DD266584A1

DD266584A1 - METHOD FOR MICROBIAL GROWTH-ASSOCIATED RECOVERY OF INTRACELLULAR NON-PROTEIN METABOLIC PRODUCTS

Info

Publication number: DD266584A1
Application number: DD31065587A
Authority: DD
Inventors: Karl Sattler; Ursula Hilger; Wolfgang Babel; Ute Littkowsky
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-12-17
Filing date: 1987-12-17
Publication date: 1989-04-05

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen wachstumsassoziierten Gewinnung von intracellulaeren nichtproteinischen Stoffwechselprodukten. Das Verfahren dient zur Gewinnung von intracellulaeren nichtproteinischen Stoffwechselprodukten, wie Lipide und Kohlenhydrate, und kann in der mikrobiologisch/biotechnologischen Industrie angewendet werden. Die wachstumsassoziierte Produktgewinnung wird erfindungsgemaess durchgefuehrt, indem die Vorkultivierung von solchen Mikroorganismen, die die Faehigkeit zur intracellulaeren Phosphatspeicherung besitzen, auf Naehrmedien mit Phosphatueberschuss und die weitere Kultivierung auf Naehrmedien, in denen die Phosphatquelle fehlt oder limitiert ist, durchgefuehrt wird.The invention relates to a method for the microbial growth-associated production of intracellular non-proteinaceous metabolites. The method is for the recovery of intracellular non-proteinaceous metabolites, such as lipids and carbohydrates, and can be used in the microbiological / biotechnology industry. The growth-associated product recovery is carried out according to the invention by carrying out the precultivation of microorganisms which have the capacity for intracellular phosphate storage on nutrient media with phosphate excess and further culturing on nutrient media in which the phosphate source is absent or limited.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrowellen Produktsynthese und kann für die Gewinnung intracellulärer nlchtprotoinischer Sioffwechselprodukte, wie Lipide und Kohlenhydraten, angewendet werden.The invention relates to the field of microwave product synthesis and can be applied to the recovery of intracellular late-protoinic metabolites, such as lipids and carbohydrates.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Für alle Produktsyntheson gilt die Beziehung, daß ihre Produktivität dor Zellkonzentration proportional ist. Der Gültigkeitsbereich dieser Proportionalität ist allerdings meist stark eingeschränkt (K. Sattler, L. Wünsche, Acta Biotechnologica 3 [1983], 345), so daß die darin liegenden Möglichkeiten zur Erhöhung der Produktivität nur wenig genutzt werden können. Eine der Ursachen ist, daß die katalytisch aktiven Zellen durch technologische Maßnahmen, wie Limitation oder Mangel eines oder mehrerer für das Zellwachstum essentieller Nährstoffe (meist N) bei gleichzeitigem Überschuß der C-Quello an der Vermehrung gehindert oder darin eingeschränkt werden (EP 0015669, EP 0046344) und demzufolge proteolytischem Abbau, der Dü.uituriorung polymerer Zellbestandteile und der Inaktivierung ausgesetzt sind. Dieser Nachtoil kann gemindert werden, incOm die Produktbildungsphas9 unterbrochen wird, eine oder mehrere Phasen der Vermehrung eingeschaltet werden oder dio Versorgung mit den für das Wachr.tum essentiellen Nähr- und Spurenstoffen von Beginn der Kultivierung an beschränkt wird (EP 046344). Der Nachteil solcher Verfahren besteht darin, daß sowohl die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit als auch die Produktbildungsgeschwindigkeit herabgesetzt sind.For all product syntheses, the relation holds that their productivity is proportional to the cell concentration. The scope of this proportionality, however, is usually severely limited (K. Sattler, L. Wünsche, Acta Biotechnologica 3 [1983], 345), so that the possibilities therein for increasing productivity can be used only little. One of the causes is that the catalytically active cells by technological measures, such as Limitation or lack of one or more essential for cell growth nutrients (usually N) with simultaneous excess of C-Quello prevented or restricted in the propagation (EP 0015669, EP 0046344) and, as a result, proteolytic degradation, which is due to the deterioration of polymeric cell constituents and inactivation. This Nachtoil can be reduced, in the Produktbildungsphas9 is interrupted, one or more phases of the propagation be turned on or dio supply with the essential for Wachr.tum nutrients and trace substances from the beginning of cultivation is limited (EP 046344). The disadvantage of such methods is that both the specific growth rate and the product formation rate are reduced.

