DD268974B3 - Verfahren zur technischen herstellung eines proteolytischen enzymkomplexes - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur technischen Herstellung eines proteolytischen Enzymkomplexes aus Kulturen der technischen Streptomycin-Horstellung. Das Anwendungsgebiet der Erfindunj liegt in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Industrie sowie in Bereichen der Nahrungsgüterwirtschaft.

Charakteristik der bekannten technischen Lotungen

Es ist bekannt (vgl. Patentschrift DD 248141), daß proteolytische Enzymkomplexe aus technischen Kulturlösungen von Antibiotika-Fermentationen von Streptomyceten durch Adsorption an Kieselgel besonders bei Gegenwart höherer lonenstärken einwertiger Metallkationen gebunden und bei niedrigen lonenstärken in Gegenwart von wassermischbaren Lösungsmitteln desorbiert werden. Weiterhin ist bekannt (vgl. Patentschrift DD 264452), daß aus Antibiotika-Fermentationen von Streptomyceten nach Abtrennung des Mycels und einer Vorklärung des Kulturfiltrates durch eine Calciumphosphatfällung aus diesem ein proteolytischer Enzymkomplex durch Adsorption an poröses Kieseigel mit einem mittleren Porendurchmesser von 5nm bis 100nm bei höheren Neutralsalzkonzentrationen von 0,1 kg/l bis 0,15 kg/l bei pH-Werten von pH 7,0 bis 8,0 sowie Temperaturen unter 37⁰C gewonnen wird. Nach mechanischer Abtrennung des Adsorbates wird der proteolytische Enzymkomplex rnt Puffern niedriger lonenstärken, die wassermischbares Lösungsmittel enthalten, bei neutralen pH-Werten eluiert und anschließend mit Neutralsalz gefällt.

Der Hauptnachteil dieser Vorgehensweise besteht darin, daß das ebenfalls zu gewinnende Antibiotikum zwei Aufarbeitungsschritten unterworfen wird (der Phosphatfällung und der Enzymadsorption), die beide zu Antibiotika-Verlusten führen.

Während des Durchlaufens der Adsorptionsstufe wird die lonenstärke stark erhöht. Eine weitgehende Bindung des Antibiotikums an den Ionenaustauscher ist aber erst nach einer aufwendigen Entsalzung möglich, die wiederum mit Verlusten verbunden ist.

Darüber hinaus wird bei der Adsorption des proteolytischen Enzymkomplexes Antibiotikum verschleppt, das später über zusätzliche Reinigungi.schritte aus dem proteolytischen Enzymkomplex wieder entfernt werden muß. Die Klärung des Kulturfiltrates führt mit der zur Entfernung von Mycelresten und Verunreinigungen beschriebenen Ausfällung von Calcium-Phosphatgel in der Kulturfiltratlösung zu nur schwer kontrollierbaren Verlusten an proteolytischer Aktivität. Außerdem tritt bei der Zugabe von Kochsalz zur Erhöhung der lonenstärke eine Nachfällung von Calcium-Phosphatgel ein; hierdurch wird die Abtrennung des Enzymkomplex-Kieselgel-Adsorbates bzw. des Kieselgels während der Adsorption bzw. der Desorption erheblich gestört. Nachteilig ist ferner, daß der zur Klärung eingesetzte Schritt der Calciumphosphatfällung bei den lonenstärken, die in den Kulturfiltratlösungen vorliegen, nur in geringem Maße zu einer Entfernung von Farbstoffen und Fremdproteinen führt. Diese Verunreinigungen sättigen teilweise Adsorptionssteljen an Kieselgel ab, die dann nicht für den proteolytischen Enzymkomplex zur Verfügung stehen, d. h., ein entsprechender Mehreinsatz von Kieselgel muß vonstatten gehen. Diese Verunreinigungen müssen außerdem durch nachgeschaltete Reinigungsschritte entfernt werden. Des weiteren ist die in den angegebenen bekannten Verfahren beschriebene Abtrennung des Enzymkomplex-Kieselpel-Adsorbates mit Hilfe der Zentrifugation für technische Aufarbeitungen nachteilig, da auf Grund des hohen Feststoffnnteiles ein häufiges Entleeren der Separatoren notwendig ist. Der hohe Feuchtigkeitsanteil in diesem Prozeßschritt führt zur zusätzlichen Übertragung von Verunreinigungen aus Nährboden, Antibiotikum und Salz. Der Salzanteil im Kieselgel-Enzymkomplex-Adsorbat bestimmt je

