DD266584A1

DD266584A1 - Verfahren zur mikrobiellen wachstumsassoziierten gewinnung von intracellulaeren nichtproteinischen stoffwechselprodukten

Info

Publication number: DD266584A1
Application number: DD31065587A
Authority: DD
Inventors: Karl Sattler; Ursula Hilger; Wolfgang Babel; Ute Littkowsky
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-12-17
Filing date: 1987-12-17
Publication date: 1989-04-05

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen wachstumsassoziierten Gewinnung von intracellulaeren nichtproteinischen Stoffwechselprodukten. Das Verfahren dient zur Gewinnung von intracellulaeren nichtproteinischen Stoffwechselprodukten, wie Lipide und Kohlenhydrate, und kann in der mikrobiologisch/biotechnologischen Industrie angewendet werden. Die wachstumsassoziierte Produktgewinnung wird erfindungsgemaess durchgefuehrt, indem die Vorkultivierung von solchen Mikroorganismen, die die Faehigkeit zur intracellulaeren Phosphatspeicherung besitzen, auf Naehrmedien mit Phosphatueberschuss und die weitere Kultivierung auf Naehrmedien, in denen die Phosphatquelle fehlt oder limitiert ist, durchgefuehrt wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrowellen Produktsynthese und kann für die Gewinnung intracellulärer nlchtprotoinischer Sioffwechselprodukte, wie Lipide und Kohlenhydraten, angewendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Für alle Produktsyntheson gilt die Beziehung, daß ihre Produktivität dor Zellkonzentration proportional ist. Der Gültigkeitsbereich dieser Proportionalität ist allerdings meist stark eingeschränkt (K. Sattler, L. Wünsche, Acta Biotechnologica 3 [1983], 345), so daß die darin liegenden Möglichkeiten zur Erhöhung der Produktivität nur wenig genutzt werden können. Eine der Ursachen ist, daß die katalytisch aktiven Zellen durch technologische Maßnahmen, wie Limitation oder Mangel eines oder mehrerer für das Zellwachstum essentieller Nährstoffe (meist N) bei gleichzeitigem Überschuß der C-Quello an der Vermehrung gehindert oder darin eingeschränkt werden (EP 0015669, EP 0046344) und demzufolge proteolytischem Abbau, der Dü.uituriorung polymerer Zellbestandteile und der Inaktivierung ausgesetzt sind. Dieser Nachtoil kann gemindert werden, incOm die Produktbildungsphas9 unterbrochen wird, eine oder mehrere Phasen der Vermehrung eingeschaltet werden oder dio Versorgung mit den für das Wachr.tum essentiellen Nähr- und Spurenstoffen von Beginn der Kultivierung an beschränkt wird (EP 046344). Der Nachteil solcher Verfahren besteht darin, daß sowohl die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit als auch die Produktbildungsgeschwindigkeit herabgesetzt sind.

Andere Ursachen für eine zur Zellkonzentration nicht proportionale Produktbildung sind Mängel des Nährmediums, die durch Ausfällung von Spurenelementen oder, unter Praxlsbodingungen, durch das Aufkommen von Substratkonkurrenten entstehen.

Produktsynthosen, deren pH-Optimum im Neutralbereich oder im Alkalischen liegt, sind dadurch benachteiligt, daß in solchen Medien überschüssige Phosphate bereits in der Wachstumsphase eine Ausfüllung verschiedener Metallionen bewirken, die für die Produktbildung oder als Permeabilitätsvermittler eine Bedeutung haben (z. B. Fe**, Co**, Ca**). Externes Phosphorangebet erleichtert außerdem das Aufkommen von Substratkonkurrenten, insbesondere während der Produktbildungsphase bei hohen Zellkonzentrationen, wo Antolyseprodukte ohnehin günstige Entwicklungsbedingungen für Substratkonkurrenten bieten.

Ziel der Erfindung

Ziel dor Erfindung ist ein Vorfaoron zur mikrobiollen Produktsynthose, das die Hesynthese, Vermehrung, Stabilisierung und Aktivierung der produktbildenden Zellen gewährleistet und damit zur Erhöhung der Produktivitäten und Produktkonzontrationen fjhrt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur intracellulären mikrowellen Produktsynthese unter wachstumsas&oziierten Bedingungen durchzuführen, insbesondere überschüssigen externen Phosphor im Nährmedium bei der Kultivierung zu vermeiden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß die Bereitung der Impfkultur und die Vorkultivierung von solchen Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur intracellulären Phosphatspeicherung besitzen, auf Nährmedien mit Phosphatüberschuß und die weitere Kultivierung, die Wachstum und Produktsynthese beeinhaltet, auf Nährmedion, in denen die Phosphatquelle fehlt oder limitiert ist, durchgeführt w rd. Als Mikroorganismen werden Bakterien, Hefen oder Algen eintiesutzt.

