CZ386392A3 - Alpha interferon - Google Patents

Description

Vynález se týká interferonu alfa, zvláště O-glykosylovaného interferonu alfa, zejména s v/^lstnostmi IFN-alfa2 imunologické nebo- biologické povahy, způsobu výroby této látky a farmaceutických prostředků, které ji obsahují.

Dosavadní stav techniky

Od objevu interferonů. přibližně před 30 lety byly intensivně zkoumány jejich vlastnosti jako mediátoru intercelulární komunikace. Původně bylo označení různých typů těchto látek odvozováno od buněk, v nichž vznikaly, např. leukocytární IFN, IFN z fibroblastů apod. S rostoucím poznáním jejich struktury bylo zavedeno nové názvosloví. V současné době se rozlišují Čtyři typy interferonů, ^nterferon alfa, beta, gamaa a omega, přičemž interferony alfa, beta a omega náleží do 'skupiny 1” interferonů, které jsou si blízké jak svou strukturou, tak svými vlastnostmi.

IFN-gamma se tvoří v lymfocytech, které byly stimulovány antigeny nebo mitotickými látkami. Řetězec aminokyselin, který nemá žádnou homologii s řetězcem látek ze skupiny 1, obsahuje dvě potenciální místa glykosylaee.

IFN alfa, beta a omega jsou synthetizovány celou řadou buněk jako reakce na virové infekce nebo po indukci SNA s dvojitým řetězcem.

V případě IFN-alfa jde vlastně o celou skupinu bílkovin. A6 dosud bylo objeveno alespoň 14 funkčních genů, které jsou kódy pro různé typy IFN-alfa. Tyto bílkoviny jsou si blízce příbuzné a jejich řetězce aminokyselin jsou přibližně z 80 až 90 % homologní. S výjimkou IFN-alfal4 není v žádném z ostatních řetězců aminokyselin IFN-alfa obsaženo místo pro N-glykosylaci (Asn-X-Ser/Thr). Glykosylace tedy není kromě IFN-alfal4 uskutečnitelná, O-glykosylace je však předmětem diskuse ( Labdon a další, Arch. Biochem. Biophys. 232, 422426, 1984).

Velké množství přírodně se vyskytujících bílkovin je po translaci modifikováno, přičemž jednou z nejčastějších modifikací je glykosylace. Glykoproteiny jsou vázané· na membránu nebo rozpustné nebo se nacházejí v intracelulární i extracelulární matrici. Funkce glykosylace je stále ještě předmětem výzkumu. Jisté je prozatím pouze to, že glykany mohou chránit bílkoviny před proteolytickým odbouráním a jsou patrně také zodpovědné v řadě případů za látkovou výměnu mezi buňkami. Dále patrně ovlivňují vazbu bílkovin a přispívají ke stabilitě a struktuře molekuly. Také rozpustnost bílkovin závisí na uhlohydrátových řetězcích.

Je nutno od sebe rozlišovat N- a O-glykosylované bílkoviny. N-^lykany se mohou vázat výlušně na ASN tripletu -ASN-X-SER/THR-, přičemž X může znamenat jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou PRO nebo GLU. Tento požadavek na strukturu bílkoviny je však pouze jeden z mnohých požadavků vzhledem k tomu, že ne všechna potenciální místa glykosylace budou obsazena uhlohydrátem. Pro O-glykany není k disposici žádná přes ně definovaná struktura. Zdá se však, žeQ-glykany jsou synthetizovány převážně v oblastech, bohatých na PRO-, SER- a THR-. Sterická dostupnost těchto struktur patrně vytváří místa, která mají předpoklad pro O-g^ykosylaci. Vliv glykosylace na farmakokinetiku a na imunologické vlastnosti bílkoviny není rovněž možno vyloučit. Byly již podány krátké zprávy (Gibbon a další, Lancet, 335, 434-437, 1990) že 4 ze 16 nemocných, léčených rekombinantním lidským GM-CSF (faktorem, stimulujícím tvorbu kolonií granulocytů-makiofágů), produkovaným v kvasnicích, vytvořilo proti této bílkovině protilátky. Bylo prokázáno, že tyto protilátky reagovaly s epitopy, které jsou v endogenním GM-CSF chráněny O-glykosylací, avšak v rekombinantní bílkovině jsou volně přístupné.

V IFN-alfa2 nebyly až dosud prokázány žádné uhlohyd rátové části, ani nebylo možno izolovat O-glkyosylovaný IFNalfa. Různé prostředky, obsahující IFN-alfa a rekombinantní IFN-alfa2 jsou užívány jako léčiva proti virovým a proti nádorovým onemocněním. Vzhledem k tomu, že IFN-alfa2 je produkován v E. coli a nemůže proto být glykosylován zdá se, že uhlohydrátová část není pro biologickou účinnost in vivo nijak významná. V poslední době jsou však podávány zprávy o nemocných, kteří po dlouhodobém léčení rekombinantním, v E. coli produkovaným IFN-alfa2 vyvinuly proti této látce protilátky (např. Figlin a itri, Semin. Haemoatol. 25, 9 až 15, 1988).

Vynález si proto klade za úkol připravit IFN-alfa2 nového typu.

Podstata/ vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob výroby interferonu alfa2, který spočívá v tom, že se řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro tuto látku uloží do zvláštního vektoru pro expresi, jímž se pak podrobí transfekci buňky mnohobuněčného organismu. f?o kultivaci takto modifikovaných buněk se neočekávaně získají bílkoviny typu IFN-alfa2, které se svou molekulovou hmotností jednoznačně odlišují od známého rekombinantního IFN-alfa2.

Pro výrobu nových interferonů podle vynálezu jsou vhodné kultury buněk mnohobuněčných organismů, zejména kultury buněk obratlovců nebo hmyzích buněk. Jako příklad je možno uvést linie obratlovců, například VERO-buňky, HeLa-buňky, CHO-buňky, buňky WI38, BHK, COS-7, MDCK nebo buňky myšího myelomu. Vektory pro expresi v těchto buňkách obsahují v případě potřeby místo replikace, promotor a popřípadě místo pro úpraι vu RNA sestřihem, polyadenylační místo a řetězec pro ukončení transkripce. Kontrolní funkce takových vektorů pro expresi pocházejí obvykle z virového materiálu. Použitelné promotory je možno nalézt například ve viru polyomu, Adenoviru 2, viru SV40 a s výhodou z cytomegaloviru CMV. Potřebné místo pro replikaci je možno vytvořit přímo při konstrukci vektoru, pak jde například o místo pro replikaci z viru SV40, viru polyomu, adenoviru, VSV nebo PBV nebo je možno využít chromosomálního replikačního mechanismu produkční buňky. Při integraci vektoru do chromosomu produkční buňky je možno zejména využít druhé možnosti.

Při provádění způsobu podle vynálezu se s výhodou užijí dva vektory pro expresi, nově konstruované z částí plasmidů. Tyto vektory pro expresi obsahují podle vynálezu místo pro mnohonásobné klonování pro uložení heterologních řetězců DNA a je možno je pomnožit s výhodou v E. coli ve větším počtu kopií při použití resistence proti ampicilinu. Aby byla umožněna exprese heterologních genů v buňkách savců, obsahují plasmidy pro expresi podle vynálezu s výhodou promotor/zesilovač transkripce z cytomegaloviru (M. Boshart a další, Cell 41,

1985, 512-530). Aby byla umožněna autonomní replikace plasmi^dů pro expresi podle vynálezu na větší počet kopplí a tím i vysoká úroveň přechodné exprese v příslušných buněčných liniích, například v COS-7 nebo v adenovirem transformované buněčné linii 293 (ATCC CRL 1573), užije se počátek replikace z SV40. K získání permanentně transformovaných buněčných linií a k následující amplifikaci kazety pro expresi pomocí methotrexatu slouží modifikovaný minigen křečka (promotor s kódovou oblastí a prvním intronem) pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) jako selekční značení. Aby bylo umožněno zísjání plasmidové DNA s jednoduchým řetězcem po superinfekci transformovaných bakterií f ágem z kvasinek, například R408 neboM13K07 k usnadnění analyzy řetězce a mutegenese plasmidové DNA, obsáhuji plasmidy podle vynalezu s výhodou ijatafrkniiurgu oblast

M13. V případě, že se podle dalšího- výhodného provedení zařadí před místo pro vícenásobné klonování promotor T7, umožní se tvorba transkriptů RNA in vitro.

Podle vynálezu jsou výhodné zejména plasmidy pro expresi pAD-CMV13, pAD-CMV15 a zvláště pAD-CMV19. Příprava těchto plasmidů je uvedena v příkladu 1.

K docílení zlepšené exprese a k' usnadnění řízeného klonování cDNA, která je kódem pro IFN-alfa2 je možno cDNA, která je kódem pro 0FN-alfa2 modifikovat pomocí PCR v 5'-nekódové oblasti tak, že se řetězec této oblasti zamění za řetězec 5^-nekódové oblasti mRNA pro lidský globin beta (Lawn a další, Cell 21, 1980, 647-651). Současně se na obou koncích cDNA vytvoří místa působení restrikčních enzymů, usnadňující řízené klonování. Tato změna vede neočekávaně k podstatnému zvýšení exprese.

Takto modifikovaná cDNA pro IFN-alfa2 se pak uloží do odpovídajícími restrikčními enzymy rozštěpeného plasmidu pro expresi, s výhodou do plasmidu pAD-CMV-19. Takto získaným plasmidem pro expresi IFN-alfa2 se pak provede transfekce vhodných savčích buněk a tyto buňky se pak pěstují ve vhodném živném prostředí. Supernatant kultury se pak čistí velmi šetrně známým způsobem. S výhodou se čištění provádí afinitní chro matografií při použití monoklonálních protilátek proti IFNalfa2. Výhodnými monoklonálními protilátkami jsou EBI-1 nebo EBI-10 nebo jejich ekvivalenty. Příprava těchto vysoce specifických protilátek již byla popsána (Adolf G.R., J. Gen. Virol 68, 1669-1676, 1987, Adolf a další, J. Cell Physiol. suppl. 2, 61-68, 1982). Použité postupy již byly rovněž popsány (Secher a Burke, Nátuře 285, 446-450, 1980, Adolf a další, J. Biol. Chem. 265, 9290-9295, 1990, Adolf a další, Biochem. J., 276, 511-518, 1991. Zvláště výhodný je způsob čištění podle EP 203 382, při němž není zapotřebí rozrušit buňky. K charak6 terizaci rekombinantního, v savčích buňkách vyrobeného IFNalfa2 byla-užita HPLC v reversní fázi. Bylo také analyzováno N-zakoncení a C-zakončení. Ke srovnání byl vždy užit rekombinantní, v E. coli získaný IFN-alfa2. Na základě elektroforetického sledování na SDS-gelu bylo možno prokázat, že rekombinantní IFN-alfa2, získaný ze savčích buněk má vyšší molekulovou hmotnost než tatáž látka, získaná z E. coli. Po zpracování obou rekombinantních interferonů působením hydroxidu sodné-, ho se molekulová hmotnost interferonu, vyrobeného v Savčích buňkách ř^ftžlla na hmotnost IFN-alfa2 z E. coli. Je tedy zřejmé, že rekombinantní IFN-alfa2, k jehož expresi dochází v buňkách savců musí být glykosylován. Při identifikaci glykopep. tidu analýzou řetězce a mapováním peptidu bylo možno prokázat, že na threoninový zbytek v poloze 106 (THR-106) je vázána glykosylová skupina. Při srovnávání těchto výsledků s výsledky, získanými při použití přírodního IFN-alfa2 z leukocytů, stimulovaných viry se ukázalo, že jak místo glykosylace,. tak oligosacharidová část molekuly jsou totožné.

’ Vynález se rovněž týká takového způsobu čištění, ® který neobsahuje žádné stupně, při nichž by mohlo dojít ke ^r změně nebo k odštěpení substituentů na IFN-alfa2. K tomuto čištění se užívá vysoce specifických monoklonálních protilátek, přičemž je nutno dbát toho, aby při celém postupu nebyla hodnota pH v alkalické oblasti vyšší než 8,0.

Přírodní lidský IFN-alfa2 byl izolován z interferonu leukocytů pomocí vysoce specifické monoklonální protilátky.Po provedení dvou po sobě následujících stupních čištění při použití afinitní chromatografie byla čistota výsledné bílkoviny vyšší než 95 %. Při analýze řetězce byl prokázán očekávaný N-terminální řetězec, přičemž CYS jako první aminokyselina byl prokázán pouze nepřímo.

Zatím jsou známy tři varianty IFN-alfa2, které se od sebe liší zbytky aminokyselin v polohách 23 a 34, a to:

¢23 34

IFN-alfa2a,obsshující LYS a HIS (dříve označovaný jako

Le.IFA podle Goeddel a další, NAture 290, 20-26, 1981), dále 23 34

IFN-alfa2b, obsahující ARG a HIS (Streuli a další, Science 209, 1343-1347, 1980) a IFN-alf a2c., obsahující ²³ARG a ³⁴ARG (dříve označovaný IFN-alfa2Arg, Dworkin-Rastl a další, J. Interferon REs. 2. 575-585, 1982, Bodo a Maurer-Fogy, The Biology of The Interferon System 1985, Stewart II, W.E. a Schelle hus H. Hrsg., 59-64, 1986.). U izolovaného interferonu bylo možno v poloze 23 prokázat pouze ARG, což vylučuje přítomnost IFN-alfa2a. Aminokyselinou v poloze 34 byl jednoznačně histidin, takže v případě izolovaného interferonu běželo o variantu IFN-alfa2b. Je však zásadně možno získat také zbývající dvě varianty v závislosti na tom, jaký buněčný materiál se užije jako výchozí materiál. Je známo, že v buňkách Namalwa. se kromě IFN-alfa2b nachází také IFN-alfa2c. V případě interferonu z E. coli, který byl užit jako. srovnávací sloučenina, šlo o variantu IFN-alfa2c.

Při HPLC-analyze přírodního čištěného IFN-alfa2 v reversní fázi se ukázalo, že je možno pozorovat dva vrcholy, které jsou ze sloupce eluovány dříve než rekombinantní IFNalf a2c z E. coli. Také při použití SDS-PAGE bylo možno pozorovat silnou homogenitu přírodního IFN-alfa2. Všechny bílkoviny, které byly obsaženy v přírodním IFN-alfa2 měly podstatně vyšší zjevnou molekulovou hmotnost než rekombinantní IFN-alfa2c z E. coli. Všechny až dosud prokázané typy IFN-alfa, s výjimkou IFN-alfal4 neobsahovaly žádné místo pro N-glykosylaci, tj. -ASN-X-THR/SER-. Je tedy možno N-glykosylaci vyloučit také v případě IFN-alfa2. Pro 0-glykany nejsou známy podobné strukturní podmínky v molekule.. Není proto možno vyloučit, že izolovaný IFN-alfa2 je glykosylován.

