CZ55890A3

CZ55890A3 - Tissue activator of plasminogen, process of its preparation, dna chain being a code for the tissue activator, process for preparing plasmids and pharmaceutical preparation exhibiting fibrinolytic activity

Info

Publication number: CZ55890A3
Application number: CS90558A
Authority: CZ
Inventors: Anne Stern; Ulrich Kohnert; Rainer Rudolph; Stephan Fischer; Ulrich Martin
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1989-02-07
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 1996-10-16
Also published as: IE900343L; DD291779A5; KR970008485B1; HU901644D0; SK55890A3; HU218092B; JPH03500724A; CA2025900A1; LV10302A; FI100244B; GR900300140T1; AU623228B2; PT93082A; LV10302B; AU5047090A; GR3017099T3; LU90025I2; DK0382174T3; JP2559538B2; NO904211L

Description

no

1	ixWNsacY?	C-KiSJLY&SřX	SlilkiSA^h		«•'«WSM
91.	u/rnrwc	»* =□*»:«	C rTTTífWY^LT	«Γ7“17ΖΡ5Πη	TCCLJ^ZiťA?
101	<3x?E:O7L?A	K*S5WA		iniU&lZLl	MCTTMAaR
m	crczrjrcrc:	Ι/Γ7ΙΙ£Ρ2Υλ	YYTt»i20»cf		?33757TI«ItI
:oi	ALÍ3L2SUS	JKAQZUYVR	17CL??AUUX		OKi>-<.-iXfř
2?1	Π527^Χ3ΑΛ	vxrř£«C7		IXÍKlXAbá.V4	□ »?Q4XJ&
501	fcC$30K<-K	vrrccftCL	ÍGlZtíVÚLUC	«ΛΧ'ΖΙϊΛ	XYIXjTIM i i
3;l	Dean?

<33

Sc

l.n 1 00

241 Asr.P«o4nrji5Pi?3i»5rxCv?0C20C2CC*.nTrejmx;c«}ÁGJWW7A;«cc*·; JW jSi aíQ

4?i akaixítíxÍcmtngKTCirco??;a;πcccac 4ro ri'.J.^l-?ÍC'iL^,lAÁÁ2ACA77G7CCXIkAOCAAlX'COAr5^ri*'A’^A:^ACxiPaA3 6Ó0 ÓGl ΑΤ.·α/<»ϊ·1'Χ1·ΧΑΐΧΤδΑiATTC-řTCCCUZΓΚΜΤιΚΙΤΒ -5G J

7*1 •KCflOCX-jiaeOClAXArCAO^TTnTHVOUV.lOSAKCC-JACvWTCAASÍřilWlří ?ÚO 7J!1 <ArMCAOAVía2/jCCCAICCACOC«7«CJJCÁTC4X-MAČArrrí Γ.ΤΓΑΑ'AOAACAllftC «Ο 941 AOrCArAAarnK^GKyíCCTOGACACACTCv^-^iMOůCCSCtGCnAAXCTTnCtó jXMJ 901 Gá,CCCCr5CCACJUCU.VWť<»:-Aí>ZC:t:CTSCTaT3?CťG«AACG*I0GCÍ.Cv*7n*rT &>G 96t tr^TifjertrArcATrutóíGx-xcrexCToroMArjuíAÁOJÁ^yícccwoNiqiK w'o 1O2L AC*A*>1T7ACCJUtzGAGC5A5AC2GGA7inG7C4CiACW‘X3l<::3 .065

III '

— i

Ο . ί

CO. */-'· '

	< ý . _ o 1 v -' : - 1 až 2 - * £- 1 [ 1 í , , í
Tkáňový aktivátc:	r plasminogenu, způsob jeho výroby,· řetězec
DNA, který je kó:	7 //777/74/7^ /7^'

ceutický prostředek 3 fibrinolytickým účinkem.

Oblast technik;/
Vynález s-	5 týká tkáňového aktivátoru plasmoger.u t-PA,
řetězce DNA., kte:	ý je kódem pro tento nový derivát.^«eeee»BeÍP-

-um: aerný dm-imjr?,	způsobu výroby plasmidů, způsobu
výroby uvedeného	derivátu a farmaceutických prostředku pro
rczccuštění krev:	-<- _{r a} q _n 4 p y -j- p a p y - a H : í 11 v d e r v d e n i vat .
Dosavadní stav t:	; chrJ kv
Vytěkáj i c:	í krev obsahuje jako hlavní složku bílkovin-
né matrice polym:	řrr.í fibrin. Fiorin je za fyziologických
podmínek rozpcuš'	;ěr. fibrinolytickým systémem v reakční kas-
kádě, jejíž čirr:	:st padá v úvahu při snášení krve. Centrální
reakcí je aktiva:	;e plasminogenu na plasmin, která je ovlivně-
na například tká:	levým aktivátorem plasminogenu t-PA (tissue
type plasminoger.	aotivator). Plasmin rozpouští fibrin, který
je hlavní složko:	; bílkovinné matrice při srážení krve. Enzy-
matická účinnost	přirozeného t-PA nebo stejné látky, získané
z eukaryotických	organismů genetickou technologií, zejména

katalytická aktivace plasminogenu na plasmin je v nepřítomnosti fibrinu něco štěpných produktů fibrinogenu velmi malá za přítomnosti těchto bílkovin však může být podstatně zvýšena, a to i více než desetkrát.

Tkáňový aktivátor plasminogenu t-PA je štěpen v krvi přítomnými prcteázami na dva řetězce, řetězec A a řetězec 3. Oba tyto řetězce zůstávají spojeny

- 3 cysteinovým můstkem. Stimulovatelnost účinnosti t-PA znamená velkou výhodu oproti jiným známým aktivátorům plasminogenu, jako je například urókináza nebo streptokináza, jak bylo popsáno například v publikacích M. Hoylaerts a další, J. Biol.

Chem 257 (1982), 2912 - 2919; W. Nieuwenhuizen a další,

Λ

Biochem. Biophys. Acta, 755 (1983), 531 - 533.

Mechanismus účinku t-PA in vivo je popsán například v publikaci Korniger a Collen, Thromb. Hamostasis 46 (1981), 561 - 565. Účinnost enzymu, zaměřená na povrch fibrinu dovoluje užít tuto látku jako prostředek proti pathologickým uzávěrům cév, například u srdečního infarktu, jak již bylo prokázáno klinickými pokusy, popsanými v publikacích Collen a další, Circulation 70 (1984), 1012; Circulation 73 (1986), 511.

Nevýhodou použití t-PA je prozatím rychlý pokles koncentrace této látky v krevním plasmě (Clearance). V důsledku toho je zapotřebí užát poměrně velkého množství t-PA k tomu, aby bylo možno dosáhnout in vivo účinného rozpouštění thrombů. Při vyšších dávkách však může dojít k vedlejším účinkům, například ke krvácení.

V evropském patentovém spisu č.

156 920 je popsán přírodní produkt odbourávání t-PA, který obsahuje ještě oblasti Kringel II a oblast proteázy, N-terminální zakončení tohoto produktu začíná alaninem v poloze loO, řetězec aminokyselin je uveden v publikaci Pennica a z ’ ,C 7 b -i- ί) -Í- L další, ?íature 3G1 (1933 214 - 221.

Cleara.nce tohoto prudkou cícccrsvá.: není příliš odlišný od těše hodnoty ?r: př.roiní t-?A. Aš chemickou modifikací kacaiydoké oblasd přič o jer. ím 'dekující skupiny js možno dosáhnout zlepšení

Vynález si klade za úkol navrhnout takovou změnu t-PA, aby vzniklý deriváo měl prodloužený poločas koncentrace v krevní plasmě. Současně by měla být uchována účinnost při rozpouštění thrombů a stinulcvateincst fior:

nem.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří tkáňový aktivátor p lasmir.ogenu t-?A, neglykosylovaný a tvořený následujícím řetězcem aminokyselin vzorce I (M)

SYQGNSZCY? GXG3AYRGTH SLTESGASCL PWN3:iíILI(S: VYTAQNFSAQ

ALGLGXHNYC RltPEGDAXRW CHVLKNRRLT WETCDVPSCS TCGLRQYSQ?

