DD260288A1

DD260288A1 - Verfahren zur herstellung eines mikrobiellen naehrmediums

Info

Publication number: DD260288A1
Application number: DD30251787A
Authority: DD
Inventors: Matthias Hilliger; Klaus Lambrecht; Hans-Otto Moeckel; Hartmut Weissgaerber
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1987-05-07
Filing date: 1987-05-07
Publication date: 1988-09-21

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Naehrmedien fuer die Kultivierung von Mikroorganismen. Die Aufgabe, neue, vereinfachte Naehrmedien mit verbesserten Eigenschaften fuer das Wachstum von Mikroorganismen zu entwickeln, wird in der Weise geloest, dass anstelle der bisher in mikrobiellen Naehrmedien eingesetzten komplexen organischen Stickstoffquellen wie Peptone, Fleischextrakte, Fleischbouillon, Casein, Caseinhydrolysat, das schwefelsaure Hydrolysat von Biomehl bzw. seiner Vorstufe Bioschlammkonzentrat eingesetzt wird oder in Kombination mit verschiedenen Kohlenstoff- und Energiequellen ohne weiteren Zusatz von Mineralsalzen und Spurenelementen neue Naehrmedien ergibt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Mikrobielle Nährmedien werden zum Kultivieren von Mikroorganismen verschiedenster taxonomischer Zuordnung verwendet. Das Anzüchten der Mikroorganismen erfolgt zum Zweck ihrer allgemeinen Charakterisierung, für biochemische und genetische Untersuchungen sowie zur Gewinnung mikrobieller Biomasse und ihrer Bestandteile. Mikrobielle Nährmedien können daher in allen mikrobiologisch arbeitenden Laboratorien eingesetzt und in den einschlägigen Herstellungsbetrieben für Fertignährmedien hergestellt werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Mikroorganismen benötigen zu ihrem Wachstum neben assimilierbaren Kohlenstoff- und Energiequellen aus Stickstoffquellen und verschiedene Mineralsalze, Spurenelemente, Vitamine und Wuchsstoffe. Bestimmte Mikroorganismen erfordern eine organische Stickstoffquelle, die eine Vielzahl der für das Wachstum der Mikroorganismen-Zelle notwendigen Bausteine bereits in vorgefertigter Zusammensetzung enthält. Die bisher in der Mikrobiologie zur allgemeinen Charakterisierung und für andere Zwecke eingesetzten Nährmedien enthalten die organische Stickstoffquelle in Form von Extrakten hochmolekularer Eiweißverbindungen wie Fleischextrakte, Hefeextrakte, Fleischwasser oder Fleischbouillon oder enzymatisch bzw. mit Mineralsäuren aufgeschlossene Eiweiße in Form von Peptonen verschiedenster Herkunft wie Blut, Fleisch, Fisch und Casein (Handbuch Nährböden, Merck, 1980; Handbuch Mikrobiologie, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg; Difco Manual). Teilweise enthalten diese Nährmedien auch Totalhydrolysate bestimmter Eiweiße wie z. B. Casein, sogenannte Casamino acids (Difco Manual) oder auch Hydrolysate von Casein und anderen natürlichen Einweißprodukten, die durch schwefelsaure Hydrolyse gewonnen wurden (DEOS 3212673A1).

Der Nachteil derartiger Nährmedien besteht darin, daß Hydrolysate zum Einsatz kommen, die aus wertvollen Ausgangsstoffen wie z. B. Casein oder Sojaprotein gewonnen wurden. Außerdem müssen diesen Nährmedien zusätzlich bestimmte Mineralsalze wie beispielsweise Phosphatverbindungen und Spurenelemente zugegeben werden. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß die bisher verwendeten komplexen organischen Stickstoffquellen, insbesondere Peptone, die Nährmedien trüben und damit bestimmte Auswertungen erschweren.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung neuartiger, verbesserter Nährmedien für mikrobiologische Arbeiten, welche die genannten Nachteile nicht aufweisen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Einsatz einer kostengünstigen, gut verfügbaren, neuartigen komplexen Stickstoffquelle bisher für mikrobielle Nährmedien eingesetzte organische Stickstoffquellen wie Peptone verschiedenster Herkunft, Extrakte von Fleisch und anderen biologischen Materialien wie z. B. Hefe zu ersetzen und darüber hinaus durch