Vzhledem k tomu, že 0-glykany mohou být od bílkoviny odštěpeny již za slabě alkalických podmínek, byly příslušné frakce za slabě alkalických podmínek zpracovávány. Tato reakce vedla v obou případech ke snížení molekulové hmotnosti na molekulovou hmotnost rekombinantního IFN-alfa2c z E. coli, což je průkazem O-glykosylace molekuly.

Pokusy s neuraminidázou a O-glykanázou pro vrchol 2 z obr. 14 měly rovněž za následek snížení zjevné molekulové hmotnosti na hmotnost IFN-alfa2c z E. coli, což je rovněž průkazem O-glykosylace. Výsledky tohoto postupného odbourávání glykanu působením neuraminidázy a O-glykanázy ukazují, že heterogenita vrcholu 2 byla podmíněna různým obsahem kyseliny N-acetylneuraminové (NeuAc = kyselina sialová). Tři pásy (obr. 20, skvrna 4) představují disialylovanou, monosialylovanou a nesialylovanou formu přírodního IFN-alfa2 (molekulová hmotnost 21 000, 20 000 a 19 000). Nejlehčí forma IFN-alfa2 mohla být odbourána pouze reakcí s O-glykanázou. Vzhledem k tomu, že O-glykanáza štěpí pouze nesubstituovaný disacharid Gal(Bl-3)GalNAc, je reakce dokladem toho, že kromě obou sialylovaných forem existuje v IFN-alfa2 také asialoforma.

Zjevnou molekulovou hmotnost materiálu z vrcholu 1 enbylo možno snížit enzymatickým způsobem.Inkubace s neuraminidázou nevedla, jak bylo očekáváno, ke snížení zjevné molekulové hmotnosti. To znamená, že disacharidové jádro musí být substituováno jinak než pomocí NeuAc, takže substituent nelze odštěpit O-glykanázou.

í

T

Srovnáním peptidové mapy po rozštěpení přírodního í a rekombinantního IFN-alfa2, k jehož expresi došlo v E. coli působením trypsinu bylo možno identifikovat glykopeptidy z vrcholů 1 a 2. Při analýze řetězců těchto.glykopeptidů bylo prokázáno, že zbytek THR je místem glykosylace.

!

Informace o struktuře oligosacharidů přírodního IFN-alfa2 poskytla kromě enzymatických reakcí také sledování í glykopeptidů pomocí hmotového spektrometru. Interpretace hmotových spekter spolu s výsledky, získanými při použití SDSPAGE ukázaly, že přírodní IFN-alfa2 obsahuje alespoň čtyři různé glykanové struktury: ve vrcholu 2 neutrální disacharid Gal(Bl-3)GalNAc, jehož struktura je vzhledem k vysoké specifičnosti O-glykanázy nanejvýš pravděpodobná, mimoto mono- a disialylovanou variantu; ve vrcholu 1 neutrální oligosacharid, tvořený dvěma hexosovými a dvěma N-acetylhexosaminovými jednotkami. Jako struktura těchto tetrasacharidů padá v úvahu analogicky s již popsanými často se vyskytujícími O-glykany také Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc.

Způsobem podle vynálezu bylo neočekávaně poprvé možno připravit O-glykosylovaný IFN-alfa2 ve vysoce čisté formě. Tento Xnterferon je O-glykosylován na zbytku aminokyseliny

Ί Dfi threoninu v plloze 106 ( THR). Oligosacharidy, které je možno v této poloze získat jsou neutrální disacharid Gal(Bl-3)GalNAc, jeho mono- a disialylovaná varianta a neutrální tetrasacharid Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc.

Tento O-glykosylovaný IFN-alfa2 je možno obdobným způsobem jako rekombinantní IFN-alfa2, k jehož expresi došlo v E. coli zpracovávat na farmaceutické prostředky, které je pak možno použít u všech známých indikací pro použití známé formy IFN-alfa2.

Sloučeniny podle vynálezu je možno použít k léčbě virových infekcí a zhoubných onemocnění ve formě farmaceutických prostředků^, které obsahují účinné množství IFN, popřípadě ve směsi s anorganickým nebo organickým, pevným nebo kapalným, z farmaceutického hlediska přijatelným nosičem.

Výhodné jsou farmaceutické prostředky pro parenterální, například nitrosvalové, podkožní nebo nitrožilní podání u člověka. Jde o isotonické vodné roztoky nebo suspenze,

Obsahující bílkoviny podle vynálezu popřípadě spolu s nosičem a popřípadě ještě s pomocnými látkami, jako jsou stabilizátory, emulgátory, pomocná rozpouštědla, soli pro řízení pH a osmotického tlaku, konservační prostředky a/nebo zesíťující prostředky. Tyto farmaceutické prostředky je možno připravit známým způsobem, například tak, že se smísí bílkoviny podle vynálezu, farmaceutický nosič a pomocné látky, směs se popřípadě lyofilizuje a před použitím opět rozpustí.

Dávkování farmaceutických prostředků závisí na onemocnění, které má být léčeno, na hmotnosti nemocného, jeho věku a tělesném stavu, konečné rozhodnutí bude vždy záviset na ošetřujícím lékaři, který zvolí také způsob podání.

Podle vynálezu je poprvé možno připravit farmaceutický prostředek, obsahující 0-glykosylovaný $nterferon-alfa2, vhodný vzhledem k protivirovým a protineoplastickým vlastnostem IFN-alfa2 pro léčbu virových a nádorových onemocnění.

Vynález bude dále osvětlen v souvislosti s přiložeu nými výkresy.

Popis výkresů

Obr. 1: konstrukce plasmidu pCMV+SV40

Obr. 2: konstrukce plasmidu pAD-CMVIOA

Obr. 3: konstrukce plasmidu pAD-CMV15

Obr. 4: konstrukce plasmidů pAD-CMV13 a pAD-CMV19

Obr. 5: konstrukce plasmidu pro expresi pAD19B-IFN

Obr. 6: HindlII/Xbal-vložení plasmidu pro expresí pAD19B-IFN

Obr. 7: řetězec DNA plasmidu pAD-CMV19

Obr. 8: konstrukce plasmidu pCMV-SV40 í

Obr. 9. Konstrukce plasmidu pSV2gptDHFRMut2

Obr. 10: Konstrukce plasmidu pAD-CMVl a pAD-CMV2

Obr. 11: Řetězec DNA plasmidu pAD-CMVl

Obr. 12: Afinitní chromatografie interferonu z lidských leukocytů pomocí monoklonálních protilátek

Obr. 13: Zkouška ELISA pro lidský IFN-alfa:

(0) Referenční materiál s obsahem rekombinantního lidského IFN-alfa2c (0) Interferon z leukocytů (výchozí materiál) (O) Frakce eluátu A (Δ) Frakce eluátu B

Obr. 14: HPLC v reversní fázi (b) přírodní IFN-alfa2 (а) IFN-alfa2c z E. coli

Obr. 15: Řetězec aminokyselin IFN-alfa2C

Obr. 16: SDS-PAGE přírodního IFN-alfa2 před a po reakci s neuraminidázou a O-glykanázou.

(1) vrchol 1, bez zpracování (2) vrchol 1, po reakci s neuraminidázou (3) vrchol 1, po reakci s neuraminidázou a 0-glukanázou (4) vrchol 2, bez zpracování (5) vrchol 2, po reakci s neuraminidázou (б) vrchol 2, po reakci s neuraminidázou a 0-glukanázou (7) IFN-alfa2C z E. coli

Obr. 17: SDS-PAGE přírodního IFN-alfa2 (vrchol 2 z obr. 14b) (1) před reakcí s O-glykanázou (2) po reakci s O-glykanázou

Obr. 13: SDS-PAGE přírodního IFN-alfa2 (vrcho 1 a 2) a E. coli IFN-alfa2c po inkubaci s 0,1 M NaOH.

(1) E.coli-IFN-alfa2 (3) vrchol 1 (5) vrchol 2:

(2) srovnávací vzorky vrcholu 1 bez zpracování (4) srovnávací vzorky vrcholu 2 bez zpracování

Obr. 19: Srovnávací peptidová mapa E:coli-IFN-alfa2C a přírodního IFN-alfa2.

(1) vrchol 1 z obr. 14b (2) vrchol 2 z obr. 14b m tyto vrcholy pocházejí z neglykosylovyných peptidů, jejichž doba retence byla stejná.

Obr. 20: SDS-PAGE přírodního IFN.alfa2 a IFN-alfa2C z E. coli.

(1) značení molekulové hmotnosti (2) E-coli-IFN-alfa2C (3) přírodní IFN-alfa2, vrchol 1 z obr. i4b (4) přírodní IFN-alfa2, vrchol 2 z obr. 14b Barvení: modř coomassie

Obr. 21: HPLC v reversní fázi pro (a) CH0-IFN-alfa2c (b) E.coli-IFN-alfa2c

Obr. 22: Srovnávací peptidové mapy (a) CHO-IFN-alfa2c, vrchol 1 (b) CHO-IFN-alfa2c, vrchol 2 • (c) E. coli-IFN-alfa2c

Obr. 23: · SDS-elektroforéza· na gelu (SDS-PAGE) pro CH0-IFN-alfa2c Skvrny 1 a 3: značení molekulové hmotnosti (po 1000)

Skvrny 2 až 4: neredukující podmínky

Skvrny 5 až 7: redukující podmínky í

Skvrny 2 a. 5: vrchol 1 z CHO-IFN-alfa2c '

Skvrny 3 a 6: vrchol 2 z CHO-IFN-alfa2c

Skvrny 4 a 7: E. coli-IFN-alfa2c

Horní gel: všechny IFN-skvrny po 4 ^ug

Spodní gel: všechny IFN-skvrny po 1 ^ug

Barvení: modř coomassie i

» i

Obr. 24: SDS-elektroforéza na gelu (SDS-PAGE) pro CHO-IFNalfa2c a pro E.coli-IFN-alfa2C před a po inkubaci s 0,1 M NaOH.

Skvrny 1 a 8: značení molekulové hmotnosti(škála po 1000 jednotkách)

Skvrny 2, 4, 5: nezpracované vzorky

Slvrny 3, 5, 7: vzorky po inkubaci s 0,1 M NaOH

Skvrny 2,3: E. coli-IFN-alfa2c

Skvrny 4,5: vrchol 1 z CHO-IFN-alfa2c Skvrny 5,7: vrchol 2 z CHO-IFN-alfa2C

Všechny IFN-materiály byly nanášeny v množství 1,5/Ug za neredukujících podmínek.

Barvení: modr coomassie

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce plasmidů pro expresi pAD-CMVI3, pAD-CMV15 a pAD-CMV19

Z částí plasmidů pro expresi (pCDM8, Seed a Aruffo, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 1987, 8573-8577, B. Seed, Nátuře 329, 1987, 840-842).Invitrogen Inc., San Diego, CA, pSV2gtpDHFR20, EP 321842 a pBluescript KS- (Short a další, Nucleic Acids Res. 11, 1988, 5521-5540, Stratagene, La Jolla, CA) byly konstruovány nové plasmidy, : obsahující místo. *. pro vícenásobné klonování pro uložení heterologního řetězce DNA a které je možno pomocí resistence proti ampicillinu pomnožit v E. coli za vzniku velkého množství kopií. Intergeno14 vá oblast M13 umožňuje konstrukci DNA plasmidu s jednoduchým řetězcem po superinfekci transformovaných bakterií fágem z kvasinek (např. R408 nebo M13K07), čímž se usnadní analýza řetězce a mutagenese DNA plasmidu. Promotor T7, který je zařazen před místo pro vícenásobné klonování umožňuje vznik transkriptů RNA in vitro. V savčích buňkách dochází k expresi heterologních genů za součinnosti promotoru/zasilovače transkripce z cytomegaloviru (CMV) podle publikace M. Boshart a další, Cell 41, 1985, 521-530. Počátek replikace z SV40 umožňuje v příslušných buněčných liniích (například v buňkách, transformovaných SV40 jako COS-7, v adenovirem transformované buněčné linii 293 (ATCC CRL1573) autonomní replikaci plasmidu pro expresi na vysoký počet kopií a tím i vysokou úroveň přechodné exprese. Pro získání permanentně transformovaných buněčných linií a následnou amplifikaci kazety pro expresi působením methotrexatu slouží modifikovaný minigen křečka (promo.tor s kódovou oblastí a prvním intronem) pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) jako selekční značení.

- *·

Získání částí vektoru a promotoru pomocí polymerázové reakce (PCR)

Plasmid pBluescript KS- se linearizuje pomocí enzymu HindlII a 100 ng DNA se užijr ve 100 ^ul směsi k provedení PCR (Saiki a další, Science 239, 1988, 487-491). Jako reakční prostředí se užije 50 mM KC1, 10 mM tris-HCl o pH 8,3, dále

1,5 mM MgCl2» 0,01 % želatiny, 0,2 mM každého ze čtyř desoxynukleosidtrifosfátů (dATP, dGTP, dCTP a dTTP) a 2,5 jednotek Taq-polymerázy ve 100 ^ul. Jako primery se užijí vždy v množství 50 pmol synthetické oligonukleotidy EBI-1786 <5'-GGAATTCAGCCTGAA- TGGCGAATGGG-3') a oligonukleotid EBI2134 (5'-CACTGAACTCGAGCAGC- TGCGTTGCTGGCGTTTTTCC-3').

Po 5 minutách denaturace při teplotě 94 °C se provádí více než 10 cyklů PCR (podmínky jednoho cyklu: 40 sekund při 94 °C, sekund při 55 °C, 5 minut při 72 °C při použití přístroje í

Perkin Elmer Cetus Therma Cycler). Oligonukleotidy ohraničují íntergenovou oblast M13 a.pořátek replikace (ori) s genem pro beta-laktamázu. Současně se na konci ori vytvoří jediné místo působení enzymů Xhol a PvuII a na druhém konci místo působení enzymu EcoRI. Pak se reakční směs zbaví bílkovin pomocí směsi fenolu a chloroformu a DNA se vysráží ethanolem. Získaná DNA se rozčtěpí enzymy Xhol a EcoRI a po elektroforéze na agarozovém gelu se izoluje fragment o 2,3 kb. Za identických podmí- . nek se 50 ng plasmidů pCDM8, linearisovaného enzymem SacII amplifikuje pomocí PRC při použití nukleotidů EBI-2133 (5'-GGTCACTGTCGACAT-TGATTATTGACTAG-3^#) a oligonukleotidem EBI-1734 (5-GGAATTCCCT-AGGAATACAGCGG-3'). Oligonukleotidy se váží na počátek řetězce promotor/zesilovač transkripce a obsahují místo štěpení enzymem Sáli (EBI-2133) nebo se váží na konci polyadenylačního místa SV40 (EBI-1734). Produkt PCR se rozštěpí enzymy Sáli a EcoRI a izoluje se fragment DNA o velikosti 1,8 kb z agarozového gelu.