nach Menge wieder das Volumen des benötigten Desorptionspuffers, so daß bei höheren Salzmengen im Enzymkomplex-Kieselgel-Adsorbat entsprechend größere Desorptionspuffermengen eingesetzt werden müssen. Dadurch erhöht sich der notwendige Aufwand für weitere Konzentrierungsschritte.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, aus technischen Streptomycin-Fermentationen neben dem Antibiotikum auf einfachem Wege einen proteolytischen Enzymkomplex herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Aufarbeitungsverfahren für technische Streptomycin-Fermentationslösungen zu beschreiben, bei dem unter Anwendung einer Adsorption/Desorptionsprozedur neben dem Antibiotikum ein neuer proteolytischer Enzymkomplex gewonnen werden kann

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in einem in den generellen Stufen

a) Vorreinigung der bei der Kultivierung von Streptomycin-Bildnern der Art Streptomyces griseuk anfallenden technischen Fermentationslösungen,

b) Abtrennung der Biomasse sowie der Im Ergebnis von Stufe a) entstandenen Festprodukte und

c) Isolierung des proteolytischen Enzymkomplexes neben dem Antibiotikum, erforderlichenfalls nach Einschaltung weiterer Vorreinigungen

ablaufenden Aufarbeitungsverfahren gelöst.

Dazu werden in der Stufe a) in die technisch β ,Fermentationslösung einer 150- bis 200stündigen Kultur von S. grlseus obiger Kennzeichnung bei einer Temperatur unter 37⁰C sowie bei pH-Werten über pH 5,0 nc :heinander Formalin, vorzugsweise 30%lge Formalinlösung in Konzentrationen von 2,5ml/l bis 60ml/1, sowie Kaolin, vorzugsweise feingemahlenes Kaolin-Produkt in Konzentrationen von 5g/l bis 40 g/l, und vorneutralisierte Oxalsäure eingerührt. Die Stufe a) des Gesamtverfahrens kann insbesondere dann vorteilhaft ausgeführt werden, wenn - nachdem Formalinlösung und Kaolin-Produkt obiger Beschaffenheit In einem 1Ominütigem Rührprozeß zugesetzt worden sind-vorneutralisierte Oxalsäure von pH 5,0 bis pH 7,0 in Konzentrationen von 1,5g/l bis 5,0 g/l der Aufarbeitungslösung beigegeben wird und anschließend nochmals 60 Minuten gerührt wird. Nach dem Rühren werden in der Verfahrensstufe b) in an sich bekannter Weise über Separatoren das Mycel sowie die im Gefolge von Stufe a) vorliegenden Feststoffe vom Kulturfiltrat abgetrennt. Im Zusammenhang mit der dargestellten Erfindung ist hierbei der Befund wesentlich, daß aus einer so behandelten technischen Fermentationslösung von S. grlseus unter schwach alkalischen Bedingungen lediglich das Streptomycin an den jeweils eingesetzten Ionenaustauscher gebunden wird. Der proteolytische Enzymkomplex hingegen verbleibt in Lösung, d. h„ nach einem ionenaustauscherschritt wird eine Rohlösung gewonnen, die nur noch 5% bis 10% der ursprünglichen Streptomycin-Konzentration sowie den durch die voranstehend beschriebenen Schritte bereits vorgereinigten Enzymkomplex enthält.

Auf der Grundlage dieses Befundes wird am Beginn der Verfahrensstufe c) vorzugsweise in an sich bekannter Waise mittels lonenaustauschchromatographie somit zunächst das Antibiotikum abgetrennt.

