DE4035877A1 - O-glycosyliertes ifn-alfa2 - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist O-glycosyliertes IFN-α2, Verfahren zu dessen Herstellung sowie die Verwendung der O-glycosylierten Proteine als Arzneimittel.

Seit der Entdeckung der Interferone vor mehr als dreißig Jahren werden ihre biologischen Eigenschaften als Mediatoren der interzellulären Kommunikation intensiv untersucht. Ursprünglich wurde die Bezeichnung der verschiedenen Arten von der jeweiligen Zelle, in der sie entstanden sind, abgeleitet (z. B. Leukocyten-IFN, Fibroblasten-IFN). Mit zunehmender Kenntnis ihrer Struktur wurde eine neue Nomenklatur eingeführt. Man unterscheidet zur Zeit vier Arten von Interferonen (IFN-α, IFN-ß, IFN-γ und IFN-ω), wobei IFN-α, IFN-β und IFN-ω zu den sogenannten "Klasse 1 Interferonen" zusammengefaßt werden, da sie alle an denselben hochaffinen Zellmembran-Rezeptor binden.

IFN-γ wird von Lymphozyten, die durch Antigene oder mitogene Substanzen stimuliert werden, gebildet. Die Aminosäuresequenz, die keine Homologie zu den Klasse 1 Interferonen aufweist, enthält zwei potentielle N- Glycosylierungsstellen.

IFN-α, IFN-β und IFN-ω werden von verschiedenen Zellen als Reaktion auf Virusinfektion oder nach Induktion mit doppelsträngiger RNA synthetisiert.

Bei IFN-α handelt es sich eigentlich um eine ganze Gruppe von Proteinen. Bisher wurden mindestens 14 funktionelle Gene entdeckt, die für verschiedene IFN-α-Typen kodieren. Diese Proteine sind nahe verwandt und weisen zumeist etwa 90% Homologie in ihrer Aminosäuresequenz auf. Mit der Ausnahme von IFN-α14 ist in keiner der übrigen IFN-α Aminosäuresequenzen eine N-Glycosylierungsstelle (ASN-X-SER/THR) vorhanden. N-Glycosylierung ist somit in allen Fällen auszuschließen, jedoch wurde O-Glycosylierung von IFN-α diskutiert (Labdon et al., Arch. Biochem. Biophys. 232, 422-426 (1984)) Viele in der Natur vorkommenden Proteine werden posttranslational modifiziert, wobei Glycosylierung eine der häufigsten Modifikationen ist. Glycoproteine kommen membrangebunden oder löslich sowohl in der intra- als auch extrazellulären Matrix vor. Über die Funktion der Glycosylierung gibt es unterschiedliche Auffassungen. Gesichert ist, daß Glycane die Proteine vor proteolytischem Abbau schützen oder daß sie in vielen Fällen für Zell-Zell-Wechselwirkungen verantwortlich sind. Weiterhin beeinflussen sie die Proteinfaltung und tragen zur Stabilität der Konformation des Moleküls bei. Auch die Löslichkeit der Proteine unterliegt dem Einfluß der Kohlenhydratketten.

Man unterscheidet zwischen N- und O-glycosyiierten Proteinen. N-Glycane werden ausschließlich auf das ASN des Triplets -ASN-X-SER/THR- übertragen, wobei X jede beliebige Aminosäure mit Ausnahme von PRO oder GLU sein kann. Diese Anforderung an die Struktur des Proteins kann aber nur eine von mehreren sein, da nicht alle potentiellen Glycosylierungsstellen mit einem Kohlenhydrat besetzt sind. Für O-Glycane gibt es keine genau definierten Strukturmerkmale. Es gibt allerdings Hinweise darauf, daß O-Glycane bevorzugt in PRO-, SER- und THR-reichen Regionen synthetisiert werden. Das läßt vermuten, daß eher die sterische Zugänglichkeit der Glycosylierungsstelle als eine bestimmte Aminosäure­ sequenz für die O-Glycosylierung bedeutend ist.

Im IFN-α2 konnten bislang weder Kohlenhydratanteile in nachgewiesen, noch konnte O-glykosyliertes IFN-α isoliert werden. Verschiedene Präparationen von natürlichem IFN-α und von rekombinantem IFN-α2 sind als Medikamente gegen virale und Krebserkrankungen im Einsatz. Da dieses IFN-α2 in E. coli produziert wird und daher nicht glycosyliert sein kann, scheint der Kohlenhydratanteil für die in vivo biologische Aktivitat nicht bedeutend zu sein.