Oba rozštěpené PCR-produkty se naváží T4-DNA-ligázou a. užijí k transformaci E- coli HB101. Plasmid požadované struktury (obr. 1) byl označen pCMV+M13.

Počátek replikace SV40 (SV40 ori) se izoluje z plasmidu pSV2gptDHFR20 (EP 321842). K tomuto účelu se uvedený plasaaid rozštěpí působením enzymů HindlII a PvuII a konce DNA se vyplní působením velkého fragmentu DNA-polymerázy z E. coli Klenowův enzym) za přítomnosti všech čtyř desoxynukleosidtrifosfátů. Vzniklý fragment DNA o velikosti 0,36 kb se izoluje z agarozového gelu a naváže na plasmidový vektor pCMV+M13, linearizovaný působením EcoRI. Plasmid, získaný po transformaci E. coli HB101 a obsahující SV40 ori ve stejné orientaci jako gen pro beta-laktamázu a CMV-promotor, bal označen jako PCMV+SV40 (obr.l).

Plasmid pCMV+SV4Q byl rozštěpen enzymy EcoRI a BamHI a zakončení DNA byla vyplněna Klenowovým enzymem. Pak byla

DNA čištěna extrakcí směsí fenolu a chloroformu a srážením ethanolem. Podíl DNA byl cirkularizován působením T4-DNA-1Ígázy a plasmid, který byl získán po transformaci E.coli byl označen pAD-CMVIO (Obr. 2). Zbytek DNA'plasmidu pCMV+SV4O byl defosforylován inkubací s alkalickou fosfatázou a vektor o velikosti 4,4 kb byl izolován z agarozového gelu.

Plasmid pSV2gptDHFR-Mut2 (Příklad 4, obr. 9), obsahu-, jící modifikovaný minigen křečka pro dihydrofolátreduktázu (DHFR), z něhož byla cílenou mutagenezou odstraněna místa působení restrikčních enzymů EcoRI, Pstl, BglII, BamHI a KpnI byl dvakrát rozštěpen enzymy EcoRI a Pstl a zakončení DNA byla vyplněna inkubací 20 minut při teplotě 11 °C s 5 jednotkami T4-DNA-polymerázy ( Reakční prostředí: 50 mM tris-HCl o pH.8,0, 5 mM MgClg, 5 mM dithiothreitolu, 0,1 mM každého ze čtyř desoxynukleotidtrifosfátů, 50 /Ug/ml sérového albuminu skotu). Fragment DNA o velikosti 2,4 kb s obsahem mutovaného DHFR-genu byl izolován z agarozového gelu a navázán na svrchu popsaný PCMV+SV40. Plasmid, získaný po transformaci E. coli a obsahující gen pro DHFR v téže orientaci jako promotor CMV byl označen pAD-CMVIOA (obr. 2).

Při použití plasmidu pro expresi pAD-CMVl (Příklad 4, obr. 10), obsahujícího mezi místem pro vícenásobné klonování a signálem pro polyadenylaci řetězec intronu byla zkonstruována celá řada variant, lišících se od sebe počtem a uložením intronů vzhelem k místu pro vícenásobné klonování (obr. 4).

V pAD-CMV13 (obr. 4) byl odstraněn t-antigen intron SV40 mezi místem pro vícenásobné klonování a polyadenylačním místem. Plasmid pAD-CMV15 (obr. 3) obsahuje synthetický intron mezi CMV-promotorem a místem pro vícenásobné klonování a t-antigen intron SV40 mezi místem pro vícenásobné klonování a polyadenylačním signálem. Plasmid pAD-CMV19 (obr. 4) obsahuje pouze jeden intron mezi CMV-promotorem a místem pro vícenásobné klonování .

i

V případě, že se vychází ze 100 ng plasmidů pAD-CMVl, linearizovaného HindlII a vždy 50 pMol oligonukleotidu EBI2625 (5'-CACTGATCTAGAGATATCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG-3') a EBI-1857 .(5-GGCAAGGGCAGCAGCCGG-3) ve 100 /Ul směsi k provádění PCR, tak jak byla svrchu uvedena a při provádění 10 PCR cyklů (40 sekund při 94 °C, 45 sekund při 55 °C, 90 sekund při 72 °C) dojde k amplifikaci fragmentu DNA o velikosti 1,26 kb. EBI-2625 se váže krátce před polyadenylačním signálem 'SV40 (poloha '1280. v plasmidů pAD-CMVl) a obsahuje navíc místa štěpení restrikčních enzymů Xbal a EcoRV. EBI-1857 se váže na komplementárním řetězci DNA na prvním intronu následujícího minigenu DHFR (poloha 2525 v plasmidů pAD-CMVl). PCR-produkt se izoluje extrakcí směsí fenolu a chloroformu a pak se DNA vysráží ethanolem. DNA se pak dvakrát štěpí Xbal a BglII, z agarozového gelu se izoleje fragment o velikosti 0,32 kb a ten se pak naváže na vektor pAD-CMVl (5,8 kb), rozštěpený týmiž enzymy. Plasmid, který se získá transformací E. coli HB101 (qbr. 4) byl pak označen pAD-CMV13.

Řetězec donoru, upraveného sestřihem, následující za promotorem CMV (M. Boshart a další, Cell 41, 1985, 521-530) byl pak spojen pomocí SOE-PCR (s^plicing by overlapp extension,

S.. N. Ho a další, Gene 77, 1989, 51-59) se setřihem upraveným místem akceptoru v prvním intronu genu pro lidský beta-globin (LAwn a další, Cell 21, 1980, 647-651), pak následuje místo pro vícenásobné klonování z plasmidů pAD-CMVl. Mimoto se amplifikuje 100 ng plasmidů pGJ7 ( G. Jahn a další, J. Virology 49, í

1984, 363-370) s obsahem promotoru a zesilovač transkripce :

:z lidského cytomegaloviru, kmen AD169 (Boshart a další, Cell ;

41, 1985, 521-530) při použití vždy 50 pmolu svrchu uvedeného oligonukleotidu EBI-2133 a oligonukleotidu EBI-2586 (5'-GCAGAGAGAGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCTCTATAGGCGGTACTT-ACCTGACTCTTG-3') ve 100 /Ul PCR-reakční směsi, aplifikace * se provádí ve 30 cyklech (40 sekund při 94 °C, 45 sekund při ?

°C a 90 sekund při 72 °C). Poslední 24 baze EBI-2586 odpo- i í

I í

z vídá řetězci CMV ( v obrácené orientaci) a předcházející baze intronu beta-globinu, přičemž 18 baží odpovídá přesně v obráceném pořadí komplementárnímu řetězci oligonukleotidu EBI2585 a překrývající se řetězce vytvářejí SOE-PCR. Produkty PCR byly rozděleny na agarozovém gelu a byl Izolován fragment DNA o velikosti 0,8 kb (obr.3). 100 ng plasmidu pAD-CMVl bylo stejným způsobem amplifikováno při použití oligonukleotidů EBI-2585 (5-GCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCT-GCTGGTGCTTAACTGGCTTATCG-3’) a EBI-2112 (5 -GGTGCTTAACTGGCTTATCG-3') pomocí PCR a za agarozového gelu byl izolován fragment o velikosti 0,2 kb. Oligonukleotid EBI2585 obsahuje posledních 45 baží beta-globinu (jeho intronu) a pět následujících baží, jakož i 17 baží na 3^-zakončení, které jsou přesně schopny hybridizace na polohy 611-627 plasmidu pAD-CMVl. Oligonukleotid EBI-2112 se báze na komplementární řetězec DNA v polohách 743 až 760 v řetězci plasmidu pAD-CMVl. Jedna desetina izolovaného fragmentu DNA o velikosti 0,8 kb a 1/30 fragmentu DNA o 0,2 kb byly smíseny v dalších 100 /Ul prostředí k provádění PCR (SOE-PCR) a amplifikovány

- při použití vždy 50 pMol oligonukleotidů EBI 2133 a EBI 2112 '^s při 30 PCR-cyklech (40 sekund při 94 °C, 45 sekund při 45 °C a 2 minuty při 72 °C). Reakce byla ukončena extrakcí směsí fenolu a chloroformu a DNA byla vysrážena ethanolem. 5*-zakončení produktu PCR bylo fosforylováno působením T4-polynukleotidkinázy (reakční pufr: 70 mM tris-HCl o pH 7,6, 10 mM MgClg, 5 mM dithiothreitolu, 1 mM ATP) a nakonec byl materiál rozštěpen enzymem Xbal. DNA byla podrobena dělení na agarozovém gelu a byl izolován fragment o velikosti 0,98 kb. Plasmid pAD-CMVIO byl dvakrát rozštěpen působením enzymů PvuII a Xbal a byl izolován podíl vektoru bez promotoru CMV z agarozového gelu. Tento plasmidový vektor byl navázán na fragment DNA o 0,97 kb s promotorem CMV a zesilovače transkripce s intronem a místej pro vícenásobné klonování a celek se užije k transformaci E. coli HB10I. Za získaných transformantů se získá plasmidová DNA a tato nová DNA s obsahem oligonukleotidů

ΕΒΙ-2112, ΕΒΙ-2586 a ΕΒΟ 1773 (5'-GGTCGACATTGATTATTGACTAG-3') se analyzuje didesoxyštěpením řetězce ( F. sanger a další,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 1977, 5463-5467) pomocí modifiko vane T4 DNA-polymerázy (S. Tábor a C.C.Richardson, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 34, 4767-4771; Sequenase, United Sates Biochemical Corp.). Plasmid s očekávaným řetězcem ( Obr. 3) byl označen pAD-CMV15.

Plasmid pAD-CMVIOA byl dvakrát rozštěpen působením enzymů Spěl a BglII a byl izolován podíl vektoru bez promotoru CMV z agarozového gelu. Plasmid pAD-AMV15 byl dvakrát rozštěpen působením enzymů Spěl a HindlII a fragment o 0,8 kb, obsahující promotor CMV a synthetický intron byl izolován. Plasmid pAD-CMV13 byl dvakrát rozštěpen působením enzymů HindlII a BglII a byl izolován fragment o velikosti 0,36 kb, obsahující místo pro vícenásobné klonování, polyadenylační signál z počáteční části řetězce SV40 a část oblasti promotoru z DHFR křečka. Tyto tři fragmenty DNA byly navázány působením T4 DNA-ligázy a užity k transformaci E. coli HB101. Z vzniklých transformantů byla získána plasmidová DNA, která byly analyzována štěpením různými restrikčními enzymy. Plasmid s požadovanou strukturou byl pak označen pAD-CMV19 (obr. 4 a 5).

Příklad 2

Příprava modifikované cDNA pro huIFN-alfa2c

Kódová cDNA klon 1F7 pro lidský IFN-alfa2c (E.Dworkin Rastl a další, J. Interferon Res. 2, 1982, 575-585, E-DworkinRastl a další, Gene 21, 1983, 237-248) byla modifikována pomocí PCR v 5-nekódové oblasti tak, že místo řetězce 5^-nekódové oblasti byl zařazen 5-ínekódový řetězec mRNA pro lidský beta-globin (Lawn a další, Cell 21, 1980, 647-651). V důsledků této změny v 5'-nekódové oblasti dochází k podstatnému zvýšení exprese, patrně v důsledku účinnější iniciace translace. Současně dochází na obou koncích cDNA k zavedení míst působení restrikčních enzymů, což usnadňuje následné řízené klonování cDNA v plasmidech pro expresi.

100 ng plasmidu 1F7, linearizovaného působením enzymu EcoRI se amplifikuje při použití 50 pmol oligonukleotídu EBI2747 (5'-CTTCAGAAGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCT-CAAACAGACAGGATGGCCTTGACCTTTGCTTTAC-3') a EBI-2744 (5'-GACTTCAGTCTAGAGAACCAGTTTTCATTCCTTACTTC-3') ve 100 /Ul prostředí k provádění PCR při použití 20 cyklů (40 sekund při 94 °C, 45 sekund při 55 °C a 90 sekund při 72 °C). EBI2747 obsahuje za místem štěpení enzymem HindlII 5^-nekódovou oblast mRNA pro lidský beta-globin a za ní prvních 22 baží řetězce, , který je· kódem pro signální peptid lidského IFNalfa2c (huIFN.-alf a2c) , start-kodon je podtržen. EBI-2744 se váže na komplementární řetězec na konci řetězce, který je kódem pro huIFN-alfa2c (stopkodon je podtržen) a obsahuje místo štěpení enzymem Xbal. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a DNA se vysráží ethynolem. Produkt PCR se rozštěpí na koncích enzymy HindlII a Xbal a z agarozového gelu se izoluje fragment o velikosti 0m64 kb (obr. 6 a 7.

Plasmid pAD-CMV19 se rovněž dvojnásobně štěpí enzymy HindlII a Xbal a pak se naváže na fragment cDNA. Kolonie, získané po transformaci E. coli HB101 se pěstují pro přípravu plasmidové

DNA. Jeden ze získaných plasmidů byl úplně analyzován za účelem zjištění uložené oblasti HindlII-Xbal. S výjimkou jediné zaměněné baze (CTG za TTG) v 8. kodonu signálního peptidu (což však nevedlo k žádné změně v kódované aminokyselině Leu) byl ;

získán očekávaný řetězec. Plasmid pro expresi secernovaného >

a O-glykosyiovaného lidského IFN-alfa2c byl označen jako '

PAD19B-IFN (Obr. 6). J ·:

Popis částí řetězce plasmidu pAD-CMV19 (obr. 5) i i

Baze ⁸ až 21 místo vazby pro oligonukleotid EBI 2133 ;

r i

f ?