101 qjrbzgglfa diashpvíaa ieakhrrspg erelcggeli sscwilsaah

151 CEQEREPPHH LTVILGRTYR WFGEEEQKE EV3CYIVHKE FDDDTTDKDI

201 ALLQLK3DS3 RCAQESSV7R TVCLPPAELG LPEWTECELS GYGKB3ALS?

251 FYSERLZCBAH V3LYFSSRCT SQHLLNRTVT DNMLCAGETR SGGPQANLHD

301 ACQGDSGGPL VCLNIGRMTL VGIISWGLGC GOKBVPGVYT KVTNYLDWIR

351 DiNMRP (I) přičemž na aminoterminálním konci (δ. 1 - S) může být řetězec ještě prodloužen pomocí M.

- 5 Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že při vypuštění přebytečných, v nativním t-PA ae nacházejících oblastí nedojde k žádnému ovlivnění thrombolytického účinku a stimulovatelnost fibrinu rovněž zůstává v podstatě stejná.

* V derivátu podle vynálezu však chybí vazba na fibrin, přesto má derivát thrombolytickou účinnost in vivo, ještě o něco vyšší než je účinnost nativního t-PA-» Stejně překvapující je skutečnost, že při podání tlpromoolyticky účinného množství tohoto derivátu zůstává systemická fibrinolýza téměř neovlivněna. Ukázalo se tedy, že derivát t-PA podle vynálezu má za fyziologických. podmínek typické vlastnosti nativního t-PA, pokud jde o specificitu vzhledem k fiorinu. Tyto výsledky byly získán;/ při farmakologickém sledování tohoto derivátu, jak bude dále uvedeno v příkladu δ. Mimoto má bílkovinný derivát podle vynálezu velmi vysokou specifickou účinnost, byly popsány specifické účinnosti až 500 až 800 k jednotek/mg.

Předmětem vynálezu je rovněž řetězec DNA, který je kódem pro derivát t-PA a který je možno vyjádřit jako následující řetězec:

-οΙ ATGTCTTÁCCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACG 60

CACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATICCATGATCCTGITAGGC 120

121 AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGOCTGGGCAAACATAATTAC 180

181 TGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTG 240

241 ACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAG 300

301 CCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCT 360

361 GCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGGCCGGAGAGCGGTTCCTGTGGGGGGGCATACTC 420

421 ATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCAC 480

481 CACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAA 540

541 TTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGÁTGATGACACTTACGACAATGÁC 600

601 ATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTC 660

661 CGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGAeCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTC 720

721 TCCGGCTAGGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGTT 780

781 CATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTC 340

841 ACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCAC 900 901 GACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACT 960 961 TTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGOTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTAC 1020

1021 ACAAAGGTTACCAACGACCTAGACTGGATTCGTGACAACAIGCGACCG 1068 (II) á

Řetězec DNA, tak, jak byl svrchu uveden, je možno použít k expresi derivátu t-?A podle vynálezu v případě, že se uloží do plasmidu pro expresí. Tento plasmid pro expresi představuje další předmět vynálezu, stejně jako plasmid pro expresi, který má poněkud odlišný řetězec DNA, který však je rovněž kódem pro derivát t-PA podle vynálezu. Na základě degenerace genetického kódu jsou k tomuto účelu vhodné i řetězce, které jsou poněkud odchylné od svrchu uvedeného řetězce DNA.

Plasmid pro expresi s výhodou obsahuje kromě^Aetězce, který je kódem prp-d^rivát t-PA ještě regulovatelný promotor, napřikíad tac, účinný terminátor, například fd, značící oBla^t, umožňující selekci, například ge

Dalším předměťfcskvynž pA27.3. Získání tohoto plasmidu mid obsahuje řetězec podle vyn$Kzu tí jí plasmid jcladu 1, plasA rbsáno v přkterý je kódem pro derívá

Předmětem vynálezu je rovněž způsob výroby plasmidu pro expresi, který obsahuje řetězec DMA, který je kódem pro bílkovinu t-PA podle vynálezu nebo její derivát, který obsahuje kromě oblasti Kringel II s kódem pro aminokyseliny 15 až 252 řetězce aminokyselin t-PA a oblasti pro proteazu z t-PA ješoě další oblasti bílkovin t-PA, způsob spočívá v tom, že se uvedený řetězec vnese do plasmidu a řízenou i

mutagenesou se odstraní ty oblasti, které jsou kódem pro aminokyseliny, které se v derivátu t-PA podle vynálezu nenacházejí.

Volba plasmidu, do nějž má být zařazen řetězec ONA, který je “ícódem pro derivát t-PA podle vynálezu závislý na cílových buňkách, které mají být později použity pro expresi tohoto derivátu. Vhodné plasmidy a minimální požadavky, kladené na tyto plasmidy, například počátek replikace nebo místo působení restrikČních enzymů jsou odborníkům známy. V rámci vynálezu je možno místo plasmidu použít také Cosmid, tj. replikativní formu fágu (lambda, Jíl3) s dvojitým řetězcem a další, odborníkům známé vektory. Postup pro řízenou mutagenesu byl popsán v publikaci Morinaga a další, Biotechnology, 21, (1984), 634 a při provádění způsobu podle vynálezu byl uskutečňován podle této publikace.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob výroby derivátu t-PA podle vynálezu tak, že se dosáhne exprese plasmidu podle vynálezu ve vhodné buňce a výsledný produkt se isoluje z živného prostředí, popřípadě po rozrušení uvedených buněk. K výrobě derivátu t-?A podle vynálezu se s výhodou užívají buňky prokaryotických organismů. Je zvláště výhodné, nejprve z rozpustných částí buňky isolovat tak zvané inkluzní tělíska (nerozpustné agregáty bílkovin), tato. inkluzní tělíska, která obsahují t-PA se solubilizují působením guanidinhydrochloridu za redukčních podmínek, pak se vytvoří

- 9 derivát navázáním G3SG a pak se derivát t-PA renaturuje přidáním L-argininu a GSH. Přesný návod na aktivaci t-PA z inkluzních tělísek je uveden například v evropských patentových spisech δ. 219 874 a 241 022. Je však možno užít i jiných postupů získání účinných bílkovin z inkluzních tělísek.

»

Při provádění způsobu podle vynálezu k čištění X2P se postup provádí s výhodou za přítomnosti j

L-argininu zvláště v koncentraci 10 až 1000 mmol/1.

Výhodným způsobem se oddělení cizorodé bílkoviny provádí afinitní chromatografií na sloupci při použití ETI (Eritrina Trypsin Inhibitor). ETI se fixuje na nosič, například Sepharosu. Čištění při použití sloupce s ETI má tu výhodu, že na sloupec s tímto materiálem je možno přímo nanést koncentrovaný vzorek, určený k renaturaci, za přítomnosti vysokých koncentrací argininu, například 0,8 mol/1. Shlukování K2P, které je možno provádět při nízkých j

koncentracích argininu pod 10 mmol/1, tedy není zapotřebí provést. Zvláště výhodné je čištění K2P sloupcem s obsahem f

ETI za přítomnosti 0,6 až 0,8 mol/1 argininu. Roztok s obsahem K2? má s výhodou pH vyšší než 7, zvláště 7,5 až 8,6. | * « A I

Vymývání sloupce s obsahem ΕΤΣ se provádí při snížení pH, a to jak za přítomnosti, tak v nepřítomnosti argininu za podmínek, umožňujících dobrou rozpustnost K2P. S výhodou se při eluci pH nachází v kyselé i

i i 7 SV

- 10 oblasti, zvláště v rozmezí 3 až 5,5.

K2P získaný zcůscbs účinnost t-PA v rozmezí 550 2 ma specifickou uc inr jeďr.otek/mg při čís^- te vyssí nez

Podle vynálezu je možno získat také derivát t-PA, který má podstatně prodloužený poločas v plasvzhledem k tomu, že je možno dosáhnout snížení clearance. De

rivát	podle vynálezu	při	tom neztrácí žádnou	ze
nc s z í	, vhodných pro	jeho	použití k thrombolýz	o
'-Η V» —»	odávání u lidí	také	vzhledem k tomu, že	se
	vy s ky tují ž ádr. é	vedl	ejší účinky, jako je	k ?

muž dochází při použití poměrně vysokých dávek nativního c-í

Derivát t-?A podle vynálezu má takovou účinnost, že stačí použít čtvrtinu množství t-PA, jehož by tylo zacotřec: použít k dosažení téhož účinku. Podszatu vynálezu tvoří tak; farmaceutický prostředek s fibeinolytickým účinkem, a jako svou účinnou složku obsahuje derivát t-PA vzorce 1.

