DE1442280C

DE1442280C - Sclerin

Info

Publication number: DE1442280C
Authority: DE
Inventors: Yukio Neyagawa Osaka Satomura (Japan)
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Publication date: 1971-04-15

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine neue, biologisch wirksame, Sclerin genannte Verbindung mit der Summenformel C₁₃H₁₄O₄. und einem Molekulargewicht von 234, massenspektrographisch bestimmt (vgl. J. H. B e y η ο η »Mass Spectrometry and its Applications to Organic Chemistry«, Elsevier, Amsterdam, 1960), bzw. von 244 ± 20, bestimmt nach der Rast-Methode. Die Verbindung hat die Strukturformel The invention relates to a new, biologically active compound called sclerin with the empirical formula C ₁₃ H ₁₄ O ₄ . and a molecular weight of 234, determined by mass spectrography (see. JH B ey η ο η "Mass Spectrometry and its Applications to Organic Chemistry", Elsevier, Amsterdam, 1960), or of 244 ± 20, determined by the Rast method. The compound has the structural formula

HjC CH₃ HjC CH ₃

CHCH

HO OHO O

(vgl. Chemical Abstracts, Bd. 66, Ref. 37591 g [1967]).(see Chemical Abstracts, Vol. 66, Ref. 37591g [1967]).

Sclerin ist löslich sowohl in Methanol, Äthanol, Äther, Aceton, Chloroform und Äthylacetat als auch in wäßrigem Ammoniak und wäßriger Natriumcarbonatlösung. Es bildet weiße, nadelähnliche Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 123° C, die unter dem Mikroskop rechtwinklig, plattenförmig aussehen. Die Ferrichlorid-Reaktion und Folin-Reaktion ist positiv und die Riegler-Reaktion negativ; Sclerin zeigt zwei Absorptionsmaxima im UV-Spektrum in Methanol, zwei Absorptionsmaxima bei 264 und 334 πΐμ in Äthanol und ein Absorptionsmaximum bei 313 ηΐμ und eine Schulter bei 246 ιημ in 0,01 normaler wäßriger Kaliumhydroxydlösung. Es zeigt ferner als Kaliumbromidpreßling charakteristische Absorptionsbanden im IR-Spektrum bei den folgenden Wellenzahlen in cm"¹: 3200, 1795, 1695, 1600. und 1570. Die Rf-Werte von Sclerin bei der Papierchromatographie betragen 0,90, wenn ein 1:4:1-Gemisch von n-Butanol, Essigsäure und Wasser als Lösungsmittel verwendet wird, 0,54, wenn ein 140: 35 : 30-Gemisch von n-Butanol, Pyridin und Wasser verwendet wird, und 0,56, wenn ein 20: 1 :2-Gemisch von Isopropanol, wäßrigem Ammoniak und Wasser verwendet wird.Sclerin is soluble in methanol, ethanol, ether, acetone, chloroform and ethyl acetate as well as in aqueous ammonia and aqueous sodium carbonate solution. It forms white, needle-like crystals with a melting point of 123 ° C, which look rectangular, plate-shaped under the microscope. The ferric chloride reaction and Folin reaction are positive and the Riegler reaction negative; Sclerin shows two absorption maxima in the UV spectrum in methanol, two absorption maxima at 264 and 334 πΐμ in ethanol and an absorption maximum at 313 ηΐμ and a shoulder at 246 ιημ in 0.01 normal aqueous potassium hydroxide solution. As a potassium bromide molding, it also shows characteristic absorption bands in the IR spectrum at the following wave numbers in cm " ¹ : 3200, 1795, 1695, 1600 and 1570. The Rf values of sclerin in paper chromatography are 0.90 when a 1: 4 : 1 mixture of n-butanol, acetic acid and water is used as the solvent, 0.54 when a 140:35:30 mixture of n-butanol, pyridine and water is used, and 0.56 when a 20: 1: 2 mixture of isopropanol, aqueous ammonia and water is used.