* i

í

Baze až 590 Zesilovač transkripce a promotor cytomegaloviru

722 až 740 Řetězec intronu cytomegaloviru (donor sestřiženého
	řetězce)
741-805	Řetězec intronu lidského beta-globinu (akceptor sestřiženého řetězce)
<836-853	Promotor T7 .
862-922	místo pro vícenásobné klonování
923-1055	polyadenylační místa SV40
1056-1953	promotor a S^-nekódová oblast genu DHFR křečka
1954-2039	DHFR exon 1
2040-2333	DHFR intron 1
2151-2168	Místo vazby EBI-1857
2344-2821-	DHFR exony 2 až 6 kódové oblasti
2822-3474	DHFR 3*-nekódová oblast
3475-3812	Počátek replikace SV40 (SV40ori)
3813-6055	podíl plasmidu pBluescript
3813-4291	Intergenová oblast M13 (M13 ori)
4423-5283	beta-laktamáza, kódová oblast
6038-6062	místo vazby EBI-2134
Příklad 3
Přechodná 'buňkách	exprese huIFNalfa2c ve vyšších eukaryotických

Přibližně 10⁵ buněk (293, lidské buňky embryonálních ledvi, transformované částí genomu adenoviru AD5; F.L. Graham a další, J. Gen. Virol. 36, 1977, 59-77, ATCC CRL1573) na jednu Petriho misku s průměrem 80 mm se 24 hodin před

-22transfekcí inkubuje v DJilbeccově prostředí MEM/živná směs F12 1:1 s 15 mM Hepes, Gibco s 10 % teplem inaktivovaného fetálního telecího séra při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého. Buňky byly 3 hodiny před transfekcí přeneseny do čerstvého prostředí a dále inkubovány při teplotě 37 °C. 10 yUg plasmidové DNA (čištěné dvojím odstředěním při použití gradientu CsCl) plasmidu pAD19B-IFN se rozpustí v 0,5 ml 250 mM CaCl₂ a pak se po kapkách přidá k 0,5 ml 2x HBS (16,36 g/1 NaCl, 11,9 g/1 Hepes, 0,40 g/1 NagPO^ p pH 7,12). Vzniklá sraženina se přidá do Petriho misky a buňky se inkubují 4 hodiny při teplotě 37 °C. Pak se buňky promyjí PBS, na 30 sekund se přidá 15 % glycerol! v lx HBS (šok), pak se buňky ještě jednou promyjí PBS a inkubují se v 10 ml čerstvého prostředí s 10 % telecího séra při teplotě 37 °C. PO 72 hoidnách se supernatant oddělí a stanoví se v něm vyloučený IFN.

Příklad 4

Konstrukce, plasmidu pAD-CMVL a pAD-cmv2 pro eexpresi

Z částí plasmidu pro expresi pCDM8 (Seed a Aruffo,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 1987, 8573-8577, Seed, Nátuře 329, 1987, 840-842, Invitrogen lne. , San Diego, CA), plasmidu pSV2gptDHFR2O (EP Al 0321 842) a plasmidu Bluescript SK+ (Short a další, Nucleic Acids Res., 11 , 5521-5540, Stratagene, La Jolla, CA) byl zkonstruován nový plasmid, obsahující místo pro vícenásobné klonování pro řízené uložení heterolog- í ního řetězce DNA, tento plasmid je možno pomnožit v E. coli í s resistencí proti ampicillinu s vysokým počtem kopií. Inter- 1 genová oblast M13 umožňuje přípravu plasmidové DNA s jednoduchým řetězcem superinfekcí transformovaných bakterií pomocným · fágem (například R408 nebo M13K07) k usnadnění analyzy řetězce \ & m_jjtagenese plasmidové DNA. Promotor T7, který je uložen před místem pro vícenásobné klonování, umožňuje přípravu trans- | í

I kriptů RNA in vitro. V buňkách savců probíhá exprese heterologních genů za pomoci promotoru a zesilovače transkripce z cytomegaloviru (CMV) (Boshart a další, Cell 41, 1985, 521-530). Počátek replikace SV40 umožňuje ve vhodných buněčných liniích (například SV40 transformované buňky jako C0S-7, adenovirem transformované buněčné linie 293 (ATCC CRL1573) zvýšit autonomní replikaci plasmidu pro expresi do vysokého počtu kopií a tak dosáhnout vysoké úrovně přechodné exprese. Pro přípravu permanentně transformovaných buněčných linií a následnou amplifikaci kazety proexpresi působením methotrexatu slouří módi fikovaný minigen křečka (promotor s kódovou oblastí a prvním intronem) pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) jako značení pro příští selekci.

a) Příprava částí vektoru a promotoru pomocí PCR

Plasmid Bluescript SK+ sé linearizuje působením enzymu HindlII a 5 ng DNA se užije ve 100 ^ul směsi k provádění PCR (Reakční pufr: 50 mM KOI, 10 mM Trs-Cl o pH 8,3, 1,5 mM MgClg, 0,01 % želatiny, 0,2 mM všech čtyř desoxynukleotidtrifosfátů (aATP, dGTP, dCTP a dTTP), 2,5 jednotky Taq-polymerázy na 100 /Ul). Jako primer se užije vždy 50 pmolu synthetického oligonukleotidu EBI-1786 (5'-GGAATTCAGCCTGAATGGCGAATGGG-3'), který se váže bezprostředně vně M13-ori-oblasti v plasmidu Bluescript, poloha 475, nezávisle na orientaci M13, a EBI-1729 ( 5‘-CCTCCGAGCGTTGCTGGCGTTTTTCC-3'), který se váže na Bluescript v poloze 1195 před ori a odpovídá počátku řetězce Bluescript v pCDM8, 6 baží 5' je místem pro Xhol). Po denaturaci 5 minut při 94 °C se provádí PCR ve 20 cyklech (40 sec při 94 °C, 45 sec při 55 °C a 5 minut při 72 °C, Perkin Elmers Cetus Thermal Cycler) . Oligonukleotidy ohraničují intergenovou obla.s&.... M13, tj. počátek replikace (ori) s mezilehlým genem pro betalaktamázu. SoučaSně vzniká na konci počátku replikace místo Xhol a na druhém konci místo působení enzymu EcoRI. Reakční směs se zbaví bílkovin extrakcí směsí fenolu a chloroformu a

DNA se vysráží ethanolem. Získaná DNA se rozštěpí enzymy Xhol a EcoRI a po elektroforéze na agarozovém gelu se izoluje fragment o velikosti 2,3 kb.

ng plasmidů pCMD8, linearizovaného enzymem SacII se amplifikuje při použití oligonukleotidu EBI-1733 (5'-GGTCGACATTGATTATTGACTAG-3', váže se na oblast promotoru CMV v poloze 1542 plasmidů pCDM8, což odpovídá poloze 1 v pAD-CMV, místo Sáli pro klonování) a oligonukleotidu EBI-1734 (5 -GGAATTCCCTAGGAATACAGCGG-3',váže se na počátek polyomu oblasti 3 SV40 polyA v poloze 3590 plasmidů pCDM8) při použití PCR za identických podmínek, které byly popsány svrchu pro plasmid Bluescript SK+. Oligonukleotidy se váží na počátek CMV-promotoru/zesilovaČe transkripce a. obashují místo působení Sáli (EBI 1733) nebo se váží na konci polyadenylačního místa SV40 a obsahují místo působení EcoRI (EBI-1734). Produkt PCR byl rozštěpen enzymy Sáli a EcoRI a na agarozovém gelu byl izolován fragment σ velikosti 1,8 kb.

Oba produkty PCR byly navázány působením T4 DNAligázy a získaný produkt, byl užit k transformaci E. coli HB101 a standardními postupy byla amplifikována DNA plsamidu a izolována. Získaný plasmid byl označen pCMV-M13 (Obr. 8).

Z plasmidů pSV2gptDHFR2O (EP-A1 0321842) byl izolován počátek replikace SV40 (oriSV40). K tomuto účelu byl uvedený plasmid rosštěpen enzymy HindlII a PvuII a zakončení DNA byla vyplněna působením velkého fragmentu DNA-polymerázy E. coli (Klenowův enzym) za přítomnosti všech čtař desoxynukleotidtrifosfátů. Získaný fragment DNA o velikosti 0,36 kb byl izolován z agarozového gelu a bal navázán na plasmid pCMV-M13, linearizovaný EcoRI. Plasmid, který byl získán po transformaci E. coli HB101 a obsahující SV40 ori ve stejné orientaci jako gen pro beta-laktamázu a promotor CMV byl označen pCMV-SV40. Konstrukce tohoto plasmidů je znázorněna na obr. 8.

b) Mutagenese genu DHFR

Pro přípravu plasmidů pro expresi s místem pro vícenásobné klonování byla z minigenu DHFR řízenou, mutagenezou odstraněna dvě místa a delecí tři místa působení restrikčních enzymů.Z plasmidů pSV2gptDHFR2O byl fragment BGLII o 1,7 kb s obsahem celé kódové oblasti genu DHFR křečka klonován v místě půsopbení BglII plasmidů p(JC219 (iBI) a byl získán plasmid pUCDHFR. Plasmidem pUCDHFR transformované buňky E. coli JM1O9 {Stratagene) byly infikovány přibližně 40-násobným přebytkem pomocného fágu R408 (stratagene) a směs byla 15 hodin protřepávána při 37 °C v prostředí LB. Ze supernatantu bakterií byla izolována DNA plasmidů s jednoduchým řetězcem.

Řízená mutagenese byla prováděna ve dvou po sobě následujících stupních, byl použit systém RPN1523 pro mutagenesu in vitro (Amersham). Místo působení enzymu EcoRI na počátku exonu 2 bylo rozrušeno výměnou jedné baze v GAATTC za vzniku GAGTTC. Tato výměna baží nevedla k žádné změně v kódovaném řetězci am inokyselin a mimoto odpovídá řetězci nukleotidů v přírodním myším genu DHFR ( McGrogan a další, J. Biol. Chem.

.260, 1985, 2307-2314, Mitchell a další, Mol. Cell. Biol. 6,

1986, 425-440). Pro mutagenezi byl použit ( v orientaci proti směru) oligonukleotid EBI-1751 (5'-GTACTTGAACTCGTTCCTG-3').

Plasmid s požadovanou mutací byl, jak již bylo svrchu popsáno, připraven ve formě DNA s jednoduchým řetězcema místo působení ;

enzymu Pstl v prvním intronu bylo odstraněno mutagenezi při S použití oligonukleotidu EBI-1857 (5'-GGCAAGGGCAGCAGCCGG-3') l (

v orientaci proti směru, vzniklá změna byla provedena z řetěz- ’ ce CTGCAG na CTGCTG. Mutace byly ověřeny analýzou řetězce a získaný plasmid byl označen pUCDHFR-Mut2. -Z plasmidů pUCDHFRJttut se izoluje frsgment o velikosti 1,7 kb BglII a naváže se na plasmid pSV2gptDHFR2O, rozštěpený enzymy BglII a BamHI. ;

iPo transformaci E. coli, apmlifikaci a izolaci DNA se získá j plasmid s požadovanými vlastnostmi,který byl označen jako { $

í

I pSV2gprDHRF-Mut2. Po rozštěpení BamHI byl ze 3-nekódové oblasti genu DHFR odstraněn za místem BglII uložený fragment

DNA o velikosti 0,12 kb, který ještě obsahuje místo štěpení enzymem KpnI. Spojením působením BglII a BamHI vzniklých zakončení DNA dojde také k odstranění míst působení pro oba uvedené enzymy.

Plasmid pCMV-SV40 byl rozštěpen enzymy EcoRI a

BamHI a zakončení DNA byla vyplněna Klenowovým· enzymem. Pak byla DNA čištěna extrakcí směsí fenolu a chloroformu a srážením ethanolem. Nakonec byla DNA podrobena defosforyláci inkubací s alkalickou fosfatázou a DNA vektoru o velikosti 4,4 kb byla izolována z agarozového gelu.

Plasmid pSV2gptDHFR-Mut2 (obr. 9) byl rozštěpen enzymy EcoRI a Pstl a zakončení DNA byla vplněna 20-minutovou inkubací při 11 °C s 5 jednotkami T4 DNA-polymerázy ( 50 mM tris-HCL o pH 8,0, 5 mM MgClg, 5 mM dithiothreitolu, 0,1 mM každého ze čtyř desoxynukleotidtrifosfátů, 50 /Ug/ml sérového albuminu skotu). Fragment o velikosti 2,4 kb s oé^ahem mutovaného DHFR-genu byl izolován z agarozového gelu a navázán na svrchu připravený plasmid pCMV-SV40. Transformací E. coli získaný plasmid, obsahující gen DHFR v téže orientaci jako promotor CMV byl označen pCMV-SV40DHFR. V posledním stupni byl fragment o 0,4 kb, následující za CMV-promotorem, který pocházel ještě z výchozího plasmidu pCDM8, výměně za místo pro vícenásobné klonování. K tomuto účelu byl plasmid pCMV- ;

SV40DHFR rozštěpen enzymy HindlII a Xbal a vektorová část byla í izolována z agarozového gelu. Místo pro vícenásobné klonování, i vytvořené z obou oligonukleotidů, a to EBI-1823 (5'-AGCTTCTGCAGGTCGACATCGATGGATCCGGTACCTCGAGCGGCCGCGAATTCT-3') , í 5' -CTÁGAGAATTCGCGGCCGCTCGAGGTACCGGATCCATCGATGTCGACCTGCAGA-3') , j

EBI-1829, obsahuje včetně zakončení, kompatibilních pro klono- ’ vání v místě HindlII-Xbal také místa působení Pstl, Sáli, Clal, »

BamHI, KpnI, Xhol, Notl a EcoRI. { <· I í

Vždy 1 /Ug obou oligonukleotidů bylo inkubováno ve 20 /Ul reakčního pufru (70 mM tris-Cl o pH 7,6, 10 mM MgCl^, 5 mM dithiothreitolu, 0,1 mM ATP) s 5 jdenotkami T4-polynukleotidkinázy 1 hodinu při teplotě 37 °C k fosforylaci 5'-zakončení . Reakce byla zastavena 10-minutovým zahřátím na 70 °C a komplementární oligonukleotidy byly navzájem hybridizovány tak, že vzorek byl inkubován dalších 10 minut při teplotě 56 °C a pak byl pomalu zchlazen na teplotu místnosti. 4 ^ul hybridizovaných oligonukleotidů (100 ng) bylo navázáno na 100 ng plasmidového vektoru a užito k transformaci E. coli HB101. Plasmid, který bylo možno linearizovat enzymy místa pro vícenásobné klonování ( s výjimkou Notl) byl označen pAD-CMVl.