-2- ZbU Ü88

Kombination dieser neuartigen komplexen Stickstoffquelle mit geeigneten Kohlenstoff- und Energiequellen auch ohne weitere Zusätze von Mineralsalzen neuartige, vereinfachte Nährmedien mit verbesserten Eigenschaften für das Wachstum verschiedenster Mikroorganismen herzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß anstelle der bisher in mikrowellen Nährmedien enzymatisch oder mittels Säureaufschluß gewonnenen Hydrolysate verschiedener Eiweißquellen (Peptone), Fleisch-, Fisch- und Hefeextrakte oder saurer Caseinhydrolysate das mittels schwefelsaurer Hydrolyse und durch Neutralisation mit Ammoniakwasser hergestellten Hydrolysat von Biomehl oder dessen aus der Güllefermentation als Unterlauf entnommenen und durch Separation aufkonzentrierten als Bioschlammkonzentrat bezeichneten Vorstufe eingesetzt wird, oder das dieses Biomehl- bzw. Bioschlammkonzentrathydrolysat in Kombination mit Kohlenstoff- und Energiequellen wie Alkohole, Carbonsäuren Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, ohne weiteren Zusatz von Mineralsalzen, aber unter Hinzufügen von Vitaminen und Wuchsstoffen für die Herstellung neuartiger, vereinfachter Nährmedien mit verbesserten Eigenschaften für das Wachstum von Mikroorganismen eingesetzt werden.

Der verfahrensgemäße Einsatz von Biomehl-bzw. Bioschlammkonzentrathydrolysat anstelle bisher verwendeter komplexer Stickstoffquellen oder ihre Kombination mit verschiedenen Kohlenstoff-und Energiequellen wird in seinen Grundzügen wie folgt durchgeführt:

Die in den meisten mikrowellen Nährmedien verwendeten komplexen Stickstoffquellen werden durch Zugabe von mittels schwefelsaurer Druckhydrolyse und nachfolgender Neutralisation mit Ammoniakwasser hergestellten Biomehl- bzw. Bioschlammkonzentrathydrolysate partiell oder total ersetzt. Weiterhin werden Biomehl- bzw. Bioschlammkonzentrathydrolysate vorteilhaft in Kombination mit für das Wachstum der Mikroorganismen günstigen Kohlenstoff- und Energiequellen ohne weitere Zusätze von Mineralsalzen und Spurenelementen wie Phosphor-, Magnesium-, Eisen-, Mangan-, Kobalt- oder Nickelsalzen eingesetzt. Als Kohlenstoff- und Energiequellen werden dabei Alkohole, Mono-, Dicarbonsäuren, Öle, Hydroxy-, di- und tricarbonsäuren, Aldehyde und Ketone, Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, Phenole, aromatische Alkohole, sowie heterozyklische Verbindungen verwendet. Je nach Erfordernis des zu züchtenden Mikroorganismus erfolgt eine Zugabe von Vitaminen wie Vitamin B₁, B₂, B₆, B₁₂ oder verschiedener Wuchsstoffe wie z. B. Folsäure oder Ferrioxamin.

Die verwendeten Mengen an Biomehl- bzw. Bioschlammkonzentrathydrolysat entsprechen dabei einem a-NH₂-N-Gehalt von 10 Mg · ml"¹ bis 1000 Mg · ml"¹, vorzugsweise jedoch 50 pg ml"¹ bis 500 pg · ml"¹. Die so erhaltenen neuartigen, in bezug auf ihre Zusammensetzung vereinfachten, weitgehend optisch klaren Nährmedien weisen für das Wachstum von Mikroorganismen verbesserte Eigenschaften auf.