Přehled obrázku na výkresech

Na obr. 1 je schematicky znázorněna výroba plasmidu pA27.3.

Na obr. 2 je znázorněno srovnání vazby fibrinu pro derivát t-PA podle vynálezu (křivka 1) s vazbou fibrinu pro nativní t-PA, jehož exprese bylo dosaženo v buňkách CHO ( tc t-PA. CKO ) : t-PA s dvojitým řetězcem z burek

CHO, rozštěpený na fyziologickém štěpném místě Arg 275-lle276, křivka 2; sct-FA/CHO: t-PA s jednoduchým řetězcem z buněk CHO, křivka 3.

Na obr. 3 a 4 je znázorněn diagram farmakokinetické účinnosti t-PA pro derivát t-PA podle vynálezu ve srovnání s běžně dodávaným prostředkem *s obsahem t-PA (Actilyse^)) j na křivce 1 je hodnota pro K2P v dávce 200 OOO jednotek, 0,25 mgAg nitrdžiln*, čtyři pokusy na zvířatech.

Na křivce 2 je výsledek pro prostředek Actilyse v dávce 200 000 jednotekAg nitrožilně, šest pokusných zvířat.

Na obr. 5 je znázorněna závislost thromcclysy na dá^ce pro derivát t-PA podle vynálezu a pro Actilyse*. Je uvedena střední hodnota plus standařdní odchylka, jedna kilojednotka = přibližní 1000 mezinárodních jednotek. Na křivce 1 je výsledek pro K2P, na křivce 2 je výsledek pro p

prostředek Actilyse .

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklady orovedení wnálszu

Příklad 1

Konstrukce plasmidu pA27.3

A

Výchozí plasmid p?22í7635, popsaný v evropském patentovém spisu č. 242 336 má následující'složk; tac-promotor, lac-operátorovou oblast s kodonem AIG pro počá· tek, kodovou oblast pro derivát t-?A 5K2P, terminátor transkripce 2 pKK223-3, gen pro β-laktamázu, gen pro odolnost pro ti kanamycinu a počátek plasmidu pACYC177, jde o plasmid, který se nachází v buňce v malém počtu kopií, řetězec derivátu t-PA PK2? se skládá z nukleotidu 150 až 336 (oblast F) , 715 až 1309 (oblast K2, proteáza, malý podíl 3^)71) a kodon ATC- pro počátek. Polohy nukleotidů jsou uváděny podle publikace Bennica a další, Nátuře 301 (1933) 214 až 221, .

K vypuštění oblasti F z konstrukce FK2? plasmidu pPESí7685 bylo použito v podstatě postupu podle publikace Morinaga a další, Bio technology 21 (1984), 634.

Ke tvorbě heteroduplexního útvaru byly z pPF2«í7685 izolovány dva fragmenty. Fragment A: pRPM7o35 byl rozštěpen restrikčnť enzymem EcoSI. Štěpné produkty byly odděleny elektroforézou na gelu a největší fragnent EcoRI byl izolován. Fragment B: plasmid pPEM7685 byl linearizován restríkčním enzymem Xhol. Linearizovaný plasmid byl po elektroforéze na gelu získán s vysokou čistotou. Pro mutagenesu byl synteticky vyroben následující oligonukleotid:

5' TG TCT TAC CAA GGA AAC AGT GA 3'

K tvorbě heteroduplexu se smísí '^s fragment A,'fragment B vždy v množství 450 fmol a oligonukleotid v množství 75 pmol a směs se inkubuje za pří- j tomnosti 50 mmol/1 chloridu sodného, 10 mmol/1 tris-HCl í o pH 7 a 10 mmol/1 síranu hofečnatého 3 minuty při teplotě |

100 °C, pak se směs rychle přenese do ledu. Renaturace DNA se provádí 30 minut při teplotě 60 °C. K syntéze se k heteroduplexu přidají ještě následující složky:

Desoxynukleoťrifosfáty v množství vždy 0,25 mmol/1, AT? 1 mmol/1, chlorid sodný 100 ramol/1, tris-HCl o pH 7,5 6,5 mmol/1, chlorid horečnatý 8 mmol/1, P-merkaptoethanol 1 mmol/1, Klenowův fragment DKA-polymerázy z 3. coli 0,125 jednotky//Ul vzorku a T4-ligáza v množství 0,1 jednotky/yul vzorku. Syntéza se provádí 4 hodiny při teplotě 16 °C. Pak se směs použije k transformaci buněk E. | coli (RK82, DSÍ 3639) oři použití lac I^q-plasraidu a pak se j r

transformanty podrobí selekci přidáním 25^ug/ml kanamycinu í k živnému prostředí.

Hybridizací kolonií při použití svrchu popsané mutagenesy s použitím olegonukleotidu jako. sondy b|lo možno izolovat ty klony, které obsahovaly plasmid pA27.3. Tento plasmid se odlišuje od výchozího plasmidu pRS*I7ó85 mimo jiné tím, že chybí místa působení enzymu pstl a Sspl. Obě tato místa se nechází v oblasti F výchozího plasmidu. Konstrukce plasmidu pA27.3 je schematicky znázorněn na obr. 1.

Příklad 2

Způsob výroby účinného derivátu t-PA K2F z E. coli.

Rozrušení buněk a příprava inklusních tělísek (ΙΞ)

1,6 kg vlhké buněčné hmoty 3. coli DSM 3689, transformovaného plasmidem ρΑ27·3 se uvede do suspenze v 10 litrech roztoku s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl, mmol/1 EDIA při pK 6,5 a teplotě 4 °C. rak se přidá 2,5 g lysozymu a směs se inkubuje 30 minut při teplotě 4 °C. Pak se dovrší rozrušení buněk působením zvýšeného tlaku. K materiálu se přidá ještě 5 litrů 0,1 mol/1 tris-HCl, 20 mmol/1 ΕΠΤΑ, 6 % Triton XI00 a 1,5 mol/1 chloridu sodného při pK 6,5, načež se směs inkubuje ještě 30 minut při teplotě 4 °C. Pak se oddělí nerozpustný podíl, tvořený inkluzními.tělísky odstředěním v Padbergově odstředivce. Peleta se uvede do suspenze v 10 litrech roztoku s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl, mmol/1 ΕΣ7ΓΑ o pH 6,5, inkubace trvá 30 minut při 4 °C, inkluzní tělíska se pak izolují odstředěním.

Solubilizace inkluzních tělísek

100 g inkluzních tělísek (vlhká hmotnost), se uvede do suspenze ve 450 ml roztoku s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl, 6 mol/1 guanidiniumhydrochloridu, 0,2 mol/1 ΣΖΓΕ, 1 mmol/1 SETA o pH 8,6 a pak se směs míchá dvě a půl hodiny při teplotě 25 °C.

Po nastavení pH na hodnotu 3 přidáním 25% kyseliny chlorovodíkové se provádí dialýza proti 10 mmol/1 HC1, užije se 3 x 50 litrů roztoku v době 24 hodin při teplotě 4 °C.

Derivatizace

Jako předloha se užije pevný guanidiumhydrochlorid, takže po konečném zředění svrchu uvedeného dialyzátu 10 mmol/1 EC1 je koncentrace guanidiniumhydrochloridu 6 mol/1.

Směs se předem inkubuje 1,5 hodiny při teplotě 25 °C, pak se přidá oxidovaný glutathion (GSSG) do koncentrace 0,1 mol/1 a tris-HCl do 0,05 mol/1 a pH se upraví roztokem s obsahem 5 mol/1 hydroxidu sodného na hodnotu 9,3. Pak 3e směs míchá 3,5 hodiny při teplotě 25 °C.

lo Po úpravě pK na hodnotu 3 přidáním 25% kyselin;' chlorovodíkové se provádí dialýza proti roztoku s obsahem 10 mmol/1 kyseliny chlorovodíkové, v průběhu 48 hodin se užije 3 x 100 litrů roztoku při teplotě 4 °C. Po ukončení dialýzy se materiál odstředí a čirý supernatant se dále zpracovává.