Einflüsse der Glycosylierung auf die Pharmakokinetik sowie auf die immunologischen Eigenschaften des Proteins können nicht ausgeschlossen werden. So wurde kürzlich darüber berichtet (Gibbon et al., Lancet, 335, 434-437 (1990), daß 4 von 16 Patienten, die mit rekombinantem humanem GM-CSF (granulocyte- macrophage-colony stimulating factor), der in Hefe produziert worden war, behandelt worden waren, Antikörper gegen dieses Protein entwickelten. Man stellte fest, daß diese Antikörper mit Epitopen reagierten, die in endogenem GM-CSF durch O-Glycosylierung geschützt vorliegen, im rekombinanten Faktor jedoch frei zugänglich sind. In letzter Zeit mehren sich zudem Berichte, daß Patienten, die längere Zeit mit rekombinantem IFN-α2 behandelt wurden, Antikörper dagegen entwickelten (z. B. Figlin & Itri, Semin. Haematil. 25. 9-15 (1988)).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, hochreines natürliches IFN-α2 bereitzustellen.

Gelöst wurde diese Aufgabe durch ein Reinigungs­ verfahren, das keine Verfahrensschritte enthält, die evtl. vorhandene Substitutionen des IFN-α2 verändert oder eliminiert. Das erfindungsgemäße Reinigungs­ verfahren bediente sich hochspezifischer monoklonaler Antikörper, wobei während des gesammten Reinigungsverfahrens alkalische Bedingungen mit einem pH-Wert größer als 8,0 sorgsam vermieden wurden.

Natürliches humanes IFN-α2 wurde mit Hilfe eines hochspezifischen monoklonalen Antikörpers aus Leukozyteninterferon isoliert. Zwei aufeinanderfolgende Reinigungsschritte über eine Immunoaffinitätssäule führten zu einer Reinheit des Proteins von <95%. Übereinstimmend mit früheren Untersuchungen ergab die Sequenzanalyse die erwartete N-terminale Sequenz, wobei CYS als erste Aminosäure nur indirekt nachgewiesen wurde.

Von IFN-α2 sind bisher drei Varianten, die sich in den Aminosäuren an den Positionen 23 und 34 unterscheiden, bekannt: IFN-α2a mit ²³ LYS und ³⁴ HIS (früher als Le IFA bezeichnet; Goeddel et al., Nature, 290, 20-26 (1981)), IFN-α2b mit ²³RG und ³⁴HIS (Streuli et al., Science, 209, 1343-1347 (1980)) und IFN-α2c mit ²³ARG und ³⁴ARG (früher als IFN-α2 "Arg" bezeichnet; Dworkin-Rastl et al., J. Interferon Res.-2, 575-585 (1982); Bodo & Maurer-Fogy, The Biology of the Interferon System 1985 (Stewart II, W. E. & Schellehus H. Hrsg.) 59-64 (1986). Bei dem isolierten Interferon konnte an Position 23 nur ARG nachgewiesen werden, was das Vorhandensein von IFN-α2 ausschließt. Die Aminosäure an Position 34 war eindeutig Histidin, so daß es sich bei dem isolierten Interferon um IFN-α2b handelte. Ebenso sind jedoch auch die Varianten IFN-α2a bzw. IFN-α2c erhältlich je nachdem, welches Zellmaterial als Ausgangsmaterial verwendet wird. Es ist bekannt, daß in Namalwa-Zellen neben IFN-α2b auch IFN-α2c zu finden ist. Bei dem als Vergleichssubstanz verwendeten rekombinanten Interferon aus E. coli handelte es sich um IFN-α2c.

RP-HPLC-Analysen des gereinigten natürlichen IFN-α2 zeigten, daß die Präparation zwei Peaks enthielt, die beide früher von der Säule eluierten als das rekombinante E. coli-IFN-α2c. Auch mittels SDS-PAGE konnte eine starke Heterogenität in der scheinbaren molekularen Masse von natürlichem IFN-α2 nachgewiesen werden. Alle in natürlichem IFN-α2 nachgewiesenen Banden hatten eine wesentlich höhere scheinbare molekulare Masse als rekombinantes IFN-α2c. Da sämtliche bisher beschriebenen IFN-α-Spezies - mit Ausnahme von IFN-α14 - keine N-Glycosylierungsstelle (-ASN-X-THR/SER-) aufweisen und somit auch für IFN-α2 N-Glycosylierung ausgeschlossen werden kann, wurde als naheliegende Erklärung für die höhere molekulare Masse und für die Heterogenität O-Glycosylierung angenommen.

Da O-Glycane schon unter schwach alkalischen Bedingungen vom Protein abgespalten werden konnen, wurden beide Peakfraktionen schwach alkalischen Bedingungen unterworfen. Diese Reaktion führte in beiden Fällen zu einer Reduktion der scheinbaren molekularen Masse auf die des rekombinanten IFN-α2c; ein deutlicher Hinweis auf O-Glykosylierung.