Fig. 1 zeigt das UV-Absorptionsspektrum von Sclerin bei einer Konzentration von 0,1 mg in 5 ml Methanol;Fig. 1 shows the UV absorption spectrum of Sclerin at a concentration of 0.1 mg in 5 ml of methanol;

F i g. 2 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von Sclerin im Kaliumbromidpreßling.F i g. 2 shows the infrared absorption spectrum of sclerin in the potassium bromide compact.

Sclerin wird dadurch hergestellt, daß man einen Stamm von Sclerotinia libertiana, ATCC-Nr. 20 025 bzw. Hinterlegungsnummer 88 des »Fermentation Laboratory«, Agency of Industry & Technology, Japan, in einem flüssigen oder auf einem festen Nährmedium, das ein pH von etwa 6 aufweist, unter aeroben Bedingungen und bei einer Temperatur von 20 bis 30" C kultiviert, aus der Kulturbrühe das Mycel durch Filtration abtrennt, das Filtrat mit Aktivkohle behandelt und anschließend abfiltriert, das Mycel und die Aktivkohle mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel extrahiert, die vereinigten Extrakte konzentriert, das Konzentrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, den Extrakt zum Sirup konzentriert, den Sirup in einem Alkohol löst und die alkoholische Lösung entweder mit so viel Wasser versetzt, bis eine Ausfällung eintritt, anschließend filtriert, das Filtrat konzentriert, das Konzentrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, den Extrakt konzentriert, das Konzentrat in alkalihaltigem Wasser löst, ansäuert, bis eine Trübung auftritt, und durch Abkühlenlassen der Lösung das rohe Sclerin auskristallieren läßt oder mit einem Kationenaustauscher behandelt, den Kationenaustauscher mit einem angesäuerten Lösungsmittelgemisch eluiert und das Eluat im Vakuum zu kristallinem rohem Sclerin konzentriert, schließlich das rohe Sclerin nach Auflösen in einem mit Wasser nicUt mischbaren Lösungsmittel der Chromatographie an Kieselgel unterwirft und aus dem Eluat durch, Konzentrierung reines Sclerin auskristallisiert.Sclerin is produced by using a strain of Sclerotinia libertiana, ATCC No. 20 025 or deposit number 88 of the "Fermentation Laboratory", Agency of Industry & Technology, Japan, in a liquid or on a solid nutrient medium, which has a pH of about 6, under cultured aerobic conditions and at a temperature of 20 to 30 "C, from the culture broth the The mycelium is separated off by filtration, the filtrate is treated with activated charcoal and then filtered off, the mycelium and the activated charcoal extracted with a water-miscible solvent, which combined Concentrated extracts, the concentrate extracted with a water-immiscible solvent, the extract concentrated to the syrup, the syrup dissolved in an alcohol and the alcoholic Solution either mixed with enough water until a precipitation occurs, then filtered, the The filtrate is concentrated, the concentrate is extracted with a water-immiscible solvent, the extract concentrated, the concentrate in alkaline Water dissolves, acidifies until it becomes cloudy, and by letting the solution cool, that Crude sclerin can crystallize or treated with a cation exchanger, the cation exchanger eluted with an acidified solvent mixture and the eluate to crystalline in vacuo raw sclerin concentrated, finally the raw sclerin after dissolving in a water with no miscible solvent subjected to chromatography on silica gel and from the eluate through, concentration pure sclerin crystallized out.

Das im Verfahren verwendete Nährmedium enthält vorteilhaft eine Stickstoffquelle, wie Maisquellwasser, Pepton, Weizenkleie, Fleischextrakt, Nitrate und Ammoniumsalze, eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Stärke, Dextrin, Rohrzucker, und anorganische Salze, wie Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat und Phosphate.The nutrient medium used in the process advantageously contains a nitrogen source, such as corn steep liquor, Peptone, wheat bran, meat extract, nitrates and ammonium salts, a carbon source, such as Glucose, starch, dextrin, cane sugar, and inorganic salts such as magnesium sulfate, calcium carbonate and phosphates.