Andere Ursachen für eine zur Zellkonzentration nicht proportionale Produktbildung sind Mängel des Nährmediums, die durch Ausfällung von Spurenelementen oder, unter Praxlsbodingungen, durch das Aufkommen von Substratkonkurrenten entstehen.Other causes of product formation which are not proportional to the cell concentration are deficiencies of the nutrient medium, which result from the precipitation of trace elements or, under practical conditions, the emergence of substrate competitors.

Produktsynthosen, deren pH-Optimum im Neutralbereich oder im Alkalischen liegt, sind dadurch benachteiligt, daß in solchen Medien überschüssige Phosphate bereits in der Wachstumsphase eine Ausfüllung verschiedener Metallionen bewirken, die für die Produktbildung oder als Permeabilitätsvermittler eine Bedeutung haben (z. B. Fe**, Co**, Ca**). Externes Phosphorangebet erleichtert außerdem das Aufkommen von Substratkonkurrenten, insbesondere während der Produktbildungsphase bei hohen Zellkonzentrationen, wo Antolyseprodukte ohnehin günstige Entwicklungsbedingungen für Substratkonkurrenten bieten.Product syntheses whose pH optimum lies in the neutral range or in the alkaline range are disadvantaged in that excess phosphates already in the growth phase cause a filling of various metal ions which are important for product formation or as permeability mediators in such media (eg Fe *). *, Co **, ca **). External phosphorous addition also facilitates the advent of substrate competitors, especially during the product formation phase at high cell concentrations, where antolysis products in any case provide favorable development conditions for substrate competitors.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel dor Erfindung ist ein Vorfaoron zur mikrobiollen Produktsynthose, das die Hesynthese, Vermehrung, Stabilisierung und Aktivierung der produktbildenden Zellen gewährleistet und damit zur Erhöhung der Produktivitäten und Produktkonzontrationen fjhrt.The goal of the invention is a precursor to microbial product synthesis which assures the synthesis, propagation, stabilization and activation of the product-producing cells, thereby increasing productivities and product concentrations.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur intracellulären mikrowellen Produktsynthese unter wachstumsas&oziierten Bedingungen durchzuführen, insbesondere überschüssigen externen Phosphor im Nährmedium bei der Kultivierung zu vermeiden.The object of the invention is to carry out processes for intracellular microwave product synthesis under growth-induced conditions, in particular to avoid excess external phosphorus in the nutrient medium during cultivation.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß die Bereitung der Impfkultur und die Vorkultivierung von solchen Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur intracellulären Phosphatspeicherung besitzen, auf Nährmedien mit Phosphatüberschuß und die weitere Kultivierung, die Wachstum und Produktsynthese beeinhaltet, auf Nährmedion, in denen die Phosphatquelle fehlt oder limitiert ist, durchgeführt w rd. Als Mikroorganismen werden Bakterien, Hefen oder Algen eintiesutzt.According to the invention, the object is achieved in that the preparation of the seed culture and the pre-cultivation of such microorganisms having the capacity for intracellular phosphate storage on nutrient media with excess phosphate and the further cultivation, which includes growth and product synthesis, on Nährmedion in which the phosphate source is missing or limited, performed. As microorganisms bacteria, yeasts or algae are used.

Ein Medium üblicher Zusammensetzung mit Mineralsalzen, unterschiedlichen Kohlenstoffquellen (Methanol, Glucose, Melasse oder Kohlenwasserstoffe), mit oder ohne Supplinen (Hofeextrakt, Pepton) und mit einem Phospiiorgehalt zwischen 50 und 300mg/1 wird nach der !sterilisation mit dem auf gleichom Medium vorkultivierten Stamm beimpft, so daß die Anfangskooientration der Zellsubstanz 0,5-1 g/Liter beträgt.A medium of conventional composition with mineral salts, different carbon sources (methanol, glucose, molasses or hydrocarbons), with or without supplines (Hofee extract, peptone) and with a Phoioriorgehalt between 50 and 300mg / 1 is after sterilization with the precultivated on gleichom medium strain inoculated so that the initial cocoa content of the cell substance is 0.5-1 g / liter.