Zur Fortsetzung der Gesamtaufarbeitung werden anschließend jeweils an sich bekannte Methoden der Enzymkonzentration und der Enzymreinigung eingesetzt. Vorteilhaft kommen in dieser Verfahrensstufe bei der weiteren Reinigung der o. a. Rohlösung vor allem

- eine Bentonit-Behandlung (gemäß Patentschrift DD 248141) sowie

- eine Kieselgel-Adsorption mit nachfolgender Desorption des proteolytischen Enzymkomplexes im schwach alkalischen Milieu mittels CaClj/Glycln-haltigem Desorptionspuffer (gemäß Teilen der technischen Lehren aus den Patentschriften DD 248141 und DD 264452 zur Anwendung, wobei das nach der Desorption anfallende Kieselgel durch eine'nochmalige Wäsche mit einer Wassermenge, die der Desorptionspuffermenge entspricht sowie durch eine abermalige Suspension in Wasser und durch Ansäuerung auf pH-Werte zwischen pH 5,0 und pH 6,0 regeneriert wird, so daß es (nach Abtrennung des Wassers) als Feuchtprodukt erneut zur Adsorption eingesetzt werden kann.

Aus der Realisierung dieses Verfahrensabschnittes vorliegenden Desorptionswaschwasserlösung wird durch Ausfällung mit Neutralsalz, vorzugsweise mit Ammoniumsulfat, schließlich als Zielprodukt der proteolytische Enzymkomplex in weitgehend reiner Form sowie in guten quantitativen Ausbeuten erhalten. Aus einer '.-'ermentationslösung mit einer proteolytischen Anfangsaktivität von 1 Kunitz-Einheit/ml werden 0,5 mg bis 1,0 mg protuolytischer Enzymkomplex/ml mit einer spezifischen Aktivität von 0,5 bis 0,65 Kunitz-Einheiten/mg Protein gewonnen.

Die nach diesem Verfahren hergestellten wäßrigen Lösungen des proteulytischen Enzymkomplexes stellen auf Grund ihrer fermentationsspezifischen Komponentenzusammensetzung ein neues technisches Produkt mit hoher enzymatischer Aktivität und breitem Hydrolysespektrum dar, welches beispielsweise in der Backwarenindustrie, im Gesundheitswesen, bei der Herstellung von Proteinhydrolysaten sowie als Forschungshilfsmittel eingesetzt werden kann.

Das beschriebene Verfahren bringt zum einen den Vorteil mit sich, daß das Streptomycin bereits nach der Mycelabtrennung isoliert wird und somit ohne Verluste, die durch die Aufarbeitungsschritte zur Gewinnung des proteolytischen Enzymkomplexess bedingt sind, gewonnen werden kann. Weiterhin werden auf diese Weise jene technologischen Schwierigkeiten bei der Adsorption des Antibiotikums am Ionenaustauscher, die durch eine hohe lonenstärke in der Kulturfiltratlösung verursacht sind, vermieden. Durch die Entfernung des Antibiotikums bereits in dieser Stufe des Gesamtverfahrens wird in der Desorptionsstufe einer anschließend durchgeführten Kieselgeladsorption zum anderen ein nahezu Streptomycinfreier proteolytischer Enzymkomplex erhalten, d. h„ aufwendige Anschlußreinigungen (zur Entfernung von Resten des Antibiotikums) können entfallen. Insgesamt wird durch die vorgeschlagenen Behandlungsschritte, insbesondere durch die Adsorption mittels Kaolin in Verbindung mit der lonenaustauscherchromatographie, eine so gute Vorreinigung erzielt, daß für ausgewählte technische Anwendungen überhaupt auf eine weitere Reinigung des Enzymkomplexes verzichtet werden kann.