Sclerin kann durch Kultivierung auf einem festen Nährmedium erhalten werden, doch wird zur Erzeugung von Sclerin in großer Menge die Kultivierung in einem flüssigen Medium vorgezogen. Insbesondere ist die belüftete Submerskultur bevorzugt. Die Kultivierungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 20 und 30⁰C, vorzugsweise bei 25° C. Es ist am zweckmäßigsten, den ·ρΗ-Wert des Mediums auf etwa 6,0 einzustellen.Sclerin can be obtained by culturing on a solid nutrient medium, but for producing sclerin in a large amount, it is preferred to cultivate it in a liquid medium. In particular, the aerated submerged culture is preferred. The cultivation temperature is usually 20 to 30 ⁰ C, preferably at 25 ° C. It is most convenient to adjust · ρΗ value of the medium to about 6.0.

Bei 60- bis lOOstündiger Submerskultur hat sich gewöhnlich eine beträchtliche Menge an Sclerin nicht nur in der Kulturbrühe, sondern auch im Mycel angesammelt.Submerged culture for 60 to 100 hours usually has a significant amount of sclerin not only in the culture broth but also accumulated in the mycelium.

In der Praxis wird Sclerin so gewonnen, daß man die Kulturbrühe filtriert, das Filtrat vom Mycel abtrennt, das Filtrat mit Aktivkohle behandelt und dann die Aktivkohle, welche das Sclerin adsorbiert enthält, sowie das Mycel mit einem mit Wasser¹ mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanols oder Aceton oder einem Gemisch aus diesen, extrahiert. Die vereinigten Extrakte können durch Eindampfen im Vakuum oder durch Sprühtrocknen konzentriert werden. Aus dem erhaltenen Rückstand wird das rohe Sclerin mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Äther oder Chloroform, extrahiert. Diesen Extrakt kann man durch Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum zu einem Sirup konzentrieren, der dann in einem Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, aufgelöst wird. Die alkoholische Lösung wird hierauf mit so viel Wasser versetzt, daß eine Ausfällung eintritt. Die feste, ausgefällte Substanz wird abfiltriert. Das Filtrat wird weiterhin konzentriert und dann wiederholten Extraktionen mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äther oderj Chloroform, unterworfen. Der endgültige Extrakt! wird zur Entfernung des Lösungsmittels durch Ver-j dampfen im Vakuum konzentriert und der Rück-j stand in alkalihaltigem Wasser gelöst. Die sich ergebende wäßrige Lösung wird durch Zusatz von: Salzsäure oder Schwefelsäure angesäuert, bis Trü-| bung eintritt. Dann läßt man die Lösung abkühlen! und erhält rohes, kristallines Sclerin. Die Kristalle: werden abfiltriert und getrocknet.In practice Sclerin is thus obtained that is filtered, the culture broth, the filtrate from the mycelium is separated off, the filtrate is treated with activated carbon and then, the activated carbon containing adsorbed the Sclerin, as well as the mycelium with a water-miscible ¹ solvent such as methanol, Ethanol or acetone or a mixture of these extracted. The combined extracts can be concentrated by evaporation in vacuo or by spray drying. The crude sclerin is extracted from the residue obtained using a water-immiscible solvent, such as ethyl acetate, ether or chloroform. This extract can be concentrated to a syrup by evaporation of the solvent in vacuo, which is then dissolved in an alcohol such as methanol or ethanol. The alcoholic solution is then mixed with so much water that precipitation occurs. The solid, precipitated substance is filtered off. The filtrate is further concentrated and then subjected to repeated extractions with a water-immiscible solvent such as ether or chloroform. The final extract! is concentrated in vacuo to remove the solvent by evaporation and the residue is dissolved in alkaline water. The resulting aqueous solution is acidified by adding: hydrochloric acid or sulfuric acid until cloudy | exercise occurs. Then the solution is allowed to cool! and receives raw, crystalline sclerin. The crystals: are filtered off and dried.