Z velkého množství zkoumaných klonů nebylo možno identifikovat ani jediný, který by bylo možno rozštěpí enzymem Notl. Při analyze řetězce bylo vždy možno prokázat deleci některých baží v řetězci, v němž se nachází místo působení enzymu Notl. Stejným způsobem byl při použití páru oligonukleotidů EBI-1820 (5'-AGCTCTAGAGAATTCGCGGCCGCTCGAGGTACCGGATCCATCGATGTCGACCTGCAGAAGCTTG-3') a EBI-1821 (5'-CTAGCAAGCTTCTGCAGGTCGACATCGATGGATCCGGTACCTCGAGCGGCCGCGAATTCTCTAG-3”) vytvořen plasmid pro expresi pAD-CMV2, obsahující místa působení restrikčních enzymů v místě pro vícenásobné klonování v obráceném pořadí. Tím byl získám plasmid pA_D-CMV2, který je možno linearizovat všemi restrikčními enzymy, včetně Notl.

Řetězec nukleotidů plasmidu pAD-CMVl o velikosti 6414 bp (obr. 10) je podrobněji rozveden na obr. 11.

Jednotlivé úseky tohoto plasmidu ( uvedené na základě číslování jednotlivých baží) odpovídají následujícímu sledu řetězců:

i

Baze:

1-21	EBI-1733, počátek zesilovače transkripce a promotoru z CDM8
632-649	promotor T7
658-713	místo pro vícenásobné klonování (HindlII až Xbal z EBI-1823, EBI-1829)
714-1412	Intron SV40 a polyadenylační místo z CDM8
1413-2310	5 -nekódová oblast a promotor genu DHFR křečka (z plasmidů pSV2gptDHFR20)
2311-2396	DHFR křečka: exon 1
2516	A - T : mutací rozrušené místo působení enzymu Pstl v DHFR intronu 1
2701-3178	DHFR exony 2 až 6 (kódová oblast)
2707	A - G : mutací rozrušené místo enzymu EcoRI
3272-3273	delece mezi místy působení BglII a BamHI ve 3-nekódové oblasti DHFR
3831	konec genu DHFR ( z plasmidů pSV2gptDHFR20)
3832-4169	SV40 ori (z pSV2gptDHFR20)
4170-4648	M13 ori (z pBluescript Sk+)
4780-5640	beta-laktamáza (kódová oblast)
6395-6414	EBI-1729, konec řetězce vektoru pBluescript Příprava plasmidů pAD-CMVl a pAD-CMV2 je znázorněna

na obr. 10

Příklad 5

Vývoj rekombinantních buněčných linii CHO (ovariální buňky čínského křečka), produkujících glyk-osylovaný lidský interferon-alfa2

a) Transfekce buněk CHO a selekce stabilně přeměněných buněčných linií

Rodičovské buněčné linie, CHO-DXB11 a CH0-DG44 (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220, 1980, Som. Cell. Molec. Genet. 12, 555-666, 1986) byly pěstovány v prostředí RPMI 1640 (Roswell Park Memoriál Institute), doplněném 10 % fetálního telecího séra, hypoxanthinem (10 /Umol), thymidinem (16 /umol), sodnou solí penicillinu G (100 jednotek/ml) a streptomycinem (50 jednotek/ml). Dva dny před transfekcí byly buňky přeneseny do lahví s plochou 25 cm , v době transfekce vytvářely buňky téměř souvislou vrstvu.

Transfekce byla prováděna následujícím způcobem:

mikrolitrů roztoku plasmidů pAD19B-IFN (1 /Ug/ml) bylo zředěno 125 ^ul chloridu vápenatého a 855 /Ul sterilní deionizované vody. Tyto roztoky byly po kapkách přidány k 1 ml 2 x HSB ( 1 x HSB obsahuje v 1 litru roztoku následující složky 8,18 g chloridu sodného, 5,94 g Hepes, 0,2 g hydrogenfosforečnanu sodného, pH 7,1). Živné prostředí buněk CHO bylo odstraněno a do každé láhve bylo přidáno 0,25 ml suspenze. Pak byly kultury inkubovány 4 hodiny při teplotě 37 °C. Pak byla suspenze odstraněna, buňky byly od povrchu láhve uvolněny roztokem trypsinu a EDTA a uvedeny do suspenze v prostředí pro selekci (selekční prostředí sestávalo z minimálního základního prostředí, alfa-modifikace bez ribonukleotidů a dsoxyribonukleotidů a bylo doplněno 10 % dialyzovaného fetálního telecího séra, -sodnou solí penicillinu G - 100 jednotek/ml, streptomy30 činem 50 jednotek/ml a amphotericinem B 2,5 /Ug/ml, bylo užito vždy 40 ml na jednu láhev). Buněčná suspenze pak byla přenesena do vyhloubení dvou mikrotitračních ploten pro buněčné kultury (96 vyhloubení v jedné plotně, 0,2 ml na jedno vyhloubení) a buňky byly inkubovány dva týdny při 37 °C. Uvedené prostředí pro selekci bylo použito, ovšem bez amphotericinu B, také ve všech dalších pokusech.

Buněčné kultury byly zkoumány na buněčný růst visuálně. Živné prostředí z vyhloubení, v nichž bylo možno pozorovat růst, bylo zkoumáno na obsah IFN-alfa2 imunologickou enzymatickou zkouškou, při nichž byko použito dvou monoklonálních protilátek, proti IFN-alfa2 (Biochem J. 276, 511-518, 1991) Tato zkouška byla po jednom týdnu znovu opakovaná s čerstvým supernatantem. buňky z positivních kultur byly uvolněny od povrchu roztokem trypsinu a EDTA a přeneseny do ploten pro pěstování buněk s 24 vyhloubeními. Kultury s dobrým buněčným růstem pak byly opakovaně zkoušeny na produkci IFN. Koncentrace IFN-alfa2 v supernatantech byly typicky v oblasti mezi 2 000 až více než 10 000 jednotek/ml ( 1 ng bílkoviny IFN.alfa2 odpovídá 230 jednotkám).

b) Amplifikace genu pro IFN-alfa2 pomocí selekce při použití methotrexatu

Klony po transfekci obou rodičovských buněčných linií, CH0-DXB11 a CH0-DG44, které ve větším počtu zkoušek vykazovaly vysoké koncentrace IFN byly vybrány pro příští amplifikaci. Mimoto bylo spojeno vždy 3 až 5 dalších klonů. Tyto kultury pak byly udržovány v láhvích s plochou 25 cnY v selekčním živném prostředí ( bez amphotericinu B), k němuž byl přidán methotrexat v koncentraci 20 nM nebo 50 nM. Ke každé kultuře bylo jednou týdně vyměněno čerstvé živné prostředí. Přežívající klony byly pozorovány po dobu dvou ^ž tří týdnů. Jakmile buňky pokryly přibližně 50 % růstové plochy v láhvi, byly supernatanty v jednotlivých láhvích . opět zkou mány na obsah IFN-alfa2. Pak byly buňky od plotny uvolněny, zředěny a znovu přeneseny do nových láhví. Nyní byla koncentrace methotrexatu zvýšena ě až 5krát, například z 20 nM na '50 a 100 nM nebo z 50 nM na 100 a 200 nM. Po větším počtu svrchu popsaných selekčních cyklů v přítomnosti zvyšujícího se množství methotrexatu za současné selekce odolných kultur, stále vylučujících IFN bylo nakonec možno získat buněčné linie odolné proti methotrexatu až do koncentrace 5 000 nM, tyto linie současně vylučovaly relativně velká mnosžtví IFN-alfa2.

V následující tabulce I je shrnuto stoupání produktivnosti na příkladu buněčné linie CH0-DXBll-IFN-alfa2c-3/2D4.

V následující tabulce II jsou pak shrnuty výsledky, které byly získány při použití jiné buněčné linie, CH0-ĎG44IFN-alfa2c-poolS.

Koncentrace methotrexatu IFN-alfa2c v supernatantu kultur

o	0	o	o	o	o	o	o	o
o	0	o	o	o	o	o	o	o
o	0	o	o	o	o	o	o	o
v	σι	m	o	o	o	o	o	o
rM	00	OJ	04	0)	o	o	un	CO
		rM		rM	co	01	co	oi

lili

I I

o	o	0	o	o	o	o	o	O
o	o	0	o	o	o	o	o	o
o	o	0	o	o	o	o	o	o
CO	OJ	01	CO	o	o	o	o	o
	<-4	OJ	01	rM	v	m	o	rM
				rM	rM	CO	OJ	<\J

o o	0	o	o	O	o	o	o
OJ	cn	o	o	O	o	o	o
		rM	OJ	m	o	o	o
					<—t	OJ	un

ς, +J

Γί óá

	c	O	O	o	O	O	o	o	o
		3		O	O	o	o	o	o	o	o
		A		O	o	o	o	o	o	o	o
		3	Z-X
		3	r4	co	CM	oo	o	o	o	o	o
		..ί-	ε	co		<35	CM	CM	o	1X5	CM
	A	α»	'v.		rH		CM	CM	1X5	co	co
	A	0.	>»·
		3	JC	1	1	1	1	I	1	1	1
		W	A
			0	o	o	O	o	o	o	o	o
		>	3	o	o	o	o	o	o	o	o
1			Ό	o	o	o	o	o	o	o	o
		O	3
	3	CM	»-)	<35	00	<35	r-l	o	o	o	o
co		3		CM	1X5	CO	1>	<35		o	<35
co	óó	A	-						«—i	CM	iM

I r-l 3

3	2 &
A	A
3
A

A

X <υ

¢.

-Ρ

O

A

A <υ

í.

A <u o

O

-X

z-X	o	O	O	o.	O	o	o	o
2	CM	1X5	O	o	O	o	o	o
3			ιΉ	CM	1.0	o	o	o
xz						rH	CM	1X5

Ze supernatantu rekombinantních buněk CHO bylo možno čistit IFN-alfa2 pomocí afinitní chromatografie s použitím monoklonálních protilátek ( například protilátky EBI-1 nebo EBI-1O) známým způsobem (Nátuře 285, 446, 1980, J. Biol. Chem. 265, 9290-9295, 1990, Biochem. J. 276, 511-518, 1991).

K čištění bílkovin podle vynálezu je zvláště vhodný postup, který byl popsánv EP 203 382.

Příklad 6

Charkterizace rekombinantního, glykosylovaného lidského IFN-alfa2c z buněk ovaria čínského křečka -CHO

a) HPLC v reversní fázi (RP-HPLC)

Rekombinantní glykosylovaný IFN-alfa2c z buněk CHO, čištěný afinitní chromatografií byl pomocí RP-HPLC srovnáván 3 rekomblnantním IFN-alfa2c z E. coli, který není glykosylován.

'» Analytická metoda byla popsána v publikaci Adolf a další, J. Biol. Chem. 265, 9290-9295, 1990. Glykosylovaný CHO-IFN-alfa2C '* (horní část obr. 21) je tvořen dvěma hlavními vrcholy (1 a 2) a dvěma menšími vrcholy pro IFN (3 a 4). Neglykosylovaný IFNalfa2c z E. coli (spodní část obr. 21) je naproti tomu tvořen jediným hlavním vrcholem (disulfidové můstky) a jedním menším vrcholem, který je pravděpodobně tvořen formou s utajenými disulfidovými můstky. Ze srovnání doby retence je zřejmé, že oba hlavní vrcholy CHO-IFN-alfa2c se eluují poněkud dříve než hlavní vrchol E. coli-IFN-alfa2c. Podkladem pro tuto sníženou hydrofobnost je přítomnost oligosacharidů v CHO-IFN-alfa2c.

Dva menší vrcholy v CHO-IFN-alfa2c mají přibližně stejnou dobu retence jako hlavní vrchol E. coli-IFN-alfa2c a s největší pravděpodobností jsou tvořeny menším neglykosylovaným podílem CHO-IFN-alfa2C.

i b

i i

i .*.· ,i->iieStíAfcSlibilíSAííSásiAřtei;

b) Analýza N-terminální části řetězce

Oba hlavní vrcholy pro CH0-IFN-alfa2c byly z RP-HPLC izolovány a byl analyzován jejich řetězec. Podmínky při analýze byly popsány v publikaci Adolf a další, J. Biol. Chem. 265, 9290-9295, 1990. Prvních 15 aminokyselin bylo možno identifikovat v souladu s řětezcem příslušné cDNA. Na N-terminálním zakončení nebylo možno pozorovat žádnou heterogenitu.

c) Analýza C-terminální části řetězce

Hlavní vrchol E. coli-IFN-alfa2c a oba hlavní vrcholy CH0-IFN-alfa2C byly i RP-HPLC izolovány a rozštěpeny působením trypsinu. Vzniklé peptidy byl od sebe odděleny pomocí RP-HPLC. Postup byl prováděn za podmínek, uvedených v publikaci Adolf a další, Biochem. J. 276, 511-518, 1991. Na obr. 22 je uvedeno srovnání získaných peptidů. Mezi peptidy z vrcholu 1 a z vrcholu 2 CH0-IFN-alfa2c (horní a střední část) existuje pouze jediný rozdíl: peptid 18 z vrcholu 1 po tryptickém štěpení téměř není obsažen ve vrcholu 2 (tam je uveden jako peptid 15). Místo něj je ve vrcholu 2 možno pozorovat nový peptid ( č. 19), který se vůbec nevyskytuje ve vrcholu 1 ani v E. coli-IFN-alfa2c (spodní část obr. 22).

Peptidy 12 ( z E. coli-IFN-alfa2C), 18 ( z vrcholu 1 CH0-IFN-alfa2C), 15 a 19 (z vrcholu 2 CHO-IFN-alfa2C) byly analyzovány při použití hmotové spektrometrie s desorpcí plasmatu (PD-MS). Podrobnosti tohoto postupu jsou uvedeny v publikaci Adolf a další, Biochem. J. 276, 511-518, 1991. Pro první tři z uvedených vzorků byla zjštěna molekulová hmotnost,, odpovídající aminokyselinám 150 až 162 řetězce IFN-alfa2c. Peptid 19 z vrcholu 2 CH0-IFN-alfa2c měl naproti tomu nižší molekulovou hmotnost, odpovídající řetězci aminokyselin 150 až 161. Byla také provedena analýza řetězce Části peptidů 19, čímž bylo jednoznačně prokázáno, že tento peptid začíná aminokyselinou 150 a končí LEU-161. Z těchto výsledků je možno uzavřít, že vrchol 1 pro CH0-IFN-alfa2c obsahuje úplnou molekulu IFN, kdežto ve vrcholu 2 chybí 4 C-terminální aminokyseliny 162 až 165. Zbytky aminokyselin 163 až 165 není po štěpení působením trypsinu positivně prokázat vzhledem k tomu, že vzniklý dipeptid (163/164) a volná aminokyselina 165 se vymývají s celkovým objemem RP-sloupce. Malý podíl peptidu 15. ( nezkrácený tryptický peptid s aminokyselinami 150 až 162), který se vyskytuje také ve vrcholu 2 CH0-IFN-alfa2c je patrně přítomen v důsledku kontaminace vrcholem 1 vzhledem k tomu, že vrcholy 1 a 2 není možno při použití RP-HPLC od sebe úplně oddělit.