Versuche mit Neuraminidase und O-Glycanase ergaben für den einen Peak (Peak 2) (s. Fig. 3) ebenfalls eine Reduktion der scheinbaren molekularen Masse auf jene von E. coli-IFN-α2c und bestätigten damit die O-Glycosylierung. Die Ergebnisse dieses sequentiellen Abbaues des Glycans mit Neuraminidase und O-Glycanase zeigten, daß die Heterogenität des Peak 2 auf dem unterschiedlichen Gehalt von N-Acethylneuraminsäure (NeuAc = Sialynsäure) beruhte. Die drei Banden (Fig. 9, Spur 4) repräsentierten die di- bzw. monosialylierte (M_r 21,000 bzw. 20,000) und die nichtsialylierte (M_r 19,000) Form des natürlichen IFN-α2. Die leichteste Form des IFN-α2 konnte durch Reaktion mit O-Glycanase allein abgebaut werden. Da O-Glycanase nur das unsubstituierte Disaccharid Gal(β1-3)GalNAc spaltet, ist die Reaktion als Beweis dafür anzusehen, daß neben den beiden sialylierten Formen auch eine Asialo-Variante des IFN-α2 existiert.

Die scheinbare molekulare Masse von Peak 1 hingegen konnte mittels Enzymreaktionen nicht reduziert werden. Inkubation mit Neuraminidase führte nicht wie erwartet zu einer Reduktion der scheinbaren molekularen Masse. Das Disaccharid-Core mußte demnach anders als mit NeuAc substituiert sein und konnte daher nicht durch O-Glycanase abgespalten werden.

Durch Vergleich der Peptide Maps nach Trypsinspaltung von natürlichem und rekombinantem IFN-α2 konnten die Glycopeptide aus den Peaks 1 und 2 identifiziert werden.

Die Sequenzierung dieser Glycopeptide ergab ¹⁰⁶HR als Glycosylierungsstelle. Da keine der anderen IFN-α-Spezies an dieser Stelle THR enthält (Henco et al., J. Mol. Biol. 185, 227-260, (1985)), scheint IFN-α2 als einziger Subtyp an ¹⁰⁶HR O-glycosyliert zu sein.

Hinweise auf die Struktur der Oligosaccharide des natürlichen IFN-α2 gaben neben den Enzymreaktionen auch massenspektrometrische Untersuchungen der Glycopeptide. Die Interpretation der Massenspektren zusammen mit den Ergebnissen der SDS-PAGE ergaben, daß natürliches IFN-α2 zumindest vier verschiedene Glycanstrukturen enthält: im Peak 2 das neutrale Disaccharid Gal(β1-3)GalNAc, dessen Struktur aufgrund der hohen Spezifität der O-Glycanase mit großer Sicherheit anzunehmen ist, außerdem die mono- und die disialylierte Variante; im Peak 1 ein neutrales Oligosaccharid, bestehend aus zwei Hexose- und zwei N-Acetylhexosamin-Einheiten. Die Struktur dieses Tetrasaccharides kann nur in Analogie zu bereits beschriebenen häufiger vorkommenden O-Glycanen vorgeschlagen werden: Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc.

Durch die vorliegende Erfindung konnte überraschenderweise aus teilweise gereinigtem humanen Leukozyteninterferon erstmals O-glycosyliertes IFN-α2 in hochreiner Form bereitgestellt werden. Dieses Interferon ist an der Aminosäure Threonin an Position 106 (¹⁰⁶THR) O-glycosyliert. Die Oligosaccharide, die an dieser Position enthalten sein können, sind das neutrale Disaccharid Gal(β1-3)GalNAc, dessen mono- und disialylierte Varianten sowie ein neutrales Tetrasaccharid Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc.

Dieses O-glycosylierte IFN-α2 kann in an sich bekannter Weise, in Analogie zum rekombinanten IFN-α2, formuliert und in allen, für IFN-α bekannten Indikationen zur Behandlung eingesetzt werden.

Durch die vorliegende Erfindung wird daher erstmals ein O-glycosyliertes Interferon-α2 enthaltendes Mittel bereitgestellt, das aufgrund der antiviralen und antineoplastischen Eigenschaften des IFN-α2 u. a. zur Behandlung von viralen und tumoralen Erkrankungen geeignet ist.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern ohne sie einzuschränken.

Methoden

Interferon Bioassay: Die antivirale Aktivität der IFN Präparationen wurde in einem Assay, der den cytopathischen Effekt (CPE) von Enzephalomycarditis Virus (EMCV) mißt, in Mikrotiterplatten durchgeführt. Als Testzellen werden die A549 humanen Lungencarcinomzellen verwendet. Details dieses Assays sind beschrieben worden (z. B. Adolf, G.R.J. Gen. Virol. 68, 1669-1676 (1987)). Bei jedem Bioassay wurden alle Tritrationen zweimal durchgeführt. Eine Laborstandard- Präparation an rekombinanten humanen IFN-α2c wurde in jedem Assay mitgeführt: die Aktivität dieser Präparation wurde kürzlich durch Vergleich mit der internationalen Referenzpräparation für human IFN-α2, Gxa 01-901-535 ermittelt. Alle beobachteten IFN-Aktivitäten wurden korrigiert im Hinblick auf die übertragene Wirksamkeit dieser Referenzpräparation.

