DD260294A1

DD260294A1 - Verfahren zur herstellung von l-lysin

Info

Publication number: DD260294A1
Application number: DD30251687A
Authority: DD
Inventors: Matthias Hilliger; Hans-Juergen Menz; Klaus Lambrecht; Wolfgang Forberg; Reinhard Fuchs; Guenther Kreibich; Georg Harzfeld; Hans-Otto Moeckel; Hartmut Weissgaerber
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1987-05-07
Filing date: 1987-05-07
Publication date: 1988-09-21

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der essentiellen Aminosaeure L-Lysin, welche zur Aufwertung von Nahrungsmitteln, als Zusatz zum Viehfutter zum Ausgleich von Aminosaeureinbalancen und fuer Infusionsloesungen in der Medizin eingesetzt werden kann. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf fermentativem Wege. Das erfindungsgemaesse Verfahren wird durch Submerskultivierung von L-Lysin bildenden Mikroorganismen in einer Naehrloesung, die neben einer Kohlenstoffquelle, anorganischen Salzen und Vitaminen eine organische, komplexe Stickstoffquelle in Form eines Hydrolysates von Bioschlamm enthaelt, durchgefuehrt. Die der Fermentationskultur vorausgehende Impfkultur enthaelt neben an sich ueblichen komplexen Stickstoffquellen ebenfalls einen Zusatz von Bioschlammhydrolysat. Nach Ablauf von 60 bis 75 Stunden Fermentation wird eine Kulturloesung erhalten, die etwa die gleiche Lysinkonzentration aufweist, die bisher mit an sich bekannten Verfahren unter Verwendung einer bisher ueblichen komplexen, organischen Stickstoffquelle wie Sojamehlhydrolysat erzielt wird. Das in der Kulturloesung akkumulierte L-Lysin kann mit an sich bekannten Verfahren wie Ionenaustauschchromatographie kristallin gewonnen werden oder die gesamte Kulturloesung zu einem Fluessigkonzentrat oder zu einem Trockenprodukt nach bekannten Verfahren aufgearbeitet werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zurfermentativen Herstellung von L-Lysin. Die essentielle Aminosäure L-Lysin wird zur qualitativen Verbesserung von Nahrungsmitteln, als Zusatz zu Viehfutter und für Infusionslösungen für medizinische Zwecke eingesetzt und besitzt daher große ökonomische Bedeutung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Zurfermentativen Herstellung der essentiellen Aminosäure L-Lysin wird eine möglichst kostengünstige, einfach herzustellende und den speziellen Bedürfnissen des L-Lysin-produzierenden und somit die fermentative Herstellung des L-Lysin bewirkenden Mikroorganismus genügende komplexe, organische Stickstoffquelle benötigt.

Bei den bisher bekannten L-Lysin-Fermentationsverfahren werden als komplexe, organische Stickstoffquellen Pepton, Harnstoff, Amine, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Fischmehl, Caseinhydrolysat, Säurehydrolysate von Sojabohnenmehl oder Mikroorganismenzellen (DE AS 2730964, DE OS 2350210, DE AS 2531999, SU 440848, SU 415890, SU 526295, SU 759056, GB 1577975, JP 79,19471, JP 81,08692) bzw. das schwefelsaure Hydrolysat von Erdnußmehl verwendet (DD WP 140056).

Weiterhin werden als organische, komplexe Stickstoffquelle Bouillon, lösliche Produkte der Fischverarbeitung, Maisquellwasser oder Reiskleieextrakte einzeln oder als Gemisch eingesetzt (DE AS 2034406, DE OS 2350647, SU 5076347).

Auch der Einsatz von Säurehydrolysaten von Hefezellen (SU 494040, SU 661013) bzw. von fermentativen Hydrolysaten der Hefezellen (SU 661013), von Kartoffelzellwasser-Hydrolysat (SU 494040, PL 98183) oder von Hydrolysaten des Lysinbildners selbst nach erfolgter Fermentation (SU 506616, JP 55-111341) ist beschrieben.

Weiterhin sind als komplexe, organische Stickstoffquelle in fermentativen L-Lysin Herstellungsverfahren Weizenglutenhydrolysat (DE OS 1792403, JP 67,55213) und auch Hefeautolysate (SU 494040, DD WP 218633) verwendet worden.