V dalších pokusech bylo prokázáno, že C-terminálnímu zkrácení O-glýkosylovaného IFN-alfa2 z buněk CHO je možno zabránit tak, že se k uvolnění buněk od povrchu kultivační nádoby místo obvyklého roztoku s obsahem trypsinu a EDTA užije roztok neobsahující trypsin (například disodná sůl EDTA,

200 mg/1 s D(+)-glukosomonohydrátem 200 mg/1 v roztoku chlori_ du sodného s fosfátovým pufrem o pH 7,4). IFN-alfa2, čištěný

MUK z takto, kultivovaných buněčných kultur svrchu uvedeným způsobem má v reversní fázi HPLC (analogicky jako na obr. 21a) jen vrchol 1, odpovídající úplné bílkovině, avšak nikoliv vrchol 2, odpovídající zkrácenému řetězci bílkoviny. Mimoto bylo možno při analýze peptidů po tryptickém štěpení (analogicky jako na obr. 22) prokázat, že složení bílkoviny, získané bez použití trypsinu je totožné se složením bílkoviny, z níž byl pomocí štěpení trypsinem získám peptid z vrcholu 1 RP-HPLC, jak ;

je znázorněno na obr. 22a. )

SDS-elektroforéza · í

Vrcholy 1 a 2 CHO-IFN-alfa2c byly z RP-HPLC izolová- ' ny. Pak byly materiály z těchto vrcholů analyzovány jednotlivě' a ve srovnání s E. coli-IFN-alfa2c, a to jak za redukčních j ř

I podmínek ( po povaření s dithiothreitolem), tak za neredukčních podmínek při použití SDS-alektroforézy. Podrobnosti, týkající se těchto postupů jsou uvedeny v publikaci Adolf a další, J. Biol. CHem. 265, 9290-9295, 1990. Výsledky těchto zkoušek jsou znázorněny na obr. 23 (skvrny 2 až 4 byly získány za neredukčních podmínek, skvrny 5 až 7 za redukčních podmínek. Horní část v každé skvrně byla získána při nanesení 4^ug

IFN, spodní část při nanesení 1 ^ug IFN. Zejména ze skvrn 5 až 7 ve spodní části je zcela zřejmé, že jak vrchol 1, tak vrchol 2 CHO-IFN-alfa2c mají vyšší molekulovou hmotnost než neglýkosylováný E. coli-IFN-alfa2c. Vzhledem k neúplnému vzájemnému oddělení vrcholů 1 a 2 při použití RP-HPLC došlo ke vzájemné kontaminaci vrcholů 1 a 2. Ze stejného důvodu je také vrchol 2 kontaminován malým množstvím neglykosylovaného

CH0-IFN-alfa2c, který pochází z vrcholu 3 )jak je zřejmé z obr. 21). S ohledem na uvedenou komtaminaci je možno považo- ?

vat hlavní pásy vrcholů 1 a 2 pro CHO-IFN-alfa2c za homogenní.

Vzhledem k tomu, že se vrcholy 1 a 2 od sebe liší svými C-terminálními řetězci (jak bylo uvedeno svrchu), je možno z výsledků, dosažených použitím SDS-elektroforézy na gelu uzavřít, í že oligošacharidové části vrcholů 1 a 2 pro CH0-IFN-alfa2c I jsou totožné (jak bude ještě dále uvedeno v odstavci f).

e) Deglykosylace CHO-IFN-alfa2c

Vrcholy 1 a 2 pro CHO-IFN-alfa2c byly z RP-HPLC izo- j lovány a sušeny v příslušném zařízení (SpeedVac). Tyto vzorky j a také vzorky E. coli-IFN-alfa2c byly inkubovány v 10 /Ul f

0,1 M NaOH celkem 20 hodin při teplotě místnosti. Tyto vzorky, j které byly deglýkosylovány beta-eliminací byly analyzovány ;

při použití elektroforézy na SDS-gelu ve srovnání s nezpraco- J vánými vzorky. Výsledky, které jsou znázorněny na obr. 24 uka- | zují, že molekulová hmotnost materiálu z vrcholů 1 a 2 pro ΐ

CHO-IFN-alfa2c se po působení NaOH podstatně snižuje a je pak ?

s

I í

totožná s molekulovou hmotností E. coli-IFN-alfa2c po zpracování NaOH. Difusní vzhled pásů pro všechny vzorky, které byly zpracovány NaOH je aptrnš způsoben změnami, k nimž dochází v peptidovém řetězci za použitých reakčních podmínek.

f) Identifikace glykopeptidů

Srovnání peptidů, vzniklých po štěpení E. coli-IFnalfa2c trypsinem (obr. 22, spodní Část) a peptidů z vrcholu 1 (úplný C-terminální řetězec) pro CH0-IFN-alfa2c (obr. 22, horní část) ukazuje, že vždy dva peptidy mají odlišné doby retence. Peptidy 18 a 21 z E. coli-IFN-alfa2c, které obsahují zbytky aminokyselin 84-112 a 71 až 112 se v materiálu z vrcholu 1 CH0-IFN-alfa2c nevyskytují. Místo nich se tam vyskytují dva nové peptidy ( č. 26 a 31) které absorbují podobným způsobem při 280 a 214 rim jako peptidy 18 a 21 z E. coli-IFN-alfa2c. Z toho je možno dovodit, že peptidy 26 a 31 představujá glykosylovanou versi řetězců aminokyselin 84 až 112 a 71-112.

Pravděpodobně také z tohoto důvodu se uvedené peptidy ze sloupce RP vymývají podstatně dříve než analogické peptidy z E. coli-IFN-alfa2c. Pro obě možné délky peptidů po tryptickém štěpení (zbytky aminokyselin 84-++2 a 71-112) je možno pozorovat vždy jeden vrchol ( peptid 26 a 31) , takže je možno uzavřít, že oligosacharidová část uvedených látek je do značné míry homogenní.

Za srovnání peptidů, získaných z vrcholů 1 a 2 CHOIFN-alfa2c (horní a střední část obr. 22) je zřejmé, že glykopeptidy 26 a 31 z vrcholu 1 a glykopeptidy 24 a 30 z vrcholu 2 jsou totožné. Z tohota také vyplývá, že čtyři chybějící zbytky aminokyselin na G-t^ifiinálním zakončení vrcholu 2 tvoří jediný rozdíl mezi materiálem z vrcholu 1 a 2.

Všechny hlavní peptidy, týkající se ve všech třech vzorcích řetězců aminokyselin 84-++2 a 71-112 byly z RP-HPLC izolovány a dále štěpeny proteázou ze Staphylococcus aureus V8 na C-terminálním zakončení od kyseliny glutamové. Podmínky reakce jsou uvedeny v publikaci Adolf a další, Biochem. J., 276, 511-518, 1991. Výsledky byly srovnávány, všechny rozdílné vrcholy byly izolovány a analyzovány analýzou N-terminálního zakončení a/nebo hmotovou spektrometrií.

Jeden z peptidů,, nacházející se ve vrcholech 1 a 2 CHO-IFN-alfa2c, avšak nikoliv v E. coli-IFN-alfa2c po štěpení proteázou ze Staphylococcus aureus obsahoval aminokyseliny 97-112 řetězce IFN-alfa2c. Při analýze od N-terminálního zákon cení nebylo v tomto peptidu možno prokázat THR-106. Z toho je možno uzavřít, že THR-106 je v tomto peptidu glykosylován. Při použité Edmanově metodě analyzy řetězce dochází v případě glykosylovaných aminokyselin k derivatizaci a odštěpení stejně jako v případě neglakosylovaných aminokyselin, avša, glykosylované aminokyseliny není možno vzhledem k jejich zvýšené hydrofilnosti z reakční směsi extrahovat butylchloridem. To znamená, že uvedenou aminokyselinu není možno v tomto stupni prokázat, avšak řetězec nerušeně pokračuje. Další důkaz skutečnosti, že oligosacharid je vázán na THR-106 je možno spatřovat v tom, že vazba GLU-107/Thr-108 je proteázou ze £. aureus rozštěpena jen částečně. Je zřejmé, že přístupnost této peptidové vazby je v přítomnosti oligosacharidu omezena. V analogickém peptidu z E. coli-IFN-alfa2c je tato peptidová vazba téměř úplně rozštěpena.

Další peptid, který je možno po štěpení proteázou ze S. aureus nalézt pouze v CH0-IFN-alfa2c byl analyzován pomocí PD-hmotové spektrometrie. Získaná hodnota molekulové hmotnosti odpovídala řetězci aminokyselin 97-112 včetně oligosacharidu, který je tvořen vždy jednou molekulou N- acetyl40 galaktosaminu a galaktózy a dvěma molekulami kyseliny N-acetylneuraminové.

Z těchto výsledků je zřejmé, že jak místo glykosylace, tak oligosacharidová část je v CH0-IFN-alfa2c totožná s výsledky, které byly získány pro přírodní IFN-alfa2 z leukocytů, stimulovaných virem.

Izolace O-glykosylovaného interferonu z buněk, stimulovaných virem probíhá následujícím způsobem:

Metody

Biologická zkouška na interferon

Protivirový účinek preparátů s obsahem IFN byl prokazován na mikrotitračních plotnách zkouškou, která stanoví cyto pathický účinek (CPE) viru encephalomyocarditidy (EMCV). Jako zkušební buňky byly použity buňky lidského karcinomu plic. Podrobnosti zkoušky jsou uvedeny v publikaci Adolf G.R., J. Gen. Virol. 68, 1669-1676, 1987. Při každé biologické zkoušce byly všechny titrace provedeny dvakrát. Při každé zkoušce bylo provedeno také stanovení na lidském IFN-slfs2c, produkovaném E. coli. Účinnost těchto preparátů byla stanovena srovnáním s mezinárodními referenčními prostředky pro lidský IFNalfa2, Gxa 01-901-535. Všechny pozorované účinnosti IFN byly opraveny s ohledem na definovaný účinek uvedených referenčních preparátů.

ELISA pro interferon

Byla provedena žkbušká ELISA, při níž byly jako standardy použity dvě neutralizované myší protilátky IgG MAb proti IFN a jeden referenční preparát IFN-alfa2c (uvedený svrchu). Výroba protilátek a jejich vlastnosti byly uvedeny v publikaci

Adolf a další, J. Cell Physiol. suppl. 2, 61-68, 1982 a Adolf G.R., J. Gen. Virol. 68, 1669-1676, 1987. K převrstvení zkušebních ploten byla použita protilátka EBI-1. Protilátka E3I10, kovalentně vázaná na. peroxidázu z křenu, byla přidána spolu. se zkoumaným vzorkem. Jako substráty pro enzym byly užity Q-fenylendiamin a perboritan sodný. Reakce byla ukončena přidáním kyseliny sírové a pak byla měřena absorpce výsledného produktu ( 492 nm, reference 690 nm).

Čištění přírodního lidského IFN-alfa2

Sloupec pro afinitní chromatografií byl připraven navázáním 12 mg monoklonální protilátky, například MAb EBT10 (čištěné z myšího ascitu vysrážením síranem amonným a afinitní chromatografií bílkoviny G podle standardních postupů) na 1 g Sepharosy 4B, aktivované CNBr podle návodu výrobce (Pharmacia). Objem náplně ve sloupci byl přibližně 3 ml. Částečně čištěný interferon z lidských leukocytů (Cantell a další, Methods Enzymol. 78, 29-38, 1981, Cantell a další,tamtéž, 499-505), z nějž byl odstraněn podíl IFN-omega (Adolf a další, J. Biol. Chem. 265, 9290-9295, 1990) a obsahující přibližně 2 až 3 x 10 IU/ml při koncentraci celkové bílkoviny ;2 mg/ml byl nanesen na sloupec při rychlosti průtoku 1 ml/ min. ( 200 a 350 ml). Pak byl sloupec promyt 0,1 M pufrem (fosforečnan sodný) o pH 7,5 - Pufr A a pak byla prováděna sluce při použití lineárního gradientu Pufru A a Pufru B (0,1 M citrátu sodného o pH 2,1) v systému FPLC (Pharmacia) při rychlosti průtoku 1 ml/min. Získané frakce byly zkoumány aa účinnost IFn pomocí zkoušky ELISA. Odpovídající frakce byly spojeny, neutralisovány 1 M NaOH a znovu naneseny na tentýž sloupec, uvedený do rovnovážného stavu v pufru A. Pak byl použit týž eluční program při rychlosti průtoku 0,25 ml/min. Odpovídající frakce byly opět spojeny, neutralizovány a pak byly jednotlivé podíly materiálu lyofilizovány.

