeze-drying, comminution and extraction by bekapnten process the Wlrkitoffe be separated by means of known Chrulatographlsch. By working under inert gas, a partially catalytic decomposition of Psilocln can be avoided.

Durch diese einfache Arbeitsweise können hohe Ausbeuten an Biomassen mit einem großen Gehalt an Psllocin erhalten werden, wobei nur geringe Mengen an Nebenalkaloiden gebildet worden, Durch die nachfolgenden Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.By this simple procedure, high yields of biomass can be obtained with a high content of Psllocin, with only small amounts of Nebenalkaloiden been formed by the following examples, the invention will be explained in more detail.

embodiments example 1

Man legt eine Sporenkultur der subtropischen Art Psilocybe cubensis (Earle) Sing, auf 6%lger.i Malzagar (Agar: 2%) an. Nach 3 Wochen wird aneptisch ein MycelstUck von etwa 2mal 2cm entnommen und in einem 100ml sterilen Kolben, der neben 20ml Wasser 20g Sattelfüllkörper enthalt. 10min geschüttelt, wobei die Füllkörper das Mycel unter Bildung einer feinen Suspension zermalmen.A spore culture of the subtropical species Psilocybe cubensis (Earle) Sing is grown on 6% lger.i malt agar (agar: 2%). After 3 weeks, a mycelium of about 2 times 2cm is taken aneptically and in a 100ml sterile flask containing 20g in addition to 20ml of water saddle filler. Shaken for 10 min, wherein the packing crush the mycelium to form a fine suspension.

Je 5ml der Suspension werden aseptisch zur Beimpfung einer autoklavieren Mischung aur 50g trockenem Kuhdung und 25g Reiskörner in 80 ml Wasser verwendet, das noch 0,5 g Tryptaminhydrochlorid enthielt. Nach 14 Tagen war der Nährboden völlig mit weißem Mycel überwachsen, nach 20 Tagen begann die Bildung der Fruchtkörpur. Na ;h 5 Fruktifikationswellen wurden die gefriergetrockneten und bni -10⁰C bis zur Aufarbeitung aufbewahrton Pilze zusammen zermahlen, extrahiert und die Wirkstoffe aus den mittels Petrolether entfetteten methanolischen Lösungen durch Säulenchromatographie an Cellulose mit wassergesättigtem n-Butanol isoliert5 ml of the suspension are used aseptically to inoculate an autoclaving mixture of 50 g dry cow dung and 25 g rice grains in 80 ml water containing 0.5 g tryptamine hydrochloride. After 14 days the culture medium was completely overgrown with white mycelium, after 20 days the formation of the fruiting body began. Na; h 5 Fruktifikationswellen were ground freeze-dried and bni -10 ⁰ C until processing aufbewahrton fungi together extracted, and the active compounds from the defatted using petroleum ether methanolic solutions by column chromatography on cellulose with water-saturated n-butanol isolated

Ausbeute: 21g Trockenpilze Psilocingehalt: 3,3% Yield: 21g Dried mushrooms Psilocin content: 3,3%

Psilocybin content: 0.02%. Example 2

Bei analoger Arbeitsweise wie im Beispiel 1 angegeben und unter Verwendung von 60g trockenem Pferdedung, 20g Reiskörnern und 100ml Wasser unter Zusatz von 0,25g Tryptaminhydrochlorid wurden 29g Trockenpilzo mit einem Gehalt von Psilocin von 2,1 % erhalten. Außerdem waren in den Pilzen noch 0,15% Psilocybin enthalten.In an analogous procedure as described in Example 1 and using 60 g of dry horse manure, 20g rice grains and 100 ml of water with the addition of 0.25 g of tryptamine hydrochloride 29 g of dried mushroom were obtained with a content of psilocin of 2.1%. In addition, the mushrooms contained 0.15% psilocybin.

Claims

1. A process for the production of 4-substituted indole compounds, in particular psilocin, by solid phase fermentation with fruiting of higher fungi of the genera Psilocybe, Panaeolus, Stropharia, Inocybe, Conocybe and Pluteus, characterized in that the cultivation is carried out on a nutrient medium based on manure. Rice mixtures are carried out with the addition of tryptamine and the psilocin is recovered by known separation and purification methods.

.2. A method according to claim 1, characterized in that the cultivation is carried out at temperatures between 16 and 32 ⁰ C in diffuse daylight or artificial light.

3. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the nutrient medium consists of a dung-rice mixture in the ratio 4 to 2: 1 untor addition of 150 to 250% water.