Ein Medium üblicher Zusammensetzung mit Mineralsalzen, unterschiedlichen Kohlenstoffquellen (Methanol, Glucose, Melasse oder Kohlenwasserstoffe), mit oder ohne Supplinen (Hofeextrakt, Pepton) und mit einem Phospiiorgehalt zwischen 50 und 300mg/1 wird nach der !sterilisation mit dem auf gleichom Medium vorkultivierten Stamm beimpft, so daß die Anfangskooientration der Zellsubstanz 0,5-1 g/Liter beträgt.

Auf diesem Medium erfolgt innerhalb von 5-12 Stunden ein oxpcntiollos Wachstum der Zellen. Während der exponontiollon

Phase wird der im Überschuß vorhandene Phosphor als Polyphosphat In den 7ell9n bis aufwerte um 3% der Zelltrockensubstanz

akkumuliert. Beim Übergang von der e/ponontiellen in die stationäre Phase findet eine erste Produktakkumulation statt.

Die weitere Kultivierung erfolgt unter fod-batch- oder Chemostatbedingungen in einem im wesentlich in unveränderten oder in seiner Zusammensetzung völlig abweichenden Nährmodium, aber immer unter Phosphorlimltatlon oder Phosphormangel,

innerhalb eines Zeitraumes von 24-96 Stunden. Diese Verminderung der Beendigung der Phosphorzufuhr vermindert oder böondot wedor das Wachstum noch die Produktbildung. Bei unvermindert fortdauerndem Wachstum tritt Im Gegenteil eine gegenüber anderen Llmltationsarten verstärkte Produktbildung auf. Die intracollulör gespeicherten Polyphosphate reichen aus, um in einen phosphatarmen oder phosphatfrolen Medium die Zellkonzontration noch um das Drei- bis Zehnfache zu steigern. In der gleichen Größenordnung odoi stärker nimmt auch die Produktakkumulation pro Zelle zu. Dadurch werden sowohl die Produktivität als auch die spezifische Produktbildungsrate wesentlich erhöht.

Die Fähigkeit von Mikroorganismen zur intracellulären Speicherung von oxtracellulären Phosphorquellon schafft optimale Bedingungen für eine wachstumsassoziiorte Produktbildung, indem solche Stämme sowohl mit einer intracellulären Phosphorais auch Energieque'le ausgestattet werden. Der Vorteil einer intracelluläron Phosphorquello besteht darin, daß Phosphatfällung von Spurenelemer (er, im Nährmedium während der Produktbildungsphase nicht möglich ist, auch wenn es sich um ein Medium mit neutralem od r alkalischem pH-Wert hnndolt, und daß kein Phosphor für die Entwicklung von Substratkonkurrenton zur Verfugung steh J^!n weiterer Vorteil besteht darin, daß die während der Phase der wachstumsassoziierten Produktbildung im Medium befindliche Kohlensloffquello in einem verminderten Umfang als Energiequelle in Anspruch genommen wird und demzufolge die Wachstums- und Produktausbeute steigt. Wachstumsassoziation hat den Vorteil, daß infolge der siändigen Resynthese eine Stabilisierung der Produzentenzellen st&ttflndet und bis in hohe Zellkonzentrationen (60g/Llter) die Proportionalität zwischen Zellkonzentration und Produktbildung gewahrt werden kann.

Ausführungsbeispiel

Folgende Belsp' ie sollen die Erfindung näher erläutern:

Beispiel 1

Mit Hilfe der Volutinfärbung wurde bei dem methanolassimilierenden Hefestamm Hansenula polymorpha M/H30 unter Phosphorüberschußbedingungon eine starke Intracelluläre Akkumulation von Polyphosphaton nachgewiesen. Die Kultivierung erfolgte bei T = 30°C, pH-Wert 5 auf einem Mineralsalzmedium üblicher Zusammensetzung und Methanol als Kohlonstoffquelle.

Nach Erreichen der exponentiellon Wachstumsphase wurde die Kultivierung unter Chemostatbedingungen

jjmax

fortgesetzt,

einmal bei C-Limitatlon und einmal P-Limitation, untersucht wurde die intracelluläre Akkumulation von Trehalose. Die Tabelle zeigt die daboi erzielton Werte:

Chemostatbedingungen bei

Umax

C-Limitation P-Llmitation

Biomasse (gHTS/l)

5 15

Phosphor (in % HTS)

2,6 0,9

Trehalose (in % HTS)

1,5 10,0

Während dos exponentiellen Wachstums und noch ausgeprägter unter C-Lirr.itation, wird Phosphor bis zu 3% in der Hefetrockensubstanz angereichert, überwiegend als Polyphosphat.