Man kann auch die alkoholische Lösung von Sclerin in Methanol oder Äthanol mit einem Kationenharzaustauscher, wie Ambcrlitc IRC-50, behandeln. Das am Harzaustauscher adsorbierte bzw.You can also use the alcoholic solution of sclerin in methanol or ethanol with a cation resin exchanger, like Ambcrlitc IRC-50. The adsorbed or

j gebundene Sclerin wird durch ein genügend saures Lösungsmittelgemisch, beispielsweise durch ein 2:1: 6-Gemisch von Methyläthylketon, Aceton und O,2n-Salzsäure eluiert. Die sclerinhaltigen Eluatfraktionen werden gesammelt, durch Vakuumverdampfiing konzentriert und ergeben rohes, kristallines Sclerin.j bound sclerin is removed by a sufficiently acidic solvent mixture, for example by a 2: 1: 6 mixture of methyl ethyl ketone, acetone and O, 2N hydrochloric acid eluted. The eluate fractions containing sclerin are collected, concentrated by vacuum evaporation to give crude, crystalline Sclerin.

Zur Reinigung des rohen Sclerins wird es in Chloroform oiJer Äther gelöst und an Kieselgel Chromatographien. Die sclerinhaltige Fraktion wird dann durch Eluieren gewonnen und durch Vakuumverdampfung konzentriert und ergibt reines, kristallines Sclerin.To purify the crude sclerin, it is dissolved in chloroform or ether and chromatographed on silica gel. The fraction containing sclerin is then recovered by elution and vacuum evaporation concentrated and results in pure, crystalline sclerin.

Sclerin besitzt eine charakteristische Wirksamkeit zur Regulierung des Wachstums verschiedener Pflanzen. Beispielsweise zeigt Sclerin im Vergleich zu Gibberellin eine beträchtlich höhere Wirksamkeit hinsichtlich der Förderung der Bildung von Lipase in Rizinusbohnen und der Bildung von Amylase in den Samen von Wasserreis- und Landreispflanzen. Bei gemeinsamer Verwendung von Sclerin und Gibberellin zeigt sich, daß der die Bildung von Amylase in der Reispflanze hemmende Einfluß von Indolyl-3-essigsäure weitgehend ausgeschaltet wird. Sclerin fördert außerdem das Wurzelwachstum verschiedener Pflanzen. Ferner übt Sclerin einen regulierenden Einfluß auf die Wirkung des Gibberellins, das ein anomales und übermäßiges Pflanzenwachstum verursacht, in der Weise aus, daß — bei gemeinsamer Verwendung von Sclerin und Gibberellin — ein normales und gesundes. Pflanzenwachstum erreicht wird. . ■ .Sclerin has a characteristic effectiveness in regulating the growth of various plants. For example, sclerin is considerably more effective than gibberellin in promoting the formation of lipase in castor beans and the formation of amylase in the seeds of water and land rice plants. When using sclerin and gibberellin together shows that the effect of indolyl-3-acetic acid, which inhibits the formation of amylase in the rice plant is largely turned off. Sclerin also promotes root growth of various Plant. Furthermore, sclerin has a regulating influence on the effect of gibberellin causes abnormal and excessive plant growth, in such a way that - when joint Use of sclerin and gibberellin - a normal and healthy one. Plant growth achieved will. . ■.