Nachteilig bei den bisher beschriebenen Verfahren ist die Verwendung hohe Kosten verursachender Ausgangsstoffe zur Herstellung der komplexen, organischen Stickstoffquelle, die zudem in den meisten Fällen direkt der tierischen Verfütterung zugeführt werden könnten.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung der essentiellen Aminosäure L-Lysin mittels eines fermentativen Verfahrens, welches unter Verwendung einer kostengünstigen komplexen Stickstoffquelle die beschriebenen Nachteile vermeidet und L-Lysin auf ökonomisch vorteilhafte Weise zu produzieren gestattet.

- 2 -Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein fermentatives Verfahren zur Herstellung der essentiellen Aminosäure L-Lysin unter Verwendung einer kostengünstigen, in großen Mengen erhältlichen komplexen, organischen Stickstoffquelle zu beschreiben.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Kultivierung eines L-Lysin bildenden Mikroorganismus unter aeroben, kontaminationsfreien Bedingungen in einem Fermentationsmedium mit einer Kohlenstoffquelle, anorganischen Salzen, Vitaminen Maisquellwasser und einer komplexen, organischen Stickstoffquelle in Form eines mittels schwefelsaurer Hydrolyse und nachfolgend mit Ammoniakwasser neutralisierten Hydrolysates des bei der Fermentation von Gülle als auf konzentrierter Unterlauf entstehenden Bioschlamms bei einer sonst üblichen Acidität des Fermentationsmediums von pH 5,0 bis pH 8,0 und bei einer allgemein angewandten Temperatur von 26°C bis 34⁰C erfolgt, wobei außerdem der Nährboden der letzten Impfstufe zusätzlich Bioschlammhydrolysat enthält.

Die Abtrennung und Reinigung des gebildeten L-Lysins nach erfolgter Fermentation oder die Aufarbeitung der gesamten Kulturlösung zu L-Lysin-Futterkonzentrat erfolgen in an sich bekannter Weise.

Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

Daszum Beimpfen des Fermentationsnährbodens erforderliche Inokulum eines L-Lysins bildenden Mikroorganismus wird in an sich bekannter Weise in mehreren Stufen angezüchtet, wobei dem Nährboden der letzten Impfkultur bis zu 20%, vorzugsweise jedoch bis zu 10% der erforderlichen komplexen, organischen Stickstoffquelle in Form des Bioschlammhydrolysates zugesetzt

Das Fermentationsmedium enthält neben einer Kohlenstoffquelle wie Saccharose, Glukose, Melasse oder Gemische derselben, anorganische Salze wie KH2PO4 und MgSO4, eine allgemeine Vitamin- und Wuchsstoffquelle, meist als Maisquellwasser, die Vitamine B₁ und Biotin, sowie eine komplexe, organische Stickstoffquelle als Hydrolysat von Bioschlamm in einer Menge, die einem a-NH₂-N-Gehalt im Fermentationsnährboden von 0,9g · Γ¹ bis 2,0g · Γ¹, vorzugsweise jedoch von 1,2g · Γ¹ bis 1,4g · Γ¹ zu Fermentationsbeginn entspricht.

Die komplexe, organische Stickstoffquelle wird zusammen mit den übrigen Nährboden bestandteilen nach Korrektur der Acidität auf pH 6,8 bis pH 7,0 zu Beginn des Prozesses in üblicher Weise sterilisiert.

Die Inokulummengefür die Fermentationskultur beträgt 5% bis 20% des Volumens des Fermentationsnährbodens, vorzugsweise jedoch 10% bis 15%, wobei die Anfangskonzentration der Biomasse 0,5g · Γ¹ bis 1,8g · Γ¹, vorzugsweise jedoch 0,9g - Γ¹ bis 1,4g · Γ¹ beträgt. Die Fermentation wird nach Hinzufügen des Inokulums bei einer allgemein üblichen Temperatur von 26°C bis 34⁰C, vorzugsweise aber bei 29°C bis 30⁰C und einer Acidität von pH 5,0 bis 8,0 durchgeführt.

Als L-Lysinbildende Mikroorganismen können solche der Gattungen Nocardia, Mycobakterium, Arthrobacter, Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus und Escherichia, insbesondere jedoch solche der Gattungen Brevibacterium und Corynebacterium und besonders bevorzugt Corynebacterium glutamicum CCM 3287, beschrieben im DD-WP 140056, verwendet werden.

Durch die beschriebene Verfahrensweise werden Lysinkonzentrationen im ausfermentierten Nährboden erhalten, die denen entsprechen, die mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung wesentlich teuerer und ernährungsphysiologisch wertvoller komplexer, organischer Stickstoffquellen wie Sojabohnenhydrolysat erzielt werden.