Auf diesem Medium erfolgt innerhalb von 5-12 Stunden ein oxpcntiollos Wachstum der Zellen. Während der exponontiollonOn this medium occurs within 5-12 hours an oxpcntiollos growth of the cells. During the exponontiollon

Phase wird der im Überschuß vorhandene Phosphor als Polyphosphat In den 7ell9n bis aufwerte um 3% der ZelltrockensubstanzPhase is the excess phosphorus as polyphosphate in the 7ell9n up to 3% of the cell dry matter

akkumuliert. Beim Übergang von der e/ponontiellen in die stationäre Phase findet eine erste Produktakkumulation statt.accumulated. During the transition from the e / pontential to the stationary phase, a first product accumulation takes place.

Die weitere Kultivierung erfolgt unter fod-batch- oder Chemostatbedingungen in einem im wesentlich in unveränderten oder in seiner Zusammensetzung völlig abweichenden Nährmodium, aber immer unter Phosphorlimltatlon oder Phosphormangel,The further cultivation takes place under fod-batch or chemostat conditions in a substantially unchanged or completely different composition in its composition, but always under Phosphorlimltatlon or phosphorus deficiency,

innerhalb eines Zeitraumes von 24-96 Stunden. Diese Verminderung der Beendigung der Phosphorzufuhr vermindert oder böondot wedor das Wachstum noch die Produktbildung. Bei unvermindert fortdauerndem Wachstum tritt Im Gegenteil eine gegenüber anderen Llmltationsarten verstärkte Produktbildung auf. Die intracollulör gespeicherten Polyphosphate reichen aus, um in einen phosphatarmen oder phosphatfrolen Medium die Zellkonzontration noch um das Drei- bis Zehnfache zu steigern. In der gleichen Größenordnung odoi stärker nimmt auch die Produktakkumulation pro Zelle zu. Dadurch werden sowohl die Produktivität als auch die spezifische Produktbildungsrate wesentlich erhöht.within a period of 24-96 hours. This reduction in the termination of phosphorus supply decreases or böondot the growth nor growth of the product. On the contrary, with continued growth, there is an increased product formation compared to other types of treatment. The intracollulör stored polyphosphates are sufficient to increase the Zellkonzontration in a phosphate-poor or phosphate-free medium by three to ten times. In the same order of magnitude, the product accumulation per cell also increases. This significantly increases both the productivity and the specific product formation rate.

Die Fähigkeit von Mikroorganismen zur intracellulären Speicherung von oxtracellulären Phosphorquellon schafft optimale Bedingungen für eine wachstumsassoziiorte Produktbildung, indem solche Stämme sowohl mit einer intracellulären Phosphorais auch Energieque'le ausgestattet werden. Der Vorteil einer intracelluläron Phosphorquello besteht darin, daß Phosphatfällung von Spurenelemer (er, im Nährmedium während der Produktbildungsphase nicht möglich ist, auch wenn es sich um ein Medium mit neutralem od r alkalischem pH-Wert hnndolt, und daß kein Phosphor für die Entwicklung von Substratkonkurrenton zur Verfugung steh J^!n weiterer Vorteil besteht darin, daß die während der Phase der wachstumsassoziierten Produktbildung im Medium befindliche Kohlensloffquello in einem verminderten Umfang als Energiequelle in Anspruch genommen wird und demzufolge die Wachstums- und Produktausbeute steigt. Wachstumsassoziation hat den Vorteil, daß infolge der siändigen Resynthese eine Stabilisierung der Produzentenzellen st&ttflndet und bis in hohe Zellkonzentrationen (60g/Llter) die Proportionalität zwischen Zellkonzentration und Produktbildung gewahrt werden kann.The ability of microorganisms for the intracellular storage of oxtracellular phosphorus source provides optimal conditions for growth-associated product formation by endowing such strains with both an intracellular phosphorus and energy source. The advantage of an intracellular phosphorus source is that phosphate precipitation of trace element (s) is not possible in the nutrient medium during the product formation phase, even if it is a medium of neutral or alkaline pH, and that no phosphorus is involved in the development of substrate competitor clay for grouting stand ^J! n another advantage is that the Kohlensloffquello present in the medium during the phase of growth-associated product formation is made in a reduced circumference as an energy source to complete and accordingly, the growth and product yield increases. growth association has the advantage that due to the In addition to stable resynthesis, stabilization of the producer cells is possible and the proportionality between cell concentration and product formation can be maintained until high cell concentrations (60 g / L).