Elektroforéze na SDS-gelu, technika HPLC a analýza řetězce aminokyselin

K analýze čištěného IFN-alfa2 by^l, použita elektroforéza na SDS-polyakrylamidovém gelu a RP-HPLC. Tyto postupy již byly velmi podrobně popsány (Adolf a další, J. Biol. Chem. 265, 9290-9295, 1990. Stanovení N-terminálního řetězce bylo prováděno na automatickém zařízení pro nanalyzu řetězce (Applied Biosystems, Modell 477A), deriváty aminokyselin byly analyzovány pomocí RP-HPLC systémem on-line (Adolf a další,

J. Biol. Chem. 265, 9290-9295, 1990).

Mapování peptidů, získaných proteolýzou

IFN-alfa2, čištěný afinitní chromatografií, byl dále čištěn RP-HPLC, denaturován a zbaven solí ( Adolf a další,

J. Biol. Chem. 265, 9290-9295, 1990. Hlavní frakce byly odděleny a vysušeny na zařízení SpeedVac. 29 ^ug (vrchol 1) a 66 yUg (vrchol 2) bílkoviny bylo rozpuštěno v 0,1 ml 1% roztoku hydrogenuhličitnau sodného. Pak bylo přidáno 0,5 ^ug nebo l^ug trypsinu (Boehringer Mannheim) ve 3 nebo 6 ^ul 0,01% kyseliny trifluoroctové a reakční směs byla inkubovány při teplotě 37 °C. Po 6 hodinách inkubace bylo znovu přidáno totéž množství trypsinu a směs byla inkubována dalších 18 hodin. Pak byla reaklční směs pře analýzou redukována přidáním 10 ^ul 0,5 M dithiothreitolu a 100 ^ul 6 M močoviny na dobu 2 hodiny při teplotě místnosti. RP-HPLC byla prováděna na sloupci Delta Pak C18 (Waters, 3,9 x 150 mm, velikosti částic 5 ,um, průměr pórů 1 x 10“ cm) při teplotě 30 °C při použití následujících rozpouštědel: Rozpouštědlo A: 0,1% kyselina trifluorocL^vá ve vodě, Rozpouštědlo B: 0,1% kyselina trifluoroctová v acetonitrilu. Bylo použito následujícího gradientu (rychlost průtoku 1 ml/min.): 0-55 minut: 0-55 % B (lineární gradient)·, až 70 minut: 50 % B. Detekce peptidů se provádí podle jejich absorpce při 214 a 280 nm. Výsledné vzorky byly srovná- \ \

í

- 43 vány se vzorky, získanými z E. coli IFN-alfa2c. Peptidy, získané z přírodného IFN-alfa2, které se v průběhu eluce chovaly jiným způsobem než odpovídající peptidy z rekombinantního materiálu byly odděleny a byla provedena analýza jejich řetězce na N-terminálním zakončení, nebo byly peptidy dále odbourávány proteázou ze Staphylococcus aureus V8 (Endopeptidase GluC, Boehringer, Mannheim) 0,88 ^ug (vrchol 1/Ί), 2,6 ^ug (vrchol 2/Ia) a 1,5 ^ug (vrchol 2/Ib) peptidu bylo rozpuštěno vždy v 0,1 ml 25 mM fosfátového pufru o pH 7,8. Pak byl přidán rozotk proteázy ve vodě ( 17,5 ng, 52,5 ng a 29 ng) a reakční směs byla inkubována při teplotě 37 °C. Po 6 hodinách bylo přidáno ještě totéž množství proteázy a směs by^J. inkubována ještě 18 hodin. Pak byly vzorky svrchu uvedeným způsobem analyzovány při použití RP HPLC. Odpovídající frakce byly izolovány a byla provedena analýza N-terminálního zakončení.

Deglykosylace IFN-alfa2

Čištěný, denaturovaný a solí zbavený IFN-alfa2 byl - zpracováván působením neuraminidázy z Vibrio cholerae (Boeh'** ringer Mannheim) (50 mU/ml, 18 hodin při 37 °C ve 20 ^ul 50 mM octanu sodného při pH 5,5, 4 mM CaC^) a/nebo působením endo-alfa-N-acetylgalaktosaminidázy, tj. O-glykanázy (Boehringer Mannheim) (100 mM/ml, 18 hodin při 37 °C v tomtéž pufru). Chemická eliminace byla dosažena inkubací s 0,1 M NaOH 20 hodin při teplotě místnosti. ·

PD-hmotové spektrum

Hmotové spektrum peptidu po štěpení trypsinem bylo měřeno na hmotovém spektrometru BIO-ION 20 time-of-flight (BIO-ION Nordic AB, Uppsala, Švédsko). Vzorky byly rozpuštěny v 0,1% kyselině trifluoroctové a naneseny na nitrocelulozou převrstvené cílové materiály (BIO-ION). Spektrální doby ;

akumulace se pohybovaly v rozmezí 0,5 až 12 hodin v závislos- \ i} »

i ti na výtěžku. Spektrum pro jednotlivé vzorky, bylo měřeno při napětí 17 kV.

Příklad-7

Čištění přírodního lidského IFN-alfa2

Interferon z lidských leukocytů, získaný z lidských leukocytů z periferní krve po indukci virem Sendai a částačně čištěný způsobem podle Cantell a další, Methods Enzymol. 78,

29-38 a 78, 499-512, 1981, byl užit jako výchozí materiál pro izolaci a čištění IFN-alfa2. Selektivní afinitní chromatografií při použití monoklonální protilátky Anti IFN-omega, například OMG-4, OMG-5 nebo OMG-7 byl odstraněn podíl IFN-omega (Adolf a další, Virology 175, 410-417, 1990, EP č. 252 571).

fi

Specifická protivirová účinnost byla 1 až 2 x 10 IU/mg, což

Q znamená, že IFN-alfa se specifickou účinností 2 x 10 IU/mg tvořil pouze přibližně 1 % celkového množství bílkoviny. K čištění IFN-alfa2 od kontaminujících cizorodých bílkovin a současně od dalších typů IFN-alfa byly použity vysoce selektivní monoklonální protilátky Anti-IFN-alfa2. Tyto protilátky jsou při standardní neutralizační biologické zkoušce vysoce specifické proti IFN-alfa2 ( Adolf G.R., J. Gen. Virol. 68,

1669-1676, 1987).

Byl připraven sloupec pro afinitní chromatografii, v němž byly takové monoklonální protilátky, například proti- , látka EBI-10, získaná například podle publikace J. Gen. Virol. 68, 1669-1676, 1987 nebo podle DE 33 06 060.6 vázány na

Sepharosu 4B, aktivovanou CNBr. Protilátka byla čištěna z ascitu myši vysrážením síranem amonným a pak’ afinitní chromatograf i í bílkoviny B podle standardních postupů. Užije se například 12 mg monoklonální protilátky EBI-10, navázané na 1 g

Sepharosy 4B, aktivované CNBr, postupuje se podle návodu výrobce. Objem náplně sloupce je přibližně 3 ml. :

i i

•í i

i

Přípravky interferonu z leukocytů byly naneseny na uvedený sloupec. Bylo vázáno přibližně 20 % protivirové účinnosti. Eluce byla prováděna při použití lineárního gradientu pufru, a to 0,1 M fosforečnanu sodného o pH 7,5 a 0,1 M citrátu sodného o pH 2,1. V eluátu bylo možno prokázat dva vrcholy pro bílkovinu (obr. 12): Frakci A a Frakci B. Obě frakce byly analyzovány na obsah IFN-alfa, bylo užito zkoušky dvoustranná ELISA s použitím jak EBI-10, tak EBI-1. Obě protilátky měly vysokou specifičnost pro IFN-alfa2 (Adolf a další, J. Cell. Physiol. Suppl. 2, 61 až 68, 1982). Jako standard byl užit rekombinantní IFN-alfa2c. Frakce, k jejichž eluci došlo při nízkém ph (obr. 12, vrchol A) i frakce pro vzorky poskytly titrační křivky, které probíhaly paralelně s titrační křivkou rekombinantního IFN-alfa2c. Z průběhu vrcholu 1 a jeho frakcí (vrchol B) byly získány křivky s různou strmostí. Tyto materiály nebylo možno podrobit analýze kvantitativní zkouškou ELISA (obr. 13), materiály však byly zkoušeny na svou biologickou účinnost (tabulka III).

Nižší pH, jehož je zapotřebí k eluci vrcholu A a také výsledky zkoušky ELISA prokazují, že IFN-alfa2 tvoří hlavní podíl vrcholu A. Aby bylo možno se ujistit, že celé množství imunoreaktivního IFN-alfa bylo vázáno protilátkou, byl materiál znovu nanesen na sloupec a podruhé byla provedena eluce svrchu uvedeným způsobem. Získaný materiál obsahoval méně než 10 % účinnosti IFN,vázané při prvním průchodu.

Frakce A i B byly odděleně izolovány, neutralizovány a chromatograficky čištěny na tomtéž sloupci pro afinitní chromatografií. V obou případech bylo vázáno více než 95 % IFN-účinnosti. Eluce byla prováděna při použití téhož gradientu jako svrchu. Výchozí produkt a frakce byly zkoumány modří Coomassie na obsah bílkovin a biologickou zkouškou na obsah IFN. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce III.

<u >04

XU μ

>

<43

O

X ε <u x

-P μ oj <u ο ο c

C ο Η μ >ο '3

			03	04	U3
			4»	Λ	4»
ο	<3	. r*4		ω	03
ο	Ο»	ι-Μ

Ο

V

143 «3

1-4 <ν π to ι> ο cn

Čištění přírodního IFN-alfa2 '«} >

ο μ

Ή >

-μ

Ο μ

ο,

CC

C μ

>

Ο ε

οο ε

ε <υ

Ό μ ο ε ο

Ή μ

<u μ

¢0 s

03	04	«3	03
*	*	Α	«0
04	04	σ>		CJ	03
				ι—4	μ

		03	143
0'	ο	Ο	Ο	ř—+	Γ—}
4»	Μ	4»	4k	4»	4*
f—♦	ι—4	Ο	Ο	Ο	Ο

ο ι43

143

Ο 00 Ο 03 V

143 μ μ

143

(Η S
	Ό ο	<	03	<	03
	μ Ο μ ο.	μ	μ	μ	μ
	Ο 3	><β	Χθ	'(Ú	Xfl
	-μ ο	3	3	3	3
	co μ	ι—4	μ	ι—4	r4
	ε ω	<υ	Ο	ο	o
	• 3	•k		4»
	03 34	03	03	03	03
	3 0	3	3	3	3
	μ μ	ř—4	μ	ί—♦	ř—♦
	34 «3	X	34	34	34
4	>> ί-	>»	>1	3b	>,
Cl.	ο α.	ο	Ο	Ο	O
Μ 1	• ο	β	. ·		•
0-	r—4 Ο»	r-l·	ř—1	CJ	04

34	•3 μ >>
0)	O
XO	O
3	34
0	3
34	<u
C4	μ
£	£,
	O '>»
0	34
•H	co
oo	Ό
0	μ	f—4
r—1	μ	1
0		co
μ	N	oo
n		o
	2	ε
143	Cx.	0
	M	1
N		2
	'>»	b.
CO	C	H
μ	XU
O	μ	Ή
C	XO	c
T3	μ	XU
O	xu	c
4=		<0
	XU	μ
	c	μ
c	XU	03
Ό	o	•σ
O	μ	0
>μ	03
μ	'<0	0
03	>o	o.
	z“*.
	04

Příklad 8

Identifikace bílkoviny, čištěné afinitními metodami jako

IFN-alfa2

Afinitním způsobem čištěný IFN-alfa byl nejprve analyzován HPLC v reversní fázi a čištěn. Vrchol A obsahoval dva další neúplně od sebe oddělené vrcholy 1 a 2 při hmotnostním poměru přibližně 1:2 (obr. 14 dole). Vrchol ”1 představuje hydrofilnější frakci bílkoviny. Obě frakce vrcholu byly odděleny, rechromatografovány a byla provedena N-terminální analýza řetězce. Z obou frakcí byl získán následující řetězec ( zbytky Cys, uvedené v závorkách nebyly identifikovány, nýbrž byly odvozeny na základě konservováných řetězců IFN) :

(¹CYS)-ASP-LEU-PRO-⁵GLN-THR-HIS-SER-LEU-^1OGLY-SER-ARG-ARGthr-¹⁵leu-met-leu-leu-ala-²⁰gln-met-arg-²³arg-ile-²⁵serLEU-PHE-SER-(CYS)-³⁰LEUSrovnáním s publikovanými řetězci byly oba řetězce identifikovány jako řetězce IFN-alfa2.

V obou frakcích vrcholu, 1 a 2 byla aminokyselina v poloze 23 jednoznačně identifikována jako arginin. Varianta, označovaná jako LelFA, která obsahuje v poloze 23 lysin (Goeddel a další, Nátuře 290, 20 až 26, 1981 tedy v použitém preparátu leukocytů nebyla ve zjistitelném množství obsažena. Aminokyselina v poloze 34 byla identifikována jako histidin. To znamená, že izolovaný IFN-alfa2 náležel do varianty IFN-alfa2b.

Specifická protivirová účinnost přírodního IFN-alfa2, vztaženo na mezinárodní referenční preparát pro IFN-alfa2,

Gxa01-901-535 na základě stanovení obsahu bílkovin ve vzorku á .absorpcí při 214 nm způsobem podle publikace Adolf a další, í |

i

I i

·

Virology 175, 410-417, 1990 byla stanovena v hodnotě 1,5 x

IU/mg (jde o průměr z pěti nezávislých biologických stanovení ) .

Při srovnání doby retence přírodního IFN-alfa2 při HPLC v reversní fázi s toutéž hodnotou pro rekombinantní E. coli-IFN-alfa 2 je možno prokázat, že k elucí rekombinantní bílkoviny docházá daleko později, jak je zřejmé z obr. 14.

Zvýšená hydrofilnost přírodní bílkoviny a také její heterogenita proto musí určitým způsobem souviset s posttranslačními modifikacemi.

V případě, Že se vrchol B podrobí HPLC v reversní fázi, získá se směs pěti od sebe neúplně oddělených vrcholů.

Při analýze řetězců materiálů z těchto vrcholů bylo prokázáno, že tyto vrcholy sice obsahují materiál ze skupiny IFN-alfa, avšak v žádném z nich .nebylo možno prokázat IFN-alfa2.

IFN-alfa2, který byl čištěn HPLC byl dále analyzován při použití SDS-PAGE po redukce dithiothreitolem, jak je znázorněno na obr. 20. Za zvolených podmínek bylo možno prokázat pro rekombinantní IFN-alfa2c z E. coli zjevnou molekulovou hmotnost 17 500 (molekulová hmotnost, odvozená od řetězce aminokyselin: 19 287). Při analýze frakce 1, získané při HPLC bylo možno získat jediný široký pás (zjevná molekulová hmotnost 20 000), kdežto z frakce vrcholu 2 byly získány dvě hlavní složky (s molekulovou hmotností 20 000 a 19 000) a jed- i na vedlejší složka s molekulovou hmotností 21 000. Tyto roždí- j ly v molekulové hmotnosti ve srovnání s rekombinantní bílko- , vinou z E. coli, heterogenita, pokud jde o velikost jednotlivých molekul a také zvýšená hydrofilnost ukazují na to, že přírodní IFN-alfa2 je glykosylován. Vzhledem k tomu, že ve ’ í

struktuře molekuly neexistuje žádné místo pro N-glykosylaci, musí jít o O-glykosylaci. t i

i i

Příklad 9

Reakce přírodního IFN-alfa2 s endo- a exoglykosidázami

Následující pokusy byly prováděny vždy s oběma vrcholy po oddělení RP-HPLC (vrcholy I a 2 na obr. 14b). Oba vzorky byly inkubovány s neuraminidázou a pak s O-glykanázou. Po každé enzymatické reakci byl podíl materiálu analyzován pomocí

SDS-PAGE.