Renaturace

Reakční nádoba s objemem 10 litrů se naplní roztokem s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl, 0,8 mol/1 L-argininu, 2 mmol/1 GSH, 1 mmol/1 SECA při pH 8,5. Renaturace se provádí při teplotě 20 °C trojnásobným přidáním vždy 100 ml derivátu ve formě disulfidu v časovém odstupu 24 hodin.

Fa renaturaci se získá materiál se specifickou účinností 1500 až 10 000 I.V. (mezinárodní jednotky)/mg, stanovení bude uvedeno v příkladu 4b. Jednotka b je jednotka účinnosti podle definice WHO, National Institute of Biological Standarde and Control.

Koncentrace renaturované směsi

Renaturační směs je možno koncentrovat při použití hemodialyzátoru.

- 17 ETI-eluát

Příklad 3

Čištění K2P v E. coli

1. čištění K2P z E. coli afinitní chromatografii na sloupci ETI-sacharosy po předchozí koncentraci

a) Eluce kyselinou citrónovou

Renaturační směs byla zahuštěna pomocí hemodialyzátoru (Asahi AM 300) v poměru 1 : 23 a zásobní roztok byl doplněn na 0,5 mol/1 chloridu sodného. Tento materiál byl pak nanesen na sloupec ΕΪΙ-sepharosy v rovnovážném stavu s 0,1 mol/1 tris-HCl o pH 7,5 s 0,8 mol/1 argininu a 0,5 mol/1 chloridu sodného. Objem ekvilibračního roztoku byl 50 mi, objem vzorku byl 550 ml, tj. 10ti násobek objemu sloupce/h, sloupec byl promýván ekvilibračním pufrem tak dlouho, až absorpce eluátu při 280 nm byla rovna hodnotě pro pufr. Eluce vázaného materiálu pak byla prováděna při použití 20 mmol/1 kyseliny citrónové o pH 3,2.

Parametry postupu jsou uvedeny v následující tabulce:

i \ objem ml účinnost Cp_rot SA ⁷ lU/mg

IU/ ml(mg/ml) koncentrát 550 57 162 14· 4 083

330 OOO 0,71 465 000

Vysvětlivka k tabulce:

(příklad 4b) dělená obsahem bílkoviny ve vzorku. Cprot ⁼ k°^ncentrace bílkovin

b) Eluce 0,3 mol/1 Arg o pH 4,5

Renaturační směs byla zahuštěna obdobným způsobem jako v příkladu 3.1.a). Na sloupec s objemem 25 ml ETl-Sepharose v rovnovážném stavu s roztokem s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl o pH 7,5, 0,8 mol/1 arg a 0,5 mol/1 chloridu sodného byla nanesena 300 ml koncentrátu při průtoku 12 objemů sloupce/h a sloupec byl pak promýván ekvi libračním pufrem tak dlouho, až se extinkce eluátu při 280 rovnala hodnotě pro pufr. Vázaný materiál byl pak vymýván roztokem s obsahem 0,3 mol/1 argininu o pH 4,5.

Parametry postupu jsou uvedeny v následující tabulce:

koncentrát

800

ETI-eluát objem ml účinnost IU/ml

1770

000 11,3 0,6

280 000

550 000

2. čištění K2P z S. coli afinitní chromatografií na sloupci

ETI-sacharózy bez předchozí koncentrace

Na sloupec ETI-Sepharosy s objemem ml, v rovnovážném stavu v 0,1 mol/1 tris-HGl o pH 7,5,

0,8 mol/1 argininu a 0,5 mol/1 chloridu sodného se nanese 12 litrů směsi a sloupec se tak dlouho promývá ekvilibračním pufrem, až absorpce eluátu má stejnou hodnotu jako pufr. Sluce vázaného materiálu se pak provádí roztokem s obsahem 0,8 mol/1 argininu o pH 5. Parametry postupu jsou uvedeny v následující tabulce:

objem ml účinnost C_{? t}IU/ml mg/ml IU/mg

výchozí směs ETI-eluát

000 615 0,135 4556 25

105 000 0,135 536 000 35

D Stimulace fibrinem = účinnost za přítomnosti fibrinu, dělená účinností bez fibrinu.

Příklad 4

Charakterizace čištěného K2P z E. coli

a) Chemická charakterizace bílkovin

- SDS-Page a vysokotlaká kapalinová chromatografie v reversní fázi

Homogenita čištěného materiálu, získaného afinitní chromatografií na sloupci ETI-Sepharose byla sledována SDS-Page a vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reversní fázi (RP-HPLC). Σ poměrně krátké dráhy bylo možno vypočítat pro K2? z prokaryotických organismů molekulovou hmotnost 3S 500 + 2 000 jednotek. Densitometrické vyhodnocení prokázalo čistota vyšší než 95 %.

RP-HPLC je založena na odlišné® působení bílkovin a hydrofobní matrice. Postup se využívá jako analytická metoda pro průkaz čistoty materiálu.

Analýza čištěného K2? z E. coli byla prováděna při použití sloupce Nucleosil 300 (Knauer) při použití gradientu kyseliny trifluoroctové a acetonitrilu. ?ufr A: 1,2 ml kyseliny trifluoroctové v 1000 ml vody.

Fufr B: 300 ml vody, 700 m acetonitrilu, 1 ml kyseliny trifluoroctové; 0 až 100 % . Souhrnným výsledkem chromatografická analýzy byla čistota produktu vyšší než 95

- N-terminální řetězec aminokyselin

N-terminální řetězec aminokyselin byl stanoven na analyzátoru aminokyselin (ABI 470 Sequenatorít se standardním programem. Zjištěný řetězec S1-Y2-Q3-G4-N5-S6-D7-C8-Y9 je zcela v souladu d očekávaným řetězcem, odvozeným od ' _? řetězce DNA. j

I i

T

b) Stanovení účinnosti

Stanovení účinnosti K2? z E. coli in vitro bylo prováděno podle návodu, uvedeného v publikaci Zeitschrift fur die gesamte innere Medizin (ZGEíAL) 42 (17) 478 - 485 (1987). Specifická účinnost byla 550 0C0 ý 200 000 IU/mg. Stimulovatelnost K2P z E. coli fragmenty BrCN fibrinogenu byla v tomto systému vyšší než 25. Jde o účinnost za přítomnosti fragmentu fibrinogenu, dělenou účinností v nepřítomnosti těchto fragmentů.

c) Vazba na fibrin in vitro

Vazba K2P z Ξ. coli na fibrin byla stanovena způsobem podle publikace Higgins D. L. a Vehar G. A. (1987), Eiochem. 26, 7736 - 7791.

obr. 2 je zřejmé, že K2P z E, coli na rozdíl od t-PA z CHO nebo t-?A z Ξ. coli neváže do větší míry fibrin.

Λ

Příklad 5

Ke zvýšení výtěžku extrakce byl kó- j dový řetězec pro K2P překlonován ve vyšším počtu kopií. K tomu účelu byl užit plasmid pePa 126.1, popsaný v NSR patentovém spisu č. 3 333 378. Tento plasmid je tvořen v podstatě vektorem pKK223-3 a kódovým řetězcem prc t-PA, jak byly popsány v evropském patentovém spisu č. 242 535.