Ausführungsbeispielembodiment

Folgende Belsp' ie sollen die Erfindung näher erläutern:The following Belp 'ie to explain the invention in more detail:

example 1

Mit Hilfe der Volutinfärbung wurde bei dem methanolassimilierenden Hefestamm Hansenula polymorpha M/H30 unter Phosphorüberschußbedingungon eine starke Intracelluläre Akkumulation von Polyphosphaton nachgewiesen. Die Kultivierung erfolgte bei T = 30°C, pH-Wert 5 auf einem Mineralsalzmedium üblicher Zusammensetzung und Methanol als Kohlonstoffquelle.Volotine staining revealed a strong intracellular accumulation of polyphosphate in the methanolassimilating yeast strain Hansenula polymorpha M / H30 under excess phosphorus. The cultivation was carried out at T = 30 ° C, pH 5 on a mineral salt medium of conventional composition and methanol as Kohlonstoffquelle.

Nach Erreichen der exponentiellon Wachstumsphase wurde die Kultivierung unter ChemostatbedingungenAfter reaching the exponential growth phase, cultivation under chemostat conditions

jjmaxjjmax

fortgesetzt,continued

einmal bei C-Limitatlon und einmal P-Limitation, untersucht wurde die intracelluläre Akkumulation von Trehalose. Die Tabelle zeigt die daboi erzielton Werte:Once at C-limitatlon and once P-limitation, the intracellular accumulation of trehalose was examined. The table shows the daboi achieved values:

Chemostatbedingungen beiChemostat conditions at

UmaxUmax

C-Limitation P-LlmitationC-Limitation P-Lmitation

Biomasse (gHTS/l)Biomass (gHTS / l)

5 155 15

Phosphor (in % HTS)Phosphorus (in% HTS)

2,6 0,92.6 0.9

Trehalose (in % HTS)Trehalose (in% HTS)

1,5 10,01.5 10.0

Während dos exponentiellen Wachstums und noch ausgeprägter unter C-Lirr.itation, wird Phosphor bis zu 3% in der Hefetrockensubstanz angereichert, überwiegend als Polyphosphat.During exponential growth and even more pronounced under C-Lirr.itation, phosphorus accumulates up to 3% in the yeast dry matter, predominantly as a polyphosphate.

Bei P-Limitation nimmt der Phosphorgehalt der Biomasse auf ein Drittel ab. Polyphosphateinlagcrungen sind färbetechnisch nicht mehr nachweisbar. Während sich die Biomasse verdreifacht, steigt für das Produkt Trehalose die spezifische Produktbildungsrate etwa um das 7fache und die Produktivität etwa um das 20fache.In P limitation, the phosphorus content of the biomass decreases to one third. Polyphosphateinlagcrungen are no longer detectable colorectal. As the biomass triples, the product formation rate of trehalose increases approximately 7-fold and productivity approximately 20-fold.

Example 2

Wie im Beispiel 1 wurde auch bei dem Hofestamm Candida utiles H92 eine ausgeprägte Disposition zur intraceilulären Polyphosphatbildung festgestellt. Die Kultivierung erfolgto auf einem analogen Medium und untüi gloichon Milieubedingungen. Als Kohlenstoffquelle diente Glycerol. Untersucht wurde die intracelluläre Akkumulation von Glycogen. >As in Example 1, a pronounced disposition for intraceilular polyphosphate formation was also found in the host strain Candida utiles H92. Cultivation is carried out on an analog medium and under normal environmental conditions. The carbon source was glycerol. The intracellular accumulation of glycogen was investigated. >

Die Tabelle zeigt die daboi erzielten WerteThe table shows the values achieved by daboi

ChomostatbedingungenChomostatbedingungen Biomassebiomass Phosphorphosphorus Trehaiosetrehalose bei ^μ™^χ at ^μ ™ ^χ (gHTS/l)(GHTS / l) (in % HTS)(in% HTS) (in % HTS)(in% HTS) C-LimitationC-Limitation 55 2,82.8 11 P-LimitationP-limitation 1515 1,01.0 1212

Auch in diesem Fall sinkt bei P-Limitation der Phosphorgehatt der Biomasse auf ein Drittel ab und die Polyphosphateinlagerungen verschwinden. Während sich die Biomasse verdreifacht, steigt für das Produkt Glycogen die spezifische Produktbildungsrate um das 12facho »ind die Produktivität um dan 36fache.In this case, too, the phosphorus content of the biomass decreases to one third and the disappearance of polyphosphate disappears. While the biomass triples, for the product glycogen, the specific product formation rate increases 12 times and productivity 36 times.