Darüber hinaus kann beobachtet werden, daß bei Anwendung von Sclerin auf Gartenpflanzen, deren Blüten beträchtlich größer als gewöhnlich werden, obwohl die oberirdischen Teile der Pflanzen nicht abnorm und übermäßig wachsen. Die erwähnte biologische Aktivität des Sclerins zeigt sich nicht nur im Licht, sondern auch in der Dunkelheit. Dar- , über hinaus setzt Sclerin den Blasticidin-S-Effekt, j der in einer Hemmung der Synthese von Proteinen im Pflanzenkörper besteht, herab. Die Aktivität der im Pflanzenkörper anwesenden Enzyme wird dagegen aufrechterhalten. Sclerin zeigt Antagonismus gegen Indolyl-3-essigsäure und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure. Wenn die Konzentration des auf die Pflanzen angewandten Sclerins gesteigert wird; so wird die Geschwindigkeit der Enzymbildung in den Pflanzen ziemlich herabgesetzt. Auch höhere Konzentrationen von Sclerin hemmen nicht das normale Pflanzenwachstum. Sclerin unterscheidet sich in dieser Hinsicht von den anderen Pflanzenhormonen.In addition, it can be observed that when sclerin is applied to garden plants, their Flowers become considerably larger than usual, although the aerial parts of the plants do not grow abnormally and excessively. The mentioned biological activity of sclerin is not evident only in the light but also in the dark. In addition, sclerin sets the blasticidin-S effect, j which consists in inhibiting the synthesis of proteins in the plant body. The activity of the In contrast, enzymes present in the plant body are maintained. Sclerin shows antagonism against indolyl-3-acetic acid and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. When the concentration of sclerin applied to the plants is increased; so the rate of enzyme formation in the plants is reduced considerably. Also higher concentrations of sclerin do not inhibit normal plant growth. Sclerin differs in in this regard from the other plant hormones.

Es wurde weiter gefunden, daß die Phytotöxizität üblicher landwirtschaftlicher Chemikalien, wie BIasticidin S, Streptomycin, Serocidin, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und Indolyl-3-essigsäure, erheblich vermindert werden kann, wenn man die Pflanzen vorher oder gleichzeitig mit Sclerin behandelt. Diese Wirkung kann bei Gibberellin nicht beobachtet werden.It was further found that the phytotoxicity of common agricultural chemicals such as BIasticidin S, streptomycin, serocidin, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and indolyl-3-acetic acid, are significantly reduced if the plants are treated with sclerin beforehand or at the same time. This effect cannot be observed with gibberellin.

Sclerin fordert das ausgewogene, gesunde Wachstum der Pflanzen, Gibberellin dagegen führt zu übermäßigem, anormalen Wachstum. Dies geht aus folgenden Versuchen hervor.Sclerin promotes balanced, healthy growth of the plants, while gibberellin leads to excessive, abnormal growth. This is evident from the following experiments.

Reiskörner der Art »Tokai-asahi« werden in üblicher Weise sterilisiert. Jeweils 10 Körner werden in je drei 0,51 fassenden Blumentöpfen ausgesät, welche Seesand enthalten. Die Sandbetten in den Blumentöpfen werden mit 40 ml einer 1 ppm Gibberellin enthaltenden wäßrigen Lösung, mit 40 ml einer 4 ppm Sclerin enthaltenden wäßrigen Lösung bzw. mit 40 ml einer 1 ppm Gibberellin und 4 ppm Sclerin enthaltenden wäßrigen Lösung gegossen. Die Körner werden bei 30⁰C keimen gelassen und 7 Tage unter Bestrahlung mit einer Fluoreszenzlampe von 1000 lux kultiviert. Am siebten Tag nach der Keimung werden die Höhe der Reispflanzenkeimlinge in jedem Topf, das Naßgewicht des oberirdischen Teils der Pflanzen, das Trockengewicht des oberirdischen Teils (6 Stunden bei 8O⁰C getrocknet) und das Naßgewicht der Wurzeln bestimmt. Es werden die Mittelwerte berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengestellt.Grains of rice of the "Tokai-asahi" type are sterilized in the usual way. 10 grains each are sown in three flower pots with a capacity of 0.51, which contain sea sand. The sand beds in the flower pots are poured with 40 ml of an aqueous solution containing 1 ppm gibberellin, with 40 ml of an aqueous solution containing 4 ppm sclerin or with 40 ml of an aqueous solution containing 1 ppm gibberellin and 4 ppm sclerin. The grains are allowed to ^{germinate at 30 °} C. and cultivated for 7 days under irradiation with a fluorescent lamp of 1000 lux. On the seventh day after the germination, the amount of rice plant seedlings in each pot, the wet weight of the aboveground part of the plants, the dry weight of the aboveground part are (6 hours at 8O ⁰ C dried), and determines the wet weight of the roots. The mean values are calculated. The results are compiled in the table.