Do tohoto plasmidu byl nejprve integrován řetězec fd-terminátoru. K tomuto účelu byl plasmid pePa 126.1 linearizován restrikčním enzymem Hind III. Takto rozštěpený plasmid byl podroben elektroforéze na gelu a získán s preparativní čistotou. Plasmid pLBUl, popsaný v publi- | kacích Seck a další,(1978), Nucl. Acids. Res., 5, 4495 - 4503j Gebtz a další, (1981) PNAS 73 (8):4963, byl rozštěpen působením enzymu Hind III a elektroforézou na gelu s následnou elucí byl s preparativní čistotou získán fragment o velikosti 360 bp s obsahem fd-terminátoru . Pak byly navázány linearizovaný plasmid pePa 126.1 a fragment z plasmidu pLBUl po štěpení enzymem Hind III o velikosti 360 bp. Směs, v níž byla

provedena vazba byla kotransformována plasmidem pU3S 500 v E. coli DSM 2102. Plasmid byl popsán v NSR patentovém spisu δ . 3 838 378. Ze získaných klonů byly izolovány klony, obsahující požadovaný plasmid pePa 126 fd, lišící se od výchozího plasmidu pePa 126.1 druhým místem působení restrikčního enzymu Hind III.

Z plasmidu pePa 126 fd byly získány dva fragmenty. Jeden o velikosti 3,4 kb po štěpení enzymy BamHI/PvuI a druhý o velikosti 1,3 kb po štěpení Pvul/Xmal.

Oba tyto fragmenty byly vázány s fragmentem o velikosti 1,3 kb po štěpení enzymy BamHI/Xmal z plasmidu pA2?.3 a užity s plasmidem pUBS 500 k transformaci S. coli. Výsledný plasmid byl označen pA27 fd a od plasmidu pePa 126 fd se liší tím. že obsahuje druhý nejmenší fragment EcoRI z pePa 126 fd o velikosti 610 bp, který je v plasmidu pA27 fd zkrácen;/ o přibližně 515 bp.

Příklad 6

Farmakologické zkoušky derivátu t-PA K2P, který byl získán expresí v prokariotických organismech

1. Farmakokinetika K2P u králíků

Derivát K2P byl srovnáván u králíků

R (Neuseeland) s vlastnostmi prostředku Actilyse .Oba prostřed ky byly podávány infusí v dávce 200 000 IU/kg, přibližně 30 minut. Vzorky plasmy byly odebírány před infusí, v jejím průběhu a po jejím ukončení do určité doby. Účinnost t-PA byla měřena spektrofotoraetricky způsobem podle publikace J. H. Verheijen a další,, Thromb. Kaemostas. .48, 266, 1982, modifikovaným podle publikace K. Lili, Z, ges. Inn. Med., £2, ; O , 1?© t ·

K vypočítání farmakokinetických parametrů bylo užito programu s nelineární regresí, který byl modifikován podle publikace Η. Y. Kuang, Aero-Astronautics-Heport 64. Fice University, 1 - 30, 1969. Parametry byly vypočítávány jednotlivě s pomocí biexponenciálního farmakokinetického modelu.

X2? má pětkrát delší poločas (tl/2a = 10,3 min., pokles koncentrace v plasmě) než prostředek Actilyse (prostředek s obsahem t-PA, Thomae), jak je znázorněno v tabulce 1 a na výkresech 3 a 4. Na konci infuse byla v případě X2P naměřena účinnost t-PA (C^^) v plasmě 1986 lU/ml, což je hodnota šestkrát vyšší než pro prostředek Actilyse . z objemu (V ) bylo možno připsat pro K2P potřebu 46,8 ml/kg ve srovnání s objemem 73,7 ml/kg v případě prostředku Actilyse « Celkový clearance (^cl|. P^ro Phostředek Actilyse 22,2 ml/min/kg, kdežto v případě K2?-Pro

3,2 ml/min/kg, což znamená snížení na 1/7. Pro použití fibrinolytika k injekčnímu podání ve větším objemu je zvláště zajímavá tak zvaná plocha pod křivkou (AUC\, protože poskytuje srovnání vztahu doby, po kterou zůstává dostatečná plasmatická koncentrace látky. K2P má osmkrát větší AUC velikosti 1064 IU/ml.h než Actilyse', pro kterou má uvedená hodnota velikost 133,3 IU/ml.h.

Celkově je mošno uvést, že K2? má ve srovnání s komerčně dodávanou rekombinantní bílkovinou t-PA při stejná dávce pětkrát až osmkrát zlepšený farmakokinetický profil.

2. Parmakodynamika K2? u králíka

X průkazu thrombolytické účinnosti bylo použito známého králičího modelu pro thrombózu jugulární žíly, model byl popsán v publikaci D. Collen a další,

J. Clin. Invest. Ji, 368, 1983. K2P a prostředek Actilyse^ byly zkoumány vždy ve třech dávkách. Obě látky byly podávány 4 hodiny ve formě infuze, načež byla zkoumána rychlost rozpouštění .sraženiny, jak je dále uvedeno v tabulce 2 a znázorněno na obr. 5.

Dávka pro rychlost thrOmbolýzy 50 % (ED^q) lag, vypočítaná lineární regresí byla pro K2P 124 000 IU/kg KG a pro prostředek Actilyse 520 000 IU/kg KG. Je tedy zřejmé, žé K2P má čtyřikrát vyšší thrombolytický účinek než prostředek Actilyse.

Při podávání K2P bylo možnp dosáhnout v krevní plasmě.takové účinnosti typu t-PA, která byla srovnatelná s účinností prostředku Actilyse, avš-ak při čtyřikrát nižší dávce. S dávkou 800 kU prostředku Actilyse/kg KG srovnatelný účinfek bylo možno získat při dávce 200 kU K2P/kg KG při malém vlivu na fibrinogen, plasminogen a ccg-antiplasmin, dávka 800 kU prostředku Actilyse/kg KG je tak vysoká, že typy účinku již nelze rozlišit.

K2P' je tedy t-PA-matein, který má při použití na králičím modelu thrombózy jugulární žíly ve formě čtyřhodinové infuse při současném snížení dávky na 1/4 dávky prostředku Actilyse stejný thrombolytický účinek jako uvedený prostředek. K2P se tedy svým účinkem neodlišuje od účinku uvedeného prostředku, avšak při daleko nižší dávce má týž účinek na srážecí systém.

o

o.

X ·

04 O> H «k *k * * m m 4

Farmakokinetické parametry údajů o koncenťraci t-PA v plasmě v průběhu času podle počítačových údajů o účinnosti t—PA.

Φ

Λ1 \

Cí

P B o\ •PH

Η 8 O

H

HH β

β H 6

Λ4

X	O O
Φ	04
Ό Φ
*4	©
P
©	>
O	4
β	TJ
O.	Kw/

H

Η» H + »

KO «* A t— 04 + 1

	t-	t-	t-
00 0k	« «6 4	* m	o\
KO	H	c-	H
4	+ 1		+ 1

KO	KO	KO	rM
•k	w	•k	«k
KO	04	KO	00
CO	KO	04	H
OK	t>	Η»	rH
H	+ 1		+ 1

σκ	O	Ok	4
«k	«k	«k	*»
4	4	o	04
		r“1
	+ 1		+ í

n	e-	H	KO
«k	«k	«k	«k
o	rM	04	o
rM	+ 1		+ 1

Ό lf ϋ β «ί

Thrombolýza, účinnost t-PA v plasmě po 4 hodinách infuse a parametry R hemostázy 30 minut po ukončení infuze pro K2P, Actilyse a rozpouštědlo

«	te
©	JA
01
>»	P
rH	ai
P P O	8
««:

«	te
©	>1
03
>»	P
rH	AJ.
P
P O	8
	oo
		P
		©
1		©
xn		*
a		Eh
o	©	\
P.	rH	rH
N	Ό	O
O	χυ	©
P	P

te ja

P

JA

d.

cj O te

Aí

JA

A Q OM O « rH te ja

JA

Ph Q CJ O

P ©

e ©

©

P.

r-t	cc	m	Ή-
+ 1	vp	+ 1	+ 1	+ 1	M	A
y£)	II	r-	o	SR	c-	>
·*	P		σ\	co	00

		CJ
vp			VP	'«ť	VO
	ř-	4·»
+ \|			4-1	4-1	4-1
	\|\|	t-
		O	r-	c~
vp	P	rH	c—	r-	c—
rH			n	o rH	oo
+ 1	vp		4-1	+ 1	H-l
,-H	II		CJ	00	00
rH	P	I	cc	cc	cc
			vp
				rH
rH			4-1	rH
	CJ	o
4-1			LA	4-1	+ 1
CC	II	+ 1	vO	00	n
CJ	P		00	c-	cc
VO		m	vp	vp	’Φ
4-1	la	+ 1	4-1	4-1	4-1
CJ	II		O	LA	O
m	P	-Η	CC	C—
		CJ
		·*
		CO
cc		rH	CJ	VO	rH
	m	+ \|
+ 1		t-	+ 1	+ 1	+ 1
cc	II	•M m	M-	CC	O
e-	P	cc	r-	t-	t—

χ’-μ	>
tft
©	Ph 1
N	P
>7 rH	P
O	01
X ,	o
a o P	•rH
X	XJ
P	a

		5
rH
a	•N—*
C<		P
	P	©
K	©	te
	te	o
	o	P
>©	c	•H
a	P	a
m	Pi	m
©	X	©
rH	P	í—4
Λ	Pm	PH

p

P a

© ©

rH

P.