Ausführungsbeispiel

An Ausführungsbeispielen soll die Erfindung erläutert werden, ohne sie dadurch jedoch einzuschränken.

Beispiel 1

In mikrowellen Nährmedien werden die bisher eingesetzten komplexen, organischen Stickstoffquellen partiell oder vollständig durch das Hydrolysat von Biomehl ersetzt, die so veränderten Nährmedien in üblicherweise im Autoklaven sterilisiert und in sterilisierte Petrischaien eingegossen. Nach Erkalten erfolgt mittels Impföse die Beimpfung mit den in derTabelle 1 angegebenen Mikroorganismen. Nach 3 bzw. 6 Tagen Bebrütung bei 30⁰C erfolgt die Auswertung des Wachstums. Als Kontrolle dienen mit den gleichen Mikroorganismen beimpfte unveränderte Nährmedien, a)

Dextrose	10,Og-I	-¹ M79 Medium	ad. 1,01	1-1
Pepton (aus Blut)	10,Og-I	-¹ (Kontrolle)		Γ¹ Al 53 Medium
Casamino acids (Difco)	1,Og-I	-1		Γ¹ (Kontrolle)
-lefeextrakt (Bramsch)	2,0g · I	-1	20,0ml · Γ¹	1-1
NaCI	6,0g · I	-1		1-1
Agaragar	15,Og-I	-1		1-1
Aqua dest.		\|-1
Variante I	50,0ml ·	1-1
Statt Casamino acids (Difco)	3,0g-	1-1
Biomehlhydrolysat (BMH)	15,0g -	15,0g-Γ¹
Varianten	0,1g-	ad. 1,01
Statt Casamino acids (Difco)	0,5g-
und Pepton (aus Blut)	0,5g-
Biomehlhydrolysat (BMH)	1,0g-	25,0ml · Γ¹
Saccharose	5,0g-
Dextrin	1,0ml-
Harnstoff
NaCI
KH₂PO₄
Hefeextrakt
Pepton (aus Blut)
FeSO₄ (1%igeLsg.)
Agaragar
Aqua dest.
Variante I
Statt Pepton (aus Blut)
Biomehlhydrolysat
Varianteil
Statt Pepton (aus Blut),

KH₂PO₄und FeSO₄	25,0ml · Γ¹
Biomehlhydroiysat	40,0g · Γ¹ Sabouraud-Medium
c) Maltose	10,0g-Γ¹ (Kontrolle)
Pepton	15,Og-I"¹
Agaragar	ad. 1,01
Aqua dest.
Variante I
Statt Pepton	50,0ml · Γ¹
Biomehlhydroiysat

Tabelle 1

Wachstum von Penicillium chrysogenum, Penicillium camembertii (nach 3 Tagen) und Streptomyces hygroscopicus (nach 6 Tagen) auf Nährmedienvarianten mit Biomehlhydroiysat als komplexer, organischer Stickstoffquelle. Als Kontrolle dienen die ursprünglichen, unveränderten Nährmedien.

Mikroorganismus a)M79 Medium '___ b) AL53 Medium c)SabouraudM.

Kontrolle VaM VaV. Il Kontrolle Var.l Var.ll Kontrolle Var.l

P. chrysogenum

P.camembatii ++ + + + + + + +

S. hygroscopicus +++ + + + ++ +

+ : schwaches Wachstum ++: mäßiges Wachstum + + + : gutes Wachstum + +++: sehr gutes Wachstum

Beispiel 2

Der Einsatz der komplexen, organischen Stickstoffquelle Biomehlhydroiysat erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben, ebenso die Vorbereitung der Nährmedien in sterilen Petrischalen mit der Änderung aber, daßzur Wachstumsprüfung außer P. chrysogenum und P.camenbertii auch Escherichia coli, Bacillus amylofaciens und Bacillus globigii (Auswertung des Wachstums nach 24 Stunden) eingesetzt werden, a)