Jak je zřejmé z obr. 16, nereagoval materiál z vrcholu 1 ani a neuraminidázou, ani s O-glykanázou. Zjevná molekulová hmotnost zůstávala konstantní, 20 000. Naproti tomu tři pásy vrcholu 2 reagovaly jak s neuraminidázou, tak s O-glykanázou.Reakce s neuraminidázou vedla ke snížení zjevné molekulové hmotnosti u obou větších pásů(21 000 a 20 000) na 19 000. Přesto zůstaly přítomny stopy materiálu s molekulovou hmotností 20 000. Následná inkubace s 0-glykanázou vedla k dalšímu snížení zjevné molekulové hmotnosti z 19 000 na 17 500 ( tj. na molekulovou hmotnost E. coli-IFN-alfa2c). Složka s molekulovou hmotností 19 000 byla tedy zcela odbourána. Zůstalo však stále ještě stopové množství materiálu s molekulovou hmotností 20 000. Vzhledem k tomu, že oddělení obou vrcholů 1 a 2 z obr. 14b pomocí RP-HPLC zůstalo neúplné, je příčinou neštěpitelného podílu ve vrcholu 2 s molekulovou hmotností 20 000 patrně způsobeno znečištěním tohoto vrcholu materiálem z vrcholu 1.

Při dalším pokusu byl materiál z vrcholu 2 inkubován :

s O-glykanázou bez předchozího působení neuraminidázy (O-gly- ^; fcanáza čtěpí disacharid Gal(beta 1 až 3)GalNAc od bílkoviny / :

pouze tehdy, nerf-li substituován žádnými dalšími látkami).

Reakšní produkt byl opět analyzován pomocí SDS-PAGE (obr. 17). ;

Je zřejmé, že ke snížení molekulové hmotnosti došlo pouze u ξ nejlehčího podílu vrcholu 2 ( z 19 000 na 17 500). Zjevná mo- j

I i

s lekulová hmotnost u obou těžších složek ( s molekulovou hmotností 21 000 a 20 000)zůstala zachována.

Příklad 10

Reakce přírodního IFN-alfa2 s 0,1 M NaOH

Vzhledem k tomu, že O-glykosylované materiály je možno odbourat již za mírně alkalických podmínek, byl učiněn pokus deglykosylovat složku, odolnou proti působení O-glykanázy (vrchol 1 na obr, 14b) inkubací s 0,1 M NaOH. Reakce probíhala svrchu uvedeným způsobem. Současně byly jako kontroly inkubovány E.coli-IFN-alfa2c a vrchol 2. Vzniklé reakční produkty byly analyzovány pomocí SDS-PAGE. Jak je zřejmé z obr. 18, byla molekulární hmotnost všech složek přírodního IFN-alfa2 snížena na zjevnou molekulovou hmotnost E. coli-IFN-alfa2. Neostré pásy pro bílkoviny byly patrně způsobeny malým rozru=· žením struktury bílkovin za použitých podmínek. Také vznik pásů s vyšší molekulovou hmotností ( nad 30 000) je nutno při~ psát alkalickým podmínkám.

Příklad 11

Identifikace glykopeptidů mapováním peptidů

Oba vrcholy, které byly získány z přírodního IFNalfa2 (obr. 14b) a také E. coli-IFN-alfa2c byly rozštěpeny působením trypsinu, materiál byl redukován a pak rozdělen pomocí RP-HPLC. Na obr. 19 jsou znázorněny výřezy získaného chromatogramu. Je zřejmé, že dva vrcholy z E. coli-IFN-alfa2c vzhledem ke své hydrofobnosti a tím pozdější eluci ze sloupce jsou poněkud opožděny ve srovnání s anaxogickými vrcholy z přírodního IFN-alfa2: Vrchol I a vrchol II (pro E.coli-IFNalfa2c) jsou vymyty podstatně později než odpovídající vrcholy 1/1 a l/II z vrcholu 1 obr. 14b nebo vrcholy 2/Ia, 2/Ib, 2/IIa a 2/IIb z vrcholu 2 z obr. 14b.

Analýzou řetězce od N-terminálního zakončení pro materiál z vrcholu pro přírodní IFN-alfa2 a pro oba vrcholy E.coli byl pro vrcholy I, 1/1, 2/Ia, 2/Ib ( z obr. 19) získán řetězec aminokyselin (AS) 84-112 a pro. vrcholy II, 2/IIa, l/II a 2/IIb řetězec AS 71 až 112 (řetězec aminokyselin IFN-alfa2c je znázorněn na obr. 15). Různé doby retence musí tedy být způsobeny glykosylací peptidů z přírodního IFN-alfa2.

Příklad 12

PD-hmotová spektroskopie glykopeptidů z přírodního IFN-alfa2

Vrcholy l/II, 2/IIa, 2/Ia a 2/IIb byly charakterizovány při použití PD-hmotového spektra. Výsledky získaných měření jsou shrnuty v následující tabulce IV. Rozdíl v molekulové hmotnosti, vypočítané pro jednotlivé peptidy z řetězce aminokyselin a skutečnou prokázanou molekulovou hmotností těchto glykopeptidů je možno vysvětlit rozdílnou glykanovou strukturou: molekulová hmotnost peptidů l/II, který byl získán z formy IFN-alfa2, odolné proti působení O-glykanázy, odpovídá molekulové hmotnosti peptidů (AS 71 až 112), který je substituován tetrasacharidem, tvořeným dvěma N-acetyIhexosaminovými jednotkami a dvěma hexózovými jednotkami. Analogicky k již popsaným strukturám takových O-glykanů by zde mohlo jít o oligosacharid s následující strukturou: Gal 1 až 3 (Gal 1 až 4- (

GlcNAc l-6)GalNAc-. i i

i i

Peptid 2/Ia má molekulovou hmotnost 3 975, což je ;

možno vysvětlit substitucí tohoto peptidů trisacharidem se · strukturou NeuAc-Gal-GalNAc. Tutéž glykanovou strukturu je možno odvodit z molekulové hmotnosti peptiďu 2/IIa, 5 448. :

Pro peptid 2/IIb byla změřené molekulová hmotnost 5 132, což -odpovídá glykosylací tohoto peptidů disacharidem se struktu- í rou Gal-GalNAc. V tomto odstavci jde vždy o atomární hmotností mí jednotky, amu. 5

I

I i

I i

ϊ.

I i

Zásadně je možno pro všechny analyzované vrcholy prokázat molekulovou hmotnost, zvýšenou o přibližně 23 jednotek. To je možno vysvětlit navázáním sodných iontů na peptid. Tyto nečistoty by bylo bývalo možno odstranit intensivním promytím materiálu před měřením, v tomto případě však promytí nebylo úmyslně provedeno, aby bylo možno udržet ztráty glykopeptidu na co nejnižších hodnotách. Z výsledků odbourávání působením glykosidázy, tak jak bylo svrchu uvedeno a z měření hmotovým spektrometrem bylo možno odvodit struktury glykanů, uvedené v tabulce IV. Malé vrcholy, které je možno pozorovat v glykopeptidové mapě mohou být způsobeny dalšími variantami glykosylace peptidů.

<Xí

3	P
C	cn
cO	0
X	c	OJ	03	oo
>»	P	tn	l>	o	oo
ι—1	O	t>	«3	(O	co
oo	ε
	j=
CO
su		r-l
3		co
P		o
X		1
3		o
S-		<	O	o
P		2	<	<
ca		o	3	3
			<D	0)
'<0		o	2	2
c		1	1	1
cO					r-H
TJ		co	CO	cO	co
'<0	<0	O	o	O	O
P	í.	1	1	1	1
X	3	o	o	o	o
o	P	<	<	<	<
Q.	x	2	2	2	2
TJ	3	P	P	p
CD	í.	cO	ca	CO	cO
	P	O	o	O	O
a.	ca	1	1	1	1

Ή

	TJ ta	σ> τ	P l>	CM P	co <D
CO			o	c-.	CO	Γ	co
	P		ί-
ií	co
	o		ο 1
P	c		C N
	P		d) ><D z-^
3	o		P P w
	• ε		>O <D <	(O	co	co	CO
J3	£		O >L	co	O	co	co
		CM	a <u	ř-	CO	c-·
cO		z-s	>) N O
	'<0	3	> —'		co	'T
e-	>	ε
	0	<0	0
	r—1	w	c
	3		o
	ií		ta	n	n	00	CM
	CD		<u	oo		v	co
			P		CD	'T	P
	0		co
	£		C	n	co	n	n

Τ!

Ρ

Ρ

Q.

<0 ft.

O Si c c

CO <u • ca >o >> PH '(ΰ

OJ	CM	OJ	OJ
r-4			cd
		rH	rH

lili

rH		rH	rM
	co	c-»

1 P			c CO P
>L		CD	P’
O.		p	xj
	3	•	0
«3	O	s.	0.
O	c	Λ	>»
P	CO	0	>
P	TJ
a.	'CO	ta	Z—x
o	cH		co
o.	ií	«3	>—z
o	O	pH
ϋ	Q.	0	-
>»	TJ	XJ.	ca
r-}	CD	O	ϋ
oo	>C-	í.	P
	Q.	>	o
£ O	P	cO	c TJ
	O	P	<D
>	p	cn	P
P	P	P
ιΉ	ca	>o	P
P	TJ		C
O	P	z—.	P
c	>	P	cn
TJ	O	-P	0
<13	Q.		c
p	O	•	P
	O	3	O
P		0	ε
CQ	co	su	2
O c	CM	3 P	Ή
P	ca	ií	c
O	<H	3	c-
ε	P	í-	'CO
2	CO	P	ε
	1	cn	0
P	2		P
ί»	IP	3	CO
c	P	0
χθ		>	-
rM	O	o	3
3	JZ	c	ε
ϋ	P	CO	CO
CD	c	ϋ
rH	TJ	>»
O	o	i—4	CM
£	u	oo	'^Z

hmotnost včetbě sodíkových iontů.

o sz o

c>

	CO	O
w	CO	P	P
w	H	P	P
	'—		\
cH	CM	CM	CM

n co ε5.4

Příklad 13

Identifikace O-glykosylovaných aminokyselin analýzou řetězce v plynné fázi

Vzhledem k tomu, že glykopeptidy, získané po štěpení trypsinem byly příliš dlouhé, enž aby bylo možno stanovit celý jejich řetězec, byly tyto peptidy dále štěpeny proteázou V8 ze Staphylococcus aureus a pak děleny pomocí RP-HPLC. Obdobným způsobem byly zpracpvány také peptidy z E. coli-IFNalfa2c. Po srovnání peptidových map byly izolovány všechny peptidy s různou dobou retence a jejich řetězec byl analyzován. VšeAgny glykopeptidy z přírodního IFN-alfa2 obsahovaly aminokyseliny 97 - 112. VE. coli-IFN-alfa2c bylo možno prokázat v peptidu THR, v peptidech z přírodního IFN-alfa2 nebylo možno v uvedené poloze tuto aminokyselinu prokázat. Tím je

ΤΟβ možno považovat THR za místo, na němž dochází ke glykosylaci.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Interferon alfa, který je O-glykosylován a má podstatné biologické a/nebo imunologické vlastnosti IFN-alfa2, s výhodou jde o O-glykosylovaný lidský IFN-alfa2a, IFN-alfa2b nebo IFN-alfa2c
2. 2. Interferon alfa podle nároku 1, v němž je threoninový zbytek v poloze 106, THR-106, O-glykosylován.
3. 3. Interferon alfa podle nároků 1 nebo 2, v němž oligosacharidem je s výhodou neutrální disacharid Gal-GalNAc, jeho mono- nebo disialylovaná varianta nebo neutrální tetrasacharid Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc.
4. 4. Způsob výroby interferonu alfa podle nároku 1, vyznačující se t i m, že se

   a) leukocyty, s výhodou lidské leukocyty indukují virem,

   b) indukcí získaný interferon lafa se čistí řadou šetrných čisticích stupňů, při nichž se bílkovina sráží a rozpouští, přičemž pH je vždy nižší než 8,0 (Cantellův postup),

   o) směs interferonu, získaná ve stupni a) nebo a) a b) se váže na sloupec pro afinitní chromatografií s monoklonální protilátkou proti IFN-alfa2,

   d) vázaná bílkovina se vhodným způsobem eluuje,

   e) z eluátu s oddělí bílkovina a popřípadě se vícekrát čistí na slouci pro afinitní chromatografií.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se jako monoklonální protilátka proti IFNalfa2 užije EBI-10 nebo její analogy.
6. 6. Způsob podle nároku 4 pro výrobu interferonu alfa, vyznačující se tím, že se po stupni e) provádí další chromatografické čištění.
7. 7. Způsob výroby interferonu alfa podle nároku 1, vyznačující se t í m, že se

   a) do plasmidů pro expresi, vhodného pro transfekcí buněk více• buněčných organismů uloží DNA, která je kódem pro IFN-alfa,

   b) při použití takto získaného plasmidů pro expresi se provede transfekce buněk mnohobuněčného organismu, s výhodou obratlovce,

   c) buňky tohoto organismu se po transfekcí pěstují ve vhodném živném prostředí,

   d) supernatant buněčné kultury se oddělí,

   e) O-glykosylovaný IFN-alfa se izoluje a čistí obvyklým způsobem.
8. 8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se í tím, že se ve stupni a) užije plasmid pAD-CMV13, 15 nebo 19, .i s výhodou pAD-CMV19 a uložená DNA je kódem pro bílkovinu, která v podstatě má biologické a/nebo imunologické vlastnosti

   IFN-alfa2, s výhodou lidského IFN-alfa2a, IFN-alfa2b nebo IFNalf a2c, zvláště lidského IFN-alfa2c.
9. 9. Způsob podle nároků 7 nebo 8,vyznačují- ;

   c i se t í m, že se jako plasmid pro expresi užije plas- | mid pAD19B-IFN. ’

   Ť
10. 10. Způsob podle nároků 7, 8 nebo 9, vyznačující se t í m, že se z buněk mnohobuněčných organismů j užijí buňky CHO. Ϊ i

    r i
11. 11. Plasmid pro expresi k transfekci mnohobuněčných organismů, s to pAD-CMV13, pAD-CMV-15 nebo pAD-CMV-19.
12. 12. O-glykosylovaný interferon alfa, získaný způsobem podle nároků 4 až 10.
13. 13. Interferon alfa podle nároků 1 až 3 nebo 12 pro použití jako léčivo.
14. 14. Farmaceutický prostředek pro léčení virových nebo nádorových onemocnění, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje interferon alfa podle nároků 1 až 3 nebo 12.
15. 15. Farmaceutický prostředek podle nároku 14, vyznačující se tí m, že obsahuje směs alespoň dvou glykosylovaných bílkovin’IFN-alfa2A, IFN-alfa2b nebo IFNalfa2c.