AusfÜhruniisonlsplele Beispiel 1

2,6m³ einer 150- bis 200stündigen Fermentation von Streptomyces grlseus mit einer proteolytischen Aktivität von 1 Kunitz-Einheit/ml Kulturfiltrat werden bei einer Temperatur von 28⁰C mit 6,25 Liter 30%igerFormalinlösung und 25 kg feingemahlenem Kaolin versetzt und anschließend 10 Minuten gerührt. Danach werden 6kg vorneutralisierte Oxalsäure zugegeben. Hierzu werden 6 kg Oxalsäure x 2 H₂O in 50 LiterWasser zusammen mit 0,5 kg Natriumacetat (wasserfrei) gelöst, und diese Lösung wird mit Natronlauge auf pH 5,0 eingestellt. Diese Natriumoxalatlösung wird der Kultur zugegeben, wobei der pH-Wert nicht unter pH 5,0 absinken darf; danach wird 30 Minuten gerührt. Anschließend wird die so vorbehandelte Kiiturlösung über einen selbstaustragenden Separator separiert, wobei die Biomasse, das Kaolinadsorbat und als weiteres Festprodukt Calciumoxalat vom Kulturfiltrat getrennt werden. Nach der Separation werden etwa 2 m³ vorgeklärtes Kulturfiltrat erhalten. Der pH-Wert des Kuiturfiltrates wird mit der Natronlauge auf pH 7,8 eingestellt. Dieses Kulturfiltrat wird dann über eine lonenaustauschersäule gegeben, die mit 300 Liter aktiviertem Ionenaustauscher (vorzugsweise Wofatit CP 300) gefüllt ist. Das aus der lonenaustauschersäule ausfließende Kulturfiltrat wird in einem 3-m³-Rührbehälter gesammelt, der pH-Wert mit Schwefelsäure auf pH 5,5 eingestellt und mit 1 kg vorgequollenem Bentonit AO versetzt. Dazu wird 1 kg Bentonit A018 Stunden zuvor mit 3 Liter Wasser angerührt und dieser Suspension 12,5ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt. Vor dem Einrühren in das Kulturfiltrat wird der pH-Wert der Bentonit-Suspension auf pH 5,0 eingestellt. Nach 15minüt!gem Rühren wird das Bentonit über einen selbstaustragenden Separator vom Kulturfiltrat abgetrennt. Der pH-Wert der Lösung wird kontrolliert und gegebenenfalls mit Schwefelsäure auf pH 5,5 nachgestellt. Danach werden der Kulturfiltratlösung 60g Kochsalz/l zus««»tzt und durch Rühren gelöst. In diese Lösung werden nun 70g Kieselgel/I Kulturfiltrat (vorzugsweise Köstrosorb, Chemiewerk Bad Köstritz) eingerührt und die entstehende Suspension 40 Minuten gerührt. Anschließend wird über einen mit Precosit bekgten Vakuumdrehzellenfilter (mit einer Filterfläche von 3,2 m²) das Enzymkomplex-Kieselgel-Adsorbat vom Kulturfiltrat abgetrennt. Das anfallende Filtrat wird verworfen. Das abgetrennt» trockene Adsorbat wird in 200 Litern Desorptionspuffer, der 0,01 MCaCI₂, 10% (v/v) Ethanol und 20g Glycin enthält und mit Natronlauge auf pH 9,0 eingestellt ist, suspendiert. Nach Zugabe des gesamten Adsorbats wird der pH-Wert dos Desorptionapuffers mit 20%lger Natronlauge so lange nachgestellt, bis der Soll-Wert pH 9,0 wieder erreicht ist. Nach 15minütigem Rühren bei diesem pH-Wert wird die Suspension erneut über einen mit Precosit belegten Vakuumdrehzellenfilter (mit einer Filterfläche von 0,3 m²) abgetrennt. Während des Absaugevorganges wird das aufgezogene Kieselgel nochmals mit Wasser besprüht, wobei die gesamte Wassermenge 100 Liter nicht überschreiten darf. Die gesamte Desorptionspuffermenge, einschließlich des Waschwassers, wird vereinigt, und dieser Lösung werden 10 Liter Ethanol zugesetzt. Der proteolytische Enzymkomplex wird aus dieser Lösung durch Zugabe von 125kg Ammoniumsulfat ausgefällt. Es werden nach Separation des ausgefallenen Präzipitates 2 kg Protein erhalten, in dem der proteolytische Enzymkomplox mit einer spezifischen proteolytischen Aktivität von 0,52 Kunitz-Einheiten/mg Protein vorliegt. Zur Ermittlung der protoolytischen Aktivität:

Für die Bestimmung der proteolytischen Aktivität wird jeweils 1 ml Probe mit 5ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung gefällt und für 18 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Danach wird das Präzipitat zentrifugiert, der Überstand abgegossen sowie das Präzipitat in 1 ml Wasser gelöst. Dieses gelöste Präzipitat wird erneut zentrifugiert.