Bei P-Limitation nimmt der Phosphorgehalt der Biomasse auf ein Drittel ab. Polyphosphateinlagcrungen sind färbetechnisch nicht mehr nachweisbar. Während sich die Biomasse verdreifacht, steigt für das Produkt Trehalose die spezifische Produktbildungsrate etwa um das 7fache und die Produktivität etwa um das 20fache.

Beispiel 2

Wie im Beispiel 1 wurde auch bei dem Hofestamm Candida utiles H92 eine ausgeprägte Disposition zur intraceilulären Polyphosphatbildung festgestellt. Die Kultivierung erfolgto auf einem analogen Medium und untüi gloichon Milieubedingungen. Als Kohlenstoffquelle diente Glycerol. Untersucht wurde die intracelluläre Akkumulation von Glycogen. >

Die Tabelle zeigt die daboi erzielten Werte

Chomostatbedingungen	Biomasse	Phosphor	Trehaiose
bei ^μ™^χ	(gHTS/l)	(in % HTS)	(in % HTS)
C-Limitation	5	2,8	1
P-Limitation	15	1,0	12

Auch in diesem Fall sinkt bei P-Limitation der Phosphorgehatt der Biomasse auf ein Drittel ab und die Polyphosphateinlagerungen verschwinden. Während sich die Biomasse verdreifacht, steigt für das Produkt Glycogen die spezifische Produktbildungsrate um das 12facho »ind die Produktivität um dan 36fache.

Beispiel 3

Verwendet wird der Bakterienstamm MB 126. Dieses Bakterium Ist gramnegativ, mothanolassimilierond und fähig zur Akkumulation von Polyphosphaton und Poly-ß-r ydroxybuttersäure. Die Haltung erfolgt auf einem üblichen Nähragar mit Methanol als Kohlenstoffquelle, einem Phosphorgehalt von 60-150 mg/l, bei pH 6,5 und 3ü°C. Die Vorkultivierung des Inokulums

wird in Erlenmyerkolben auf einer Nährsalzlösung durchgeführt, die alle Komponenten im Überschuß enthält und deren Phosphorgehalt so berechnet ist, daß nach Verbrauch der Kohlenstoffquelle die Phosphorkonzentration im Medium S 50 mg P/l beträgt.

Im Fermontor ei folgt nach der Beimpfung, die im Verhältnis 1:10 durchgeführt wird, ein diskontinuierliches Wachstum in einer

Nährlösung,' Ie alle Komponenten Im Überschuß enthält, außer Mothanol als C-Quello. Dieses wird so zugesetzt, daß dlo aktuelle Konzentration im Bereich von 200—400mg/1 Hegt. Der Phosphorgehalt cJiosor Nährlösung beträgt 150mg/1. Je nach Anlmpfungsdlchto (0,1-0,5 BTS/I) folgt ein kurzes, etwa 3-8st('inüiges exponentiell Wachstum bis auf eine Biomassokonzentration von 1-1,5g BTo/l. Daboi wird der im Medium enthaltene Phosphor aufgebraucht und intracellulär angereichert. Das weitere Wachstum erfolgt über 48 Stundon in einem Medium ohne extracellulären Phosphor, wobei sich die Biomasse verzehnfacht und gleichzeitig eine verstärkte PHB-Akkumulatlon stattfindet, Es wird ein PHB-Gehalt von 56-60% der Bakterientrockensubstanz erreicht.

Gegenüber der N-Limitation wird die Produktbildungsrate verdoppelt, die Produktivität um 60% erhöht und der PHB-Ertragskoeffizlent um 45% gesteigert.

Claims

1. Verfahren zur mikrowellen wachstumsassoziierten Gewinnung von intracellulären nichtproteinischen Stoffwechselprodukten, wie beispielsweise Poly-ß-hydroxybuttersäure oder Trehalose, gekennzeichnet dadurch, daß die Bereitung der Impfkultur und die Vorkultivierung von solchen Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur intracellulären Phosphatspeicherung besitzen, auf Nährmedien mit Phosphatüberschuß und die weitere Kultivierung mit Wachstum und Produktsynthese auf Nährmedien, in denen die Phosphatquelle fehlt oder limitiert ist, durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Mikroorganismen Bakterien, Hefen oder Algen eingesetzt werden.