Dieses Ergebnis ist überraschend, da nicht zu erwarten war, daß bei Einsatz einer derartig ungewöhnlichen, viele unerwünschte Begleitstoffe enthaltenden organischen Stickstoff quelle eine solche Lysinbildungsrate durch den produzierenden Mikroorganismus realisiert wird und somit zur gleichen Lysinausbeute im Vergleich zum Einsatz von Sojabohnenhydrolysat als komplexe, organische Stickstoffquelle führt.

Das in das Kulturmedium ausgeschiedene L-Lysin wird durch an sich bekannte Isolationsverfahren wie Ionenaustauscher kristallin gewonnen oder der gesamte ausfermentierte Nährboden zusammen mit dem darin enthaltenen L-Lysin in an sich bekannter Weise zu Futterkonzentrat verarbeitet.

Ausführungsbeispiele

An einigen Ausführungsbeispielen soll die Erfindung näher erläutert werden.

1. Vegetatives Zellmaterial von C. glutamicum CCM 3287, auf Schrägagarröhrchen in bekannter Art und Weise angezüchtet, wird zur Beimpfung von 40 ml Nährlösung der Vorkulturfolgender Zusammensetzung verwendet (ing Γ¹): Saccharose 25,0, Maisquellwasser (40% TS) 45,0, Bioschlammhydrolysat 15,0. Die Kultivierung erfolgt in 500 ml Flaschen bei 29°C auf einem Reziprokschüttler. 2ml der 24 Stunden alten Vorkultur dienen als Impfmaterial von 25ml Fermentationsnährboden, dessen Acidität vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurde und folgende Zusammensetzung hat:

Saccharose:	160,Og-I"¹
Bioschlammhydrolysat:	45OmI-I"¹
Maisquellwasser
(40% TS):	16,0 g-Γ¹
KH₂PO₄:	1,0 g-Γ¹
(NH₄J₂SO₄:	5,0 g -Γ¹
CaCO₃:	20,Og-P¹
MgSO₄-7 H₂O:	0,2 g·!-¹
Vitamin B₁:	0,2 mg -I"¹
Biotin:	60 μα · I"¹

Verwendet wird ein Bioschlammhydrolysat, welches nach einem speziellen Verfahren hergestellt wurde.

Die Kultivierung erfolgt auf einem üblichen Rundschwingschüttler (f = 180min"¹) bei 29°C. Nach 80 Stunden Fermentation wird ein Lysingehalt (als Lys · HCI) von 27,1 g · I"¹ der Fermentationskultur als Mittelwert aus 7 Parallelen bestimmt.

Ein Experiment unter gleichen Versuchsbedingungen aber mit Sojaextraktionsschrothydrolysat als komplexe, organische Stickstoffquelle ergab eine Lysinkonzentration (als Lys · HCI) von 31,1g · Γ¹ als Mittelwert von 7 Parallelen.

2. Vegetatives Zellmaterial von Corynebacterium glutamicum dient zur Beimpfung von 60ml Vorkulturnährboden folgender Zusammensetzung (in g · Γ¹): Saccharose: 20,0

Maisquellwasser (MQW) (40% TS): 45,0

Vor der Sterilisation wird die Acidität der Kulturlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Kultivierung erfolgt 24 Stunden bei 29 ⁰C auf einem Reziprokschüttler 10 ml dieser Kultur werden als Inokulum für eine zweite Vorkultur mit 400 ml einer vor Sterilisation auf eine Acidität von pH 7,0 eingestellten Nährlösung folgender Zusammensetzung verwendet:

Saccharose:	25g-r
Bioschlammhydrolysat:	25 ml·!-¹
MQW (40% TS):	50g-r¹
Vitamin B₁:	0,1 mg-Γ¹
Biotin:	40 ug · Γ¹

Die Kultivierung dieser zweiten Vorkultur erfolgt in 2,51 Flaschen bei 29⁰C über 17 Stunden auf einem Rundschwingtisch. Aus dieser.Vorkujtur dienen 200ml zum Beimpfen eines 1,51 Fermentors mit 1,01 Nährlösung folgender Zusammensetzung:

Saccharose: 180 g · I"¹ Bioschlammhydrolysat: 51OmI-I"¹

MQW(40%TS): 20,1 g-r¹'

KH₂PO₄: . 2,5g-r¹

MgSO₄-7 H₂O: " ,0,2g-l"¹

Vitamin Bi: 0,25 mg-I"¹ Biotin:

Die Acidität der Nährlösung wird vor dem Sterilisieren mit NH₃-Wasser auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und während der Fermentation im Bereich von 6,5 bis 7,0 gehalten.