Von der erhaltenen klaren Lösung werden entsprechende Verdünnungen mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,6, angelegt. Diesen Verdünnungen wird je 1 ml Probelösung entnommen und mit 1 ml 1 %iger Caseinlösung (1 g Casein nach Hammerstein, gelöst in 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,6) versetzt sowie bei 35⁰C für 20 Minuten im Wasserbad inkubiert. Danach werden diesen Proben 3 ml 5%ige Trichloressigsäure zugegeben und diese Präparationen 30 Minuten bei Raumtemperatur stehnn gelassen. Anschließend wird durch Zentrifugation das Präzipitat entfernt und in den klaren Probelösungen gegen entsprechende Blindproben die Extinktion bei 280nm in 1-cm-Küvetten gemessen.

Beispiel 2

20m³ Kulturlösung einer 200stündigen Fermentation von S. griseus mit einer proteolytischen Aktivität von 3,1 Kunitz-Einheiten/m' Kulturfiltrat werden bei diner Temperatur von 27⁰C mit 50 Litern Formalin (30%ig), mit 100kg Kaolinpulver und mit 50kg vorneutralisierter Oxalsäure, hergestellt gemäß der Vorschrift von Beispiel 1, versetzt sowie anschließend 30 Minuten gerührt. Die Acidität der Kultur liegt hier bei pH 5,8. Anschließand wird die Kulturflüssigkeit mit einem Separator von den Feststoffen getrennt. Das so vorbehandelte Kulturfiltrat wird dann in einer lonenaustauschersäule weitgehend von Streptomycin befreit, und der nach diesem Chromatographie-Schritt gesammelte Durchlauf wird mit 25kg wasserfreiem CaCI₂ versetzt. Die damit gewonnene Rohenzymlösung, die noch etwa 500mg/l Rest-Streptomycin enthält, wird bei 25⁰C im Vakuum schließlich auf 15% ihres Ausgangsvolumens eingeengt. Es werden 2m³ Konzentrat mit 16 Kunitz-Einheiten/ml erhalten.

In Betracht gezogene Druckschrift: DD 248141

Claims (3)

1. Verfahren zur technischen Herstellung eines proteolytischen Enzymkomplexes aus technischen Fermentationslösungen eines Streptomycin-Bildners der Art Streptomyces grfseus, ablaufend in den Stufen

a) Vorreinigung

b) Abtrennung der Biomasse sowie der im Ergebnis von Stufe a) entstandenen Festprodukte und

c) Isolierung des Zielprodukts neben dem Antibiotikum, erforderlichenfalls nach Einfügung weiterer Vorreinigungen,

dadurch gekennzeichnet, daß man

- inderVerfehrensstufea) in die technische Fermentationslösung bei ainer Temperatur unter 37⁰C sowie bei pH-Werten über pH 5,0 nacheinander Formalin, Kaolin sowie vorneutralisierte Oxalsäure einrührt und

- am Beginn der Verfahrensstufe c) zuerst das Streptomycin-Produkt abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in die technische Fermentationslösung 30%ige Formalinlösung in Konzentrationen von 2,5 ml/l bis 50 ml/l sowie feingemahlenes Kaolin in Konzentrationen von 5g/i bis 40g/l einrührt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in die technische Fermentationslösung Formalinlösung und Kaolin obiger Beschaffenheit für die Dauer von bis zu 10 Minuten einrührt und anschließend in Konzentrationen von 1,5g/l bis 5g/l vorneutralisierte Oxalsäure mit pH-Werten von pH 5,0 bis pH 7,0 zusetzt.