Example 3

Verwendet wird der Bakterienstamm MB 126. Dieses Bakterium Ist gramnegativ, mothanolassimilierond und fähig zur Akkumulation von Polyphosphaton und Poly-ß-r ydroxybuttersäure. Die Haltung erfolgt auf einem üblichen Nähragar mit Methanol als Kohlenstoffquelle, einem Phosphorgehalt von 60-150 mg/l, bei pH 6,5 und 3ü°C. Die Vorkultivierung des InokulumsThe bacterial strain MB 126 is used. This bacterium is gram-negative, mothanolassimilierond and capable of accumulation of polyphosphate and poly-ß-r ydroxybuttersäure. It is kept on a common nutrient agar with methanol as carbon source, a phosphorus content of 60-150 mg / l, at pH 6.5 and 3ü ° C. The precultivation of the inoculum

wird in Erlenmyerkolben auf einer Nährsalzlösung durchgeführt, die alle Komponenten im Überschuß enthält und deren Phosphorgehalt so berechnet ist, daß nach Verbrauch der Kohlenstoffquelle die Phosphorkonzentration im Medium S 50 mg P/l beträgt.is carried out in Erlenmyer flasks on a nutrient broth containing all the components in excess and their phosphorus content calculated so that, after consumption of the carbon source, the phosphorus concentration in medium S is 50 mg P / l.

Im Fermontor ei folgt nach der Beimpfung, die im Verhältnis 1:10 durchgeführt wird, ein diskontinuierliches Wachstum in einerIn the Fermontor egg follows after the inoculation, which is carried out in the ratio 1:10, a discontinuous growth in one

Nährlösung,' Ie alle Komponenten Im Überschuß enthält, außer Mothanol als C-Quello. Dieses wird so zugesetzt, daß dlo aktuelle Konzentration im Bereich von 200—400mg/1 Hegt. Der Phosphorgehalt cJiosor Nährlösung beträgt 150mg/1. Je nach Anlmpfungsdlchto (0,1-0,5 BTS/I) folgt ein kurzes, etwa 3-8st('inüiges exponentiell Wachstum bis auf eine Biomassokonzentration von 1-1,5g BTo/l. Daboi wird der im Medium enthaltene Phosphor aufgebraucht und intracellulär angereichert. Das weitere Wachstum erfolgt über 48 Stundon in einem Medium ohne extracellulären Phosphor, wobei sich die Biomasse verzehnfacht und gleichzeitig eine verstärkte PHB-Akkumulatlon stattfindet, Es wird ein PHB-Gehalt von 56-60% der Bakterientrockensubstanz erreicht.Nutrient solution containing all components in excess except Mothanol as C-Quello. This is added so that the current concentration is in the range of 200-400 mg / l. The phosphorus content cJiosor nutrient solution is 150mg / 1. Depending on the initial binding (0.1-0.5 BTS / I), a short, approximately 3-8st ('') exponential growth up to a biomass concentration of 1-1.5 g BTo / l Daboi the phosphorus contained in the medium is used up The further growth takes place over 48 hours in a medium without extracellular phosphorus, wherein the biomass increases tenfold and at the same time an increased PHB accumulation takes place. A PHB content of 56-60% of the bacterial dry substance is achieved.

Gegenüber der N-Limitation wird die Produktbildungsrate verdoppelt, die Produktivität um 60% erhöht und der PHB-Ertragskoeffizlent um 45% gesteigert.Compared to N-Limitation, the product formation rate is doubled, productivity is increased by 60% and the PHB yield efficiency is increased by 45%.

Claims

A process for microwaving growth-associated production of intracellular non-proteinaceous metabolites, such as poly-.beta.-hydroxybutyric acid or trehalose, characterized in that the preparation of the seed culture and the pre-cultivation of such microorganisms having the capacity for intracellular phosphate storage on phosphate excess nutrient media and the further cultivation with growth and product synthesis on nutrient media in which the phosphate source is absent or limited, is performed.

2. The method according to claim 1, characterized in that are used as microorganisms bacteria, yeasts or algae.