Casamino acids (Difco)	1,5g -ml"' CAY Medium
Glycerin	20,0ml I"¹ (Kontrolle)
Hefeextrakt	2,5g · Γ¹
NaCI	1,0g-r¹
KH₂PO₄	1,Og-T¹
MgSO₄ 7 H₂O	0,1 g-r¹
CaCO₃	0,005g · Γ¹
Agaragar	15,0 g Γ¹
Aqua dest.	ad. 1,01
Variante I
Statt Casamino acids (Difco)
Biomehlhydroiysat	4,OmI-I"¹
Varianteil
Statt Casamino acids (Difco)
Biomehlhydroiysat	10,0ml -Γ¹
Variante III
Statt Casamino acids (Difco)
KH₂PO₄ und MgSO₄ · 7 H₂O
Biomehlhydroiysat	15,OmI-T¹
Hefeextrakt (Difco)	4,0g · Γ¹ Hefeextrakt Agar 53
Malzextrakt	10,0g · Γ¹ (Kontrolle)
Dextrose	4,0g · Γ¹
Agaragar	20,0g · Γ¹
Aqua dest.	ad. 1,01
Variante I
Statt Hefeextrakt (Difco)
Biomehlhydroiysat	8,OmI-I"¹

Tabelle 2

Wachstum von Penicillium chrysogenum, Penicillium camembertii, Escherichia coli B, Bacillus amylofaciens und Bacillus globigii auf Nährmedienvarianten mit Biomehlhydroiysat als komplexer, organischer Stickstoffquelle. Als Kontrolle dienen die ursprünglichen, unveränderten Nährmedien.

Mikroorganismus CAY Medium

Kontrolle Var.

Var.ll

Var.l

Hefeextrakt Medium 53 Kontrolle Var.l

P.chrysogenum P.camembertii E.coliB B.amylofaciens B.globigii

+ : schwaches Wachstum ++: mäßiges Wachstum +++: gutes Wachstum ++++: sehr gutes Wachstum

Beispiet 3

Die nachfolgend aufgeführten Nährmedien a) bis h) werden entsprechend den angegebenen Rezepturen zusammengesetzt, durch Hinzufügen des Agars und Aufkochen zubereitet und vorErstarren der pH-Wert mit ¹Ao η NaOH auf pH 6,8 ± 0,2 eingestellt und in Steilbrustflaschen zu je 200 ml abgefüllt. Nach Sterilisation im Autoklaven 25 Minuten bei 120⁰C können sofort oder später nach Wiederverflüssigung im Dampftopf oder im kochenden Wasserbad die Nährmedien in zuvor sterilisierte Petrischalen eingegossen werden. Nach Erstarren des Nährmediums erfolgt die Beimpfung mit Zellmaterial der in Tabelle 3 angegebenen Mikroorganismen durch Ausstreichen mittels Impföse auf der Nährmedienoberfläche.

Die Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse des Wachstums verschiedener Mikroorganismen auf den Nährmedien a) bis h). a)