j ■
; Geprüfte Lösungenj ■
; Approved solutions Höhe der Pflanzen
cmHeight of plants
cm Naßgewicht des
oberirdischen Teils
je Korn
mgWet weight of
above ground part
per grain
mg Trockengewicht des
oberirdischen Teils
je Korn
mgDry weight of
above ground part
per grain
mg Naßgewicht der
Wurzeln je Korn
mgWet weight of
Roots per grain
mg ; Blindversuch
' 1 ppm Gibberellin
4 ppm Sclerin
1 ppm Gibberellin + 4 ppm Sclerin; Blind test
1 ppm gibberellin
4 ppm sclerin
1 ppm gibberellin + 4 ppm sclerin 4,9
10,2
5,8
12,24.9
10.2
5.8
12.2 21,3
28,4
23,8
34,421.3
28.4
23.8
34.4 2,1
3,2
3,5
3,82.1
3.2
3.5
3.8 13,2
4,0
24,2
14,013.2
4.0
24.2
14.0

1 ppm Gibberellin und 4 ppm Sclerin sind einander etwa äquivalent hinsichtlich der Förderung des Wachstums der oberirdischen Teile, ausgedrückt durch das Trockengewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen. Im Gegensatz zu Gibberellin ruft Sclerin kein übermäßiges Wachstum der oberirdischen Teile, jedoch eine sehr gute Wurzelentwicklung hervor. Ein übermäßiges Längenwachstum ist unerwünscht, da die Reispflanzen dann empfindlicher gegen Sturm und Regen sind.1 ppm gibberellin and 4 ppm sclerin are roughly equivalent to one another in terms of production the growth of the above-ground parts, expressed by the dry weight of the above-ground parts of the plants. Unlike gibberellin, sclerin does not cause overgrowth above ground Share, however, a very good root development. There is an excessive increase in length undesirable because the rice plants are then more sensitive to storms and rain.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

B e i s ρ i e 1 1 ^6s B is ρ ie 1 1 ^6s

Eine Schrägkultur von Sclerotinia libertiana auf Kartoffel-Agar wird auf ein festes Medium geimpft, welches 10 g Weizenkleie und 10 ml destilliertes Wasser enthält, und 10 Tage bei 25° C kultiviert. Zwei 500-ml-Kolben werden mifl50ml eines 1% Glucose aufweisenden flüssigen Mediums, 0,1% Pepton, 0,05% Ammoniumsulfat, 0,025% primärem Kaliumphosphat, 0,025% "Magnesiumsulfat, 0,3% Calciumcarbonat und 1% eines 5%igen Kleie-Extraktes beschickt und auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die Beschickungen werden dann sterilisiert. Diese flüssigen Medien werden mit der Festmedtumkultur geimpft und 48 Stunden bei 25° C unter Schütteln kultiviert. Man erhält eine primäre Impfkultur, die dann in 501 eines flüssigen Mediums gegeben wird, welches 1,0% Glucose, 0,15% Pepton, 1,0% Kleie und 0,3% Calciumcarbonat enthält undA slant of Sclerotinia libertiana on potato agar is inoculated on a solid medium, which contains 10 g of wheat bran and 10 ml of distilled water, and cultivated at 25 ° C for 10 days. Two 500 ml flasks are mixed with 50 ml of a 1% Liquid medium comprising glucose, 0.1% peptone, 0.05% ammonium sulfate, 0.025% primary Potassium phosphate, 0.025% magnesium sulfate, 0.3% calcium carbonate and 1% of a 5% bran extract charged and adjusted to a pH of 6.0. The loads are then sterilized. These liquid media are inoculated with the solid medium culture and kept for 48 hours at 25 ° C Shaking cultivated. A primary inoculum is obtained, which is then immersed in 501 of a liquid medium is given, which contains 1.0% glucose, 0.15% peptone, 1.0% bran and 0.3% calcium carbonate and

auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt ist. Dieses Kulturmedium wird unter Belüftung 48 bis 96 Stunden bei 25° C kultiviert. Man erhält eine sekundäre Impfkultur, die in 10001 eines flüssigen Mediums übergeführt wird, welches die vorgenannten Bestandteile in der doppelten Konzentration der sekundären Impfkultur enthält. Die Submerskultur wird unter Belüftung bei 25° C ausgeführt.is adjusted to a pH of 6.0. This culture medium is cultivated at 25 ° C. for 48 to 96 hours with aeration. You get a secondary Inoculation culture which is transferred to 10001 of a liquid medium which contains the aforementioned components contains twice the concentration of the secondary inoculum. The submerged culture is under Ventilation carried out at 25 ° C.

850 1 der so erhaltenen Kulturbrühe werden filtriert und ergeben 136 kg eines nassen Mycelkuchens und 750 1 Filtratbrühe. Der Mycelkuchen wird mit 2001 Methanol extrahiert und der Extrakt durch Verdampfen im Vakuum konzentriert. 2,84 kg der erhaltenen konzentrierten Lösung werden durch Zusatz von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht und dann mit vier Portionen Äthylacetat von insgesamt 3 1 extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden durch Verdampfen im Vakuum konzentriert und ergeben 320 g einer konzentrierten Lösung. Diese wird in 400 ml Methanol gelöst und zur Entfernung unlöslicher Stoffe filtriert. Das Filtrat wird. anschließend mit 3200 ml Wasser versetzt. Die ausgefällte feste Substanz wird abfiltriert und das Filtrat wieder auf 150 ml eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird fünfmal mit 150 ml Äther extrahiert, und die vereinigten Ätherextrakte werden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml wäßriger verdünnter Ammoniaklösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch Zusatz von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt. Danach läßt man die Lösung abkühlen. Aus der Lösung fallen Kristalle aus, welche abfiltriert und getrocknet werden. Es werden 12,6 g gelbüchbraunes, rohes kristallines Sclerin erhalten. Die Ausbeute an rohem Sclerin beträgt 14,85 mg je Liter Kulturbrühe.850 l of the culture broth thus obtained are filtered and give 136 kg of a wet mycelium cake and 750 l of filtrate broth. The mycelium cake is extracted with 2001 methanol and the extract through Concentrated evaporation in vacuo. 2.84 kg of the concentrated solution obtained are added brought to a pH of 3.0 by 6N hydrochloric acid and then with four portions of ethyl acetate extracted from a total of 3 1. The combined ethyl acetate extracts are evaporated in vacuo concentrated and give 320 g of a concentrated solution. This is in 400 ml of methanol dissolved and filtered to remove insoluble matter. The filtrate will. then with 3200 ml of water offset. The precipitated solid substance is filtered off and the filtrate is again evaporated to 150 ml. The concentrated solution is extracted five times with 150 ml of ether, and the combined ether extracts are evaporated to dryness under reduced pressure. The residue becomes aqueous in 50 ml diluted ammonia solution. The solution obtained is made by adding 6N hydrochloric acid adjusted to a pH of 3.0. The solution is then allowed to cool. Fall out of the solution Crystals, which are filtered off and dried. There are 12.6 g of yellowish brown, crude crystalline Sclerin received. The yield of crude sclerin is 14.85 mg per liter of culture broth.