P c

©

CJ tí

Jde o průměry + standardní odchylka, kU = 1000 IU, hodnoty jsou udány vztaženp na základní hod^ty *

Příklad 7

Farmakologické vlastnosti K2P z E. coli na psím modelu thrombózy koronární tepny

Aby bylo možno vyšetřit thrombolytický účinek K2P z E. coli na tepenné thromby, byl volen model na zvířeti pro simulaci akutního infarktu myokardu.

Jako pokusné zvíře byl zvolen pes. Metoda pro tvorbu thrombu v koronární tepně byla modifikací postupu podle publikace Romson a další, Thromb, &es. 17. 841, 1980. Při otevřeném hrudníku byl u narkotizovaných psů s řízeným dýcháním elektricky podrážděn intenzitou 150/uA povrch intimy Rámus čircumflexus A. coronaria 3inistra ( LCX), čímž byla vyvolána thrombóza. Listálně od thrombozy byla předem uložena svorka, aby bylo možno vyloučit experimentální stenosou reaktivní hyperemii. Proximálně od thrombu byla céva opatřena elektromagnetickým průtokoměrem, aby bylo možno měřit reperfusi.

Na počátku pokusu byla po dobu jedné minuty heparinisováným psům podávána vždy šesti psům na jednu dávku různá dávka EM 06.022 s rt-PA z eukaryotických organismů (Alteplase, Actilýse, Dr. Karl Thoaae GmbH i Biberach, ISR), současně bylo podáváno také Placebo. Před injekčním podáním a v určitých časových odstupech po injekčním podání byly odebírány vzorky krevní plasmy, aby bylo možno stanovit

- 30 účinnost t-PA a koncentraci fibrinogenu, plasminogenu a ttg-antiplasainu a také počet thrombocytů v krvi. Fibrinogen byl stanoven měřením koagulace podle publikace Clauss, Acta haemat. 17. 237, 1957, plasminogen a ctj-antiplasmin byly stanoveny podle publikace Collen a další, J. Clin. Invest. 71.

368, 1983 spektrofotometricky. Dále byla stanovena na zadní tlapce psa doba krvácení Simplate (Simplate I, Organon Teknika, Eppelheim, NSR) při žilním tlaku 40 mm Hg podle publikace J. Surg. Res., 27. 244, 1979. Statistické srovnání naměřených hodnot s kontrolními hodnotami před injekčním podáním bylo provedeno Wilcoxonovým testem.

Aby bylo možno popsat thrombolytický postup, je udán počet zvířat ve skupině a doba, která uplyne do reperfuse. Z těchto údajů je možno usoudit na průměrnou rychlost repefuse. Mimoto se měří 2 hodiny po injekčním podání vlhká hmotnost zbývajícího thrombu, aby bylo možno zjistit počet zvířat, u nichž došlo po reperfuzi k opětnému uzávěru tepny. Pomocí semilogaritmické analýzy regresů bylo možno pro každou látku stanovit účinnou dávku pro 50½ rychlosr repe^fuze (= ΕΏ^θ). Statistické srovnání hmotnosti těchto thrombů bylo provedeno pomocí Wilcoxon-Mann-Whitneyova testu.

Koncentrace t-PA v plasmě byly měřeny fotospektrometricky v podstatě podle publikace Verheijen a další, Thromb. Haemost. 48. 266, 1982 v modifikaci, která byla uvedena v publikaci Lili, 2. gesaate Inn. Med., |

478, 1987. K vypočítání farmakokinetických parametrů byl | užit program nelineárních regresí, modifikovaných podle I publikace Η. Y. Huang, Aero-Astronautics Report 64, Rice I

University, USA, 1 - 30, 1969. Parametry byly vypočítávány I jednotlivě po odečtení bazalních hodnot účinnosti t-PA z j |

F li naměřených hodnot pomocí biexponenciálního farmakokinetic- | | kého modelu. |

Tímto způsobem byly získány násle- I dující výsledky: | |S

I. Farmakodvnamika u psa I

K2P vede po nitrožilním podání k I reperfuzi, která je závislá na dávce. Maximální účinek 100 % H je možno dosáhnout po podání 200 kU/kg KG. V případě prostřed- I ku Actilyse je k témuž účinku zapotřebí dávky 1600 kU/kg KG. | I

Pro srovnání je hodnota pro K2P 83 kU/kg KG, což je j I

II, 5 x nižší hodnota než pro prostředek Actilyse, jehož i fi hodnota je 96l kU/kg KG. Při podání placeba nedošlo vůbec k reperfuzi. Hmotnost zbývajícího thrombu při podání placeba byla 9,6 + 1,6 mg, jde o průměr a standardní odchylku. U obou účinných látek došlo při zvyšování dávky k statisticky významnému snížení hmotnosti zbývajícího thrombu, ve srovnání g s kontrolami, jimž bylo podáváno placebo. K reperfuzi došlo *

v případě K2P v průměru o 25,9 + 3,5 min, v případě Actilyse byla ta podoba 24,2 +6,2 min. U většiny psů došlo po reperfuzi k opětnému uzávěru tepny, jak je zřejmé z tabulky 3.

2. Farmakokinetika u psa

Po nitróžilním podání 200 kU/kg K2P nebo Actilyse je možno u narkotizovaného psa prokázat, že rychlá fáze poklesu koncentrace v plasmě, vyjádřená jako ^1/2^α ’ P^ro ^2P 7,2 + 1,1 minut, tato doba je tedy 4,5krát delší než pro Actilyse, kde je 1,6 + 0,2 min, jak je zřejmé z tabulky 4. Koncentrace v plasmě bezprostředně po ukončení injekce je v případě K2P přibližně dvojnásobná ve srovnání s Actilyse. Odstranění K2P z plasmy, tj. clearance (Cl _t) trvá u K2P 9krát déle než u Actilyse. V důsledku toho je plocha pod křivkou pro K2P také téměř 9,5krát větší.

3· Specifičnost pro fibrln u psa

Dvě hodiny po injekčním podání K2P bylo možno prokázat malé snížení zbytkové koncentrace fibrino genu, v závislosti na dávce, a to na 81 + 10 % u nejvyšší dávky 200 kU/kg KG. Oproti tomu byla koncentrace fibrinogenu

- 33 po podání nejvyšáíLdávky Actilyse 1600 kU/kg KG snížena až na 3 i O jak je zřejmé z tabulky 5. V případě, že se při semilogaritmické analýze regresu pro závislost vedlejšího účinku na dávce použije snížení koncentrace fibrinogenu a thrombolytická účinnost se přiřadí ke koncentraci fibrinogenu, získá se pro stejně silnou dávku K2P snížení fibrinogenu na 92,5 %, kdežto v případě Actilyse na 38,6 %. Také v případě plasminogenu a a₂-antiplasminu je možno prokázat dvě hodiny po podání injekce snížení těchto látek v závislosti na dávce, rovněž toto snížení je v případě Actilyse daleko vyjádřenější než v případě K2P. Koncentrace destiček zůstává téměř neovlivněna oběma látkami.

4. Účinek na dobu krváceni u psa

Při podání K2P nitrožilne>dochází ke statisticky významnému prodloužení doby krvácení ve srovnání s kontrolními hodnotami, u všech čtyř použitých dávek. Oproti tomu prodlužuje Actilyse v dávkách 1130 a 1600 kU/kg KG statsticky významně dobu krvácení.