BMH	ad.	10,OmI-T¹	BMH: Biomehlhydrolysat
Glucose		2,Og · T¹
Biotin		20,0Mg I"¹¹	Zugabe aus steril
Vitamin B₁		ioo,OMg · i~¹'	filtrierten Stammlösungen
Agaragar		20,0g · T¹¹
Aquadest.		1,01
BMH		10,0ml : T¹
Saccharose		4,0g · T¹
BMH		20,OmI-T¹
Bernsteinsäure		2,5 g · T¹
Biotin		20,0Mg Γ¹¹	Zugabe aus steril fil
NAD		10,0Mg · i~¹¹	trierten Stammlösungen
Folsäure		10,0Mg-T¹¹
AgarAgar		20,Og · T¹
Aqua dest.		1,01
BMH		25,OmI-T¹
Zitronensäure		30,Og · T¹
Vitamin B₁	ad.	30,0Mg · I"¹'	Zugabe aus steril fil
Vitamin B₂		10,0Mg · i~¹⁾	trierten Stammlösungen
Folsäure		10,0Mg · I"¹'
Pantothensäure		10,0Mg I"¹¹
Agar Agar		15,Og-T¹
Aqua dest.	ad.	1,01
BMH		20,0ml · T¹
Maisstärke		5,Og · T¹
Glucose		2,Og · T¹
Agar Agar		15,Og-T¹
Aqua dest.		1,01
BMH		15,0ml · T¹
Äthanol (96%)	ad.	2,0ml · T¹¹	Zugabe aus steril fil
Biotin		20,0Mg · I"¹¹	trierten Stammlösungen
Vitamin B₁		50,0Mg · I"¹¹
Vitamin B₆		10,0Mg · Γ¹¹
Agaragar		20,Og · T¹
Aquadest.		1,01
BMH	ad.	20,OmI-T¹
Glycerin		10,OmI-T¹
Folsäure		10,0Mg · I"¹¹	Zugabe aus steril fil
Vitamin Bi₂		50,0Mg-I"¹¹	trierten Stammlösungen
Agaragar		20,Og · T¹
Aqua des.	1,01
BMH	15,OmI-T¹
NH₄-Azetat	3,Og · T¹
Agaragar	20,Og · T¹
Aquadest	1,01

Tabelle 3

Wachstum von Mikroorganismen auf Nährmedien a) bis h)

Mikroorganismus Nährmedium

a) b) c) d) e) f) g) h)_

E.coliB

B.Amylofaciens P. chrysogenum B.subtilis S.Hydroscopicus

Escherichia B)

Bacillus amylofaciens) Bebrütung bei 34°C, Auswertung des Wachstums nach 24 Stunden

Bacillus subtilis)

Penicillium chrysogenum) _{Bebrütung bei 29}°_c, _{Auswertung nach 3}Tagen

Streptomyces hygroscopicus a . a a

+ : schwaches Wachstum + + : mäßiges Wachstum + + + : gutes Wachstum + + + + : sehr gutes Wachstum

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines mikrobiellen Nährmediums, gekennzeichnet durch die Verwendung von mittels schwefelsaurer Hydrolyse von Biomehl oder dessen aus der Güllefermentation als Unterlauf entnommen und durch Separation aufkonzentrierten Vorstufe Bioschlammkonzentrat und nachfolgender Neutralisation mit Ammoniakwasser hergestellten Hydrolysaten nach Klärung oder Filtration als organische komplexe Stickstoffquelle.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die alleinige Verwendung von Biomehlhydrolysat bzw. Hydrolysat von Bioschlammkonzentrat als komplexe organische Stickstoffquelle.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von Biomehlhydrolysat bzw. Hydrolysat von Bioschlammkonzentrat in Kombination mit Kohlenstoff- und Energiequellen ohne weiteren Zusatz von Mineralsalzen und Spurenelementen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet durch den Einsatz von Biomehlhydrolysat bzw. Hydrolysat von Bioschlammkonzentrat in einer solchen Menge, die einem a-NH₂-N-Gehalt von 1(^g · ml"¹ bis 1 000 μg · ml"¹, bevorzugt jedoch von 50 μg · ml"¹ bis 500 μg ml~¹ entspricht.

5. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch die Verwendung von ein- und mehrwertigen Alkoholen, Monocarbonsäuren, Dicarbonsäuren, Ölen, Hydroxy-di und -tricarbonsäuren, Ketodicarbonsäuren, Mono-, Oligo- und Polysacchariden, Phenolen, aromatischen Alkoholen, Aldehyden, Ketonen und Carbonsäuren sowie heterozyklischen Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequellen für die Kombination mit Biomehlhydrolysat bzw. Hydrolysat von Bioschlammkonzentrat.