Verwendet wird ein Bioschlammhydrolysat wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Kultivierung erfolgt bei 29 ⁰C mit einer Drehzahl von 900 min"¹ und einer Belüftungsrate von 1:1. Zur 30. und 46. Stunde erfolgt die Zugabe von je 30g und zur 56. Stunde 20g Saccharose in Form einer sterilisierten Lösung. Nach 60 Stunden Fermentation werden 42,0g Lysin (als Lys · HCI) pro Liter Kulturlösung erhalten.

Ein unter gleichen Bedingungen durchgeführter Versuch mit Sojaextraktionsschrothydrolysat führte nach 60 Stunden Fermentation zu einer Lysinkonzentration von 36,6g · Γ¹ (als Lys · HCI).

Die Anzucht von Corynebacterium glutamicum CCM 3287 in der ersten und zweiten Vorkultur erfolgt analog Beispiel 2.

Der Inhalt von vier Flaschen der 17 Stunden alten zweiten Vorkultur dient als Inokulum für einen Fermentor mit 101 einer auf pH 6,8 eingestellten Nährlösung folgender Zusammensetzung:

Saccharose:	18Og-T¹
Bioschlammhydrolysat:	620 ml-Γ¹
M QW (40% TS):	20,0 g-r¹
KH₂PO₄:	2,5g-Γ¹
MgSO₄-7 H₂O:	0,3Og-P¹
Vitamin Bi	0,25 mg-I
Biotin:	50 ug Γ¹

Die Kultivierung erfolgt bei 29⁰C mit einer Drehzahl von 640min ¹ und einer Belüftungsrate von 1:1. Die Acidität der Kulturlösung wird durch Dosierung von NH₃-Wasser im Bereichung von pH 6,0 bis 7,0 gehalten.

Zur 30. und 40. Stunde erfolgt die Zugabe von je 300g und zur 56. Stunde 200g Saccharose in Form einer sterilisierten Lösung.

Nach 72 Stunden Fermentation werden 52,5g Lysin (als Lys · HCI) pro Liter Kulturlösung bestimmt. Ein unter gleichen Bedingungen durchgeführtes Experiment mit Sojaextraktionsschrothydrolysat als komplexe, organische Stickstoffquelle ergab eine Lysinkonzentration von 54,3g · Γ¹ (als Lys · HCI).

Claims

-1-Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf fermentativem Wege durch Kultivierung L-Lysin bildender Mikroorganismen unter kontaminationsfreien Bedingungen in einem Fermentationsmedium mit einer Kohlenstoffquelle, anorganischen Salzen, Maisquellwasser und Vitaminen bei einer Acidität von pH 5,0 bis pH 8,0 und bei einer Temperatur von 26°C bis 34°C, gekennzeichnet durch den Einsatz eines mittels schwefelsaurer Hydrolyse und nachfolgend mit Ammoniakwasser neutralisierten Hydrolysates des bei der Fermentation von Gülle in Form des aufkonzentrierten Unterlaufs entstehenden Bioschlamms als komplexe, organische Stickstoffquelle im Fermentationsmedium und im Nährmedium der für die Beimpfung der Fermentation erforderlichen Inokulumkultur sowie durch die Abtrennung und die Reinigung des gebildeten L-Lysins bzw. durch die Verwendung des gesamten ausfermentierten Nährbodens zur Herstellung von L-Lysin Futterkonzentrat in an sich bekannter Weise.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch den Zusatz von Bioschlammhydrolysat zum Nährboden der Inokulumkultur in einer Menge, die bis zu 20% der Gesamt-a-NH₂-N-Menge der komplexen, organischen Stickstoffquelle ausmacht.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet durch den Zusatz von Bioschlammhydrolysat zum Nährboden der Inokulumkultur in einer Menge, die 10% der Gesamt-a-NH₂-N-Menge der komplexen, organischen Stickstoffquelle ausmacht und der a-NH₂-N-Anteil, der aus dem Bioschlammhydrolysat stammt, bis zu 0,05g · Γ¹ beträgt.
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch den Zusatz von Bioschlammhydrolysat zum Fermentationsnährmedium in einer solchen Menge, die einem a-NH₂-N-Gehalt von 0,9g · Γ¹ bis 2,0g · Γ¹ entspricht.
5. Verfahren nach Punkt 1 und 4, gekennzeichnet durch den Zusatz von Bioschlammhydrolysat zum Fermentationsnährmedium in einer solchen Menge, die einem a-NH₂-N-Gehaltvon 1,2g · Γ¹ bis 1,4g · Γ¹ entspricht.