600 mg des erhaltenen rohen kristallinen Sclerins werden in 60 m! eines Lösungsmittelgemisches aufgelöst, das aus Chloroform und Toluol (9:1) besteht, und die Lösung wird an 70 g Kieselsäuregel chromatographiert. Das Kieselsäuregel wird mit einer weiteren Menge des vorgenannten Lösungsmittelgemisches entwickelt. Die aktive Fraktion wird gewonnen und durch Verdampfen im Vakuum konzei triert, wobei sich Kristalle abscheiden. Die gebildete Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Es werde 320 mg weißes, kristallines Sclerin erhalten.600 mg of the crude crystalline sclerin obtained are in 60 m! dissolved in a solvent mixture, which consists of chloroform and toluene (9: 1), and the solution is chromatographed on 70 g of silica gel. The silica gel is mixed with a further amount of the aforementioned solvent mixture developed. The active fraction is recovered and concentrated by evaporation in vacuo triert, whereby crystals separate out. The crystals formed are filtered off and dried. It will 320 mg of white, crystalline sclerin were obtained.

Example 2

7501 der im Beispiel 1 erhaltenen Filtratbrüh werden mit 1 % Aktivkohle versetzt, auf einen pH Wert von 5,6 eingestellt und über Nacht stehen gelassen. Danach wird das Gemisch filtriert und de Filterrückstand mit einem Gemisch aus 80 1 Metha nol und 2,8 1 wäßrigem Ammoniak ausgewascher Die vereinigten Filtrate werden durch Zusatz vo; 6n-SaIzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 gebrach und mit vier Portionen von 21 Äthylacetat extra hiert. Die Extrakte werden vereinigt und durch Verdampfen im Vakuum zu einem Sirup konzen triert. Der Sirup wird in 50 ml Methanol aufgelös und an 750 ml eines Kationenharzaustauschers Am berlite IRC-50 in der Η-Form adsorbiert. Die EIu ierung wird unter Verwendung eines Lösungsmittel gemisches durchgeführt, das aus Methyläthylketor. Aceton und O,2n-Salzsäure (2:1:6) besteht. Du aktive Fraktion des Eluats, welche eine positive Ferrichlorid-Reaktion ergibt, wird in einer Menge von 620 ml erhalten. Diese Fraktion wird danr durch Verdampfung im Vakuum konzentriert unc ergibt Kristalle, welche abgetrennt und getrocknet werden. Es werden 800 mg rohes Sclerin als schwach gelbgefärbtes und kristallines Pulver erhalten. Die Ausbeute beträgt 10,7 mg je Liter Brühe.7501 of the filtrate broth obtained in Example 1 are mixed with 1% activated charcoal, to a pH Adjusted to a value of 5.6 and left to stand overnight. The mixture is then filtered and de Filter residue washed out with a mixture of 80 1 methanol and 2.8 1 aqueous ammonia The combined filtrates are by adding vo; 6N hydrochloric acid brought to a pH of 3.0 and with four portions of 21 ethyl acetate extra hiert. The extracts are combined and cooked through Evaporation in vacuo to a syrup concentrated. The syrup is dissolved in 50 ml of methanol and adsorbed on 750 ml of a cation resin exchanger Am berlite IRC-50 in the Η form. The EIu ation is carried out using a solvent mixture consisting of methyl ethyl ketor. Acetone and O, 2N hydrochloric acid (2: 1: 6). You active fraction of the eluate giving a positive ferric chloride reaction is used in an amount obtained from 620 ml. This fraction is then concentrated by evaporation in vacuo gives crystals which are separated off and dried. There are 800 mg of crude sclerin as weak yellow colored and crystalline powder obtained. The yield is 10.7 mg per liter of broth.

Claims

Claim:
Sclerin's formula

H ₃ C CH ₃

CH

HO O

1 sheet of drawings