5. Celkové shrnuti koronárních tepen bylo

Na popsaném psím modelu možno prokázat, že K2P je thrmobozy thromboly34 tický prostředek, jímž je možno dosáhnout po nitrožilní injekci 100% reperfuse, aniž by přitom současně došlo k většímu ovlivnění koncentrace fibrinogenu a aniž by byla prodloužena doba krvácení. Ve srovnání s prostředkem Actilyse, který představuje známý stav, je účinnost K2P po nitrožilní injekci ll,5krát vyšší. Při zkoumání farmakokinetického profilu K2P bylo dále prokázáno, že pokles K2P v krevní plasmě je devětkrát pomalejší než pokles koncentrace prostředku Actilyse.

Parametry thrombolýzy na psím modelu thrombózy koronárních tepen po nitrožilní injekci, trvající déle než 1 minutu placeba nebo stoupajících dávek Actilyse nebo K2P φ

sa

I—·

O

O β

-P ra o

c

-P o

XO

I β

φ

o.

« β

CS

A

O

Ό

Φ ra <4-i β

Φ

Λ

Φ β

VO	v	<n	OJ
		X;	\
VO	v	OJ	OJ

A e

o $

A *3) xu S >

O

Λί

P

Λ

A

S β

•H φ

ra «Ρ

OJ	0-	US
0b	0b	0b
r-l	o	O
+ 1	+ 1	+ 1
VO	OJ	•v
•b	0b	0b
σ>	CM	xf

xf	cn	m
•b		0b
o	ř~J	o
+ 1	+ 1	+ 1
trs	00	tTS
0b	0b	0b
trs	CO	OJ

Xť	r-4	00
0b	*b	0b
rM	iP	O
+ 1	+ 1	+»
xt	χ$·	trs
*	0*	0b
xí·	c-	tr\

r—i	m	ra	VO	VO	xt fp
+ 1	+ 1	<n + 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1
co	-*$	\ ΙΛ	os	trs	o	r”í
OJ	r-i	cn	OJ	r—1	cn

vo X.	VO	VO	VO	VO	VO	vo	vo	vo
O		X	X	X	X	X	X	\
	VO	Xť	04	O	vo	v	cn	OJ

β	VO VO	VO	vo	VO	vo	VO	vo	VO
	O	O	O	Q	O	o	Q	o
O	Q	O	O	o	O	2	o	o
	O	o	o	o	O	o	o	o
ra bQ	O	o	Q	o	2	o	2	o
jsi	O	cn	O	o	o	X*	o	trs
> X	1 vo	r-4	ro	OJ	OJ	rP	fp
xo ra
ra m	rH	r-i

Nanesené hodnoty znamenají průměr + standardní odchylka ra c

P

XO «

o	Φ CQ
A	-P
o	fp
o	•p
ra	P
fp	o
o.	x<

eu

Farmakokinetické parametry, odvozené od počítačových údajů pro koncentraci v plasmě v závislosti na čase u nafkotizovaných psů po nitroŽilní injekci 200 000 IU/kg KG

Actilise^ nebo K2P.

o
o.
CO	A
£	•
P	rH
X	1
Φ	r-f S
CJ	•
p	P
	w

P o

P r-i

CJ •ro c

CJ •rf

J«S rH s

«I r-1 ε

rH	co
	m	m	o
CO	CM	O
	+ 1	co	CM

KO	4-	KO	m
«b	#b	«b	•b
rH	rH		rH
	rH + 1		+ 1

r-1 C- C— r

vO C— 4 Cr>

O 41 KO r-l r-1 + I + 1

4· ·4·

C- O KO ΙΛ <—!

+ 1 r~ rc- r-f r—l CO n + i

QQ.	KO	KO	O
<m a	•b	•b	*»
\ Ή		KO	LA
rH S	rH		rH

+ 1 a

CM r-f

E-i β

jí

P tí

H ε

KO	CM	CM	rH	f—.
		•b		4
r-1	O	c-	rH	II
				£
			+ 1	'-r

X

Φ co r—. >> ko r-f •rt II

P o £ «J

KO ř£

CM

Í2

II £

	Φ	Φ o ro £ P £ Φ o £ O Λ: 3 O Jd > -r-i Ji Ό O
	o	O,
	£ ro	ro
	£	A
	ro	o
	φ	o
	r-f	r-l
	O	O.
	'>>	43
	>	£
	O	ro
	Jd	►
	r-f	o
	<0	r-i
	ϋ	O
ro	II	C. ro
je		£
r-l	P	P
>1	O	X
A	P	Φ
o	r-l
X!	O	•b
O		s
Ή		*4 P O
£		Ji
T3		>
?*	«·	•rf
ro	3	>£
Ό	1—1	Ji
£	41
ro	Ό	Ό
P	Ό	O
CO	O	O.
•f-l	O	ro
A	£
£	Vf	o
XH	£	o
e	Ό	r-i
•3		£.
£		s
P	P
	03	II
3 O	a	r-l
CO	Φ	O
•ro	43	O.
	A	ro
>5	O	£
P		P
o	II	X
£		Φ
Ό		CJ
O	o	P
X	>	<*:

Faktory srážlivosti a početthrombocitú 2 hodiny po nitrožilní injekci, trvající déle než 1 minutu pro placebo nebo stoupající dávky Actilyse^R nebo K2P na psím modelu thrombózy koronární tepny ©

χυ p

cň ©

Ό

P ©

XJ

O fi

Ή

-θ' «

β ©

I

CM a

c ©

ĎO o

fi τ-l x—>

ε aft

Κ ' © r-t O, β

β >» a*

P ©

Λ1 *->

MS

	o	o					m	H
m	r-t	r~1	vO	-φ	co		r-t
+ 1	+ 1	+ t	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1
	σ'	o		cn	8		r-t	co
o	i—i		o	o	O	O	r-t
rH	r“t		r·j	iP	r-t	rH	r-t	r-t

II β

rP P	r·t (H	VO	u\	*t·	vo	t*	t—	CM <P
+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1
CM	<n	ΙΛ	v·	VO	o	o	t-	p-
cn	rH		VO	co	•'φ	tn	c~	00

II	Cl	VO	m	n	CO	r-t	m	CM
β	+ 1	4.1	+ 1	+ i	+ 1	+ 1	+ 1	+ !
ΓΠ		cn	t-	o	Φ	r-4	co	o
O r-4		m	00	cn	r-	CO	co	cn

CM	o	rn
+ 1	+ 1	+ 1
vo	m	VO
O		r-t
i—1

-φ	m	O iP
+ 1	+ 1	+ 1
VO	t*-	Γ1
CO	cn	00

H	m	rn
+ 1	+ 1	+ »
m	CM	tn
cn	cn	cn

VO	VO	VO	VO	VO	vo	VO	vo	VO
	O	O		O	Q	o	O	o
	O	o	O	O	o	o	O	Q
	O	o	2	O	o	o	O	O
	O	o	o	o	Q	O	o	o
	O	rn	o	o	O	•Φ·	o	(Ok
1	vo	r-t	o	CM	CM	r-t	r—t

CO r—I rM

o	© ©
P	>>
©	i—t
o	•P
©	P
p	O
(~\|

Pr cj ©

r-i ž

Ή

I— «Μ

Ό 'm ©

Ό β

© w

+ 1 ε

©

XXJ ti

O ©

Ό >»

P o

β

Ό

O

Údaje jsou uvedeny v procentech výchozí hodnoty před injekcí.

Claims

- J i

PATENTOVÍ nároky

1. Tkáňový akoiv 'átor plas minogenu ný a tvořený následují cím řetězcem amine kyselin vz (M) Λ 1 SYQCNSDCY- GNGSAYXCTH SLTESGASCL PVNSMILZCX vytacnpsaq 51 ALGLGXHNYC RNTDGDAXPW CKVECÍRRLT tfFíCDVPSCS TGGLP.QYSQ? 101 QPRZXGCLPA DIASKPVQAA IíAXHRRSFG ERPLCCCZZ.Z SSCVZLSAAH 151 CPQE?,P??HH LTVZLCXTYR WPCčZZQKF EVEXYIVHXE FDCDTYCNOI 201 A LIGLXS0S5 RCAQESSWZ T7CLP2ADLQ LPDVTECELS GYCXHEALS? 251 FÍSERLXZAK VRLYPSSFGT SQKLZITRTVT DNMLCAGDTR S G Ξ 0 Al·«k-l·^-*. D 301 ACQG0SGG2L VCLNDCRHTL VGZI3VCLGC GQKDVPGVYT :<;tnyljwZr 351 DNMSF

který může být na aminoterminálním konci ješzě prodloužen navázáním M.

2. Řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro derivát t-PA podle nároku 1 s následujícím sledem baží vzorce II

1 ATGTCTTACCAACCAAACAGTGACTGGTAC7TTCGGAATCGGTCAGCCTACCGTGGCACG 60

61 CACACCCTCACCCACTCGCGTCCCTCCTCCCTCCCGTGGAAtTCCATCATCGTGATACCC 120

121 AAGG jl l i. ACACAGCACaGíiACCícaG i. Gii<.AGGCf\C Í.GGGCCTGGGC AAAC A λ AA k tAu 130

131 TGCCCGAATCCTGATC CGuA a.Gl-CAAGCCCTG\j xGCCACGTG gtg aag AACCGCAGGC k G 2^0

2^1 ACGTGGGAG kACTG kGAkG i.\jCCCTCC *,G\^ kCCACC kGGGGCGTGAGACAGTACAGCCAG 300

301 cctcagtttcgcatcaaaggaggggtcttcgccgacatcccgtcccaccggtggcagggt 360

361 GCCATCTTTGCCAAGCACAGkjAGG kCG\-.^-k/kjkjaGACGGGTTCC kG kGCGmGmmk^Ax AC k C A2Q i

• 39 421 AxCACw.Cw«KřCTtjwrv· «m«**iCk'sjC i. j. CCAOCACACkj » « «C^sjk,w-CAC

431 θΑθw«fcjr\2*jKj .Gaí¹· * .GwkjK.rtCr.ACn-.nCw^uti utjC^CC— ^CkjC^aCuauuauwACAAA

54 X . « μλλ(ι * *j λΑλλλ « n.C.A « .u ; ——Λ t.V.C kj,-v. ÍUuA.LjA. \j *\Cr\C *, . .“*. C xj Λ <_* tj.-\G
3 0 1 A *> í.Uk^UKj.kJ'* šCmvU *m χ νΛΛΛ Χ'*ΜΜΛ* áC—C*JKaátj i, Ck· Ct-ΑΟ^λΟΑΟκ-λΟ Ke sj . Ukj ς C 3 Q 1 Οκ/'μΑΟ k^J * 'W asJK^Krf^átrfKrfWWWteJKJKkOKJXtk* — 4»Οκ^«,*\ΟΟιΟ\«.ΟκμΟΑΟ .ÍjOAC-UKJ.—.KJ i . j/.JK. ί ta

721 TCwCvjKe ♦awww^AAGwAíuAGmww *kUiC;CCiix CTAGTICCCAGCCCC. tj AACkj.akjkj k- ς,

7 S 2 CA íG í, teAurtC .G 4.Αθ<·κ<ιΛ· '-'μλΟκ-^κα'- te KiKeACA j. GACAACAl Σ TAC x„ AACAGf-AC.^C t ta

841 ACCCACAÁCA.CCTCTGTGCTCCACACACTCCCACCCCCCCGCCCCACCCAAAC. .ggac

901 GACG^eKe .C\e <eACC*uKewAx * G ^Cu AGGGGGGGTGCTGTGTCTG AA CC ATGGG G G GATG ACT

9 O 1 i «G^J iUKíKlK.A a ta^kl CACv* · JKíKíW^W · GkJKjG aC i GGAGAGAAGGA A G . GeeGwKJ k U k KJ i.hC

1021 ACAAAGGTTAGGAACTACGTACAGTGGATTCGTGACAACATCGGAGGG 10 S 3 <o.

650

720

7 = 0

3-0

900

950

1G20

3. Způsob výroby tkáňového aktivátoru plafnir.ogenu s řetězcem aminokyselin vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se plasmidem, obsahujícím kódový řetězec vzorce II podle nároku 2 pro tento derivát transformují buňky z., coli a produkt exprese se izoluje ze živného prostředí nebe po rozrušení uvedených produkčních buněk.
4. Způsob podle nároku 3 , v y z

CUTÍCl i m, že se užije plasmid pA27.3.r.ebo plasmid pA27 fd.
5 . Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačuj í c í tím, že se jako produkční buňky užijí buňky Zscheris e chia coli.
6 . Způsob podle nároku 5,vyznačující se t í m, že se ke zvýšení výtěžku účinné bílkoviny oddělí vytvořená inklusní tělíska, která se pak solubilizují působením guanidinhydrochloridu, derivatizují se oxidovaným glutathionem a nakonec se derivát t-?A renaturuje přidáním L-argininu a glutathicr.u.

.
7·. Způsob podle nároku g, vyznačující se t í m, že se po renaturaci derivát t-?A v renaturační směsi koncentruje a nakonec se chromatografíčky čistí afinitní chro matografi í.
8 . Způsob podle nároku 7, vyznačuj ící se t í m, že se provádí v přítomnosti 10 až 1 000 mmol/1 L-argininu.
9 . Způsob podle nároku S,vyznačující se t í m, že se chromatografické čištění provádí při použití koncentrátu renaturační směsi, který obsahuje 10 až 1 000 mmol/1, s výhodou 600 až 800 mmol/1 argininu při použití adsorpčního sloupce s obsahem eritrinového inhibitoru trypsinu.
10 . Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že se koncentrát, určený pro chromatografické čištění upraví na pH 7,5 až 8,6.
11. Způsob podle nároku 9 nebo 10, v y z n a č u j í c í se t í m, ze se eluce výsledného produktu provádí při pn v rozmezí 3 až 5,5.
12. Způsob výroby plasmidu, obsahujícího kódový řetězec pro derivát t-PA se sledem baží podle nároku 2, vyznačující se tím, že se řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro bílkovinu t-PA nebo pro její derivát, který kromě oblaszí Kringel II s kódem pro aminokyseliny 175 až 253 řetězce aminokyselin t-PA a oblasti pro proteázu z t-PA obsahuje jeszě další oblasti bílkoviny t-PA uloží do plasmidu a řízenou mutagenezí se odstraní ty oblasti, které jsou kódem pro aminokyseliny, nenacházející se v derivátu t-PA. podle nároku 1.
13 Způsob podle nároku 12·, vyznačuj icí tím, že se jako řetězec DNA pro bílkovinu t-PA nebo derivát užije odpovídající cDNA.

odle nároků 12 nebo 13, v y z n a č u j íze se užije plasmid pA2 / .3 a plasmic.

45· Farmaceutický prostředek s *'ibrinolyzickým účinkem, vyznačující se t í m, že jako svou účinnou složku obsahuje derivát t-PA vzorce I oodle nároku I.

.astupuj:

c 'CCC

Dr. ZDENKA KOREJZOU A í

Anotace PV 5Ξ3-93 'ázsv vynálezu: Tkáňový aktivátor plas.T.inoger.u.

;U3cc jene

výroby, řetězec DVA, který je kódem pro tkáňový aktivátor, plasmido ^r s obsahem tohoto Zš 3C 6 DNA, způsob výroby těchto plasmidů a farmsc eutický prostředek s fibrinolytickým

účinkem

Řešen;

Ý'.<á tkáňového aktivátor igenu t-;

který není gíykosylcván a je tvořen určitým rete kyselin, který lze vyjádřit vzorcem I. Pro tento kódem řetězec DNA, který je možno vyjádřit vzore děný aktivátor má při použití k rozpuštění krevn zvláště vhodné vlastnosti a tvoří účinnou složku kého prostředku s fihrinolytickým účinkem, který součástí řešení, stejně jako způsob výroby t-PA, obsahem kódového řetězce pro tuto látku a způsob to plasmidů.

zcem aminořetězec je em II. UveÍCh S Γ S 2 6 Π ΐ Γ>

farmaceuticje rovněž plasmidy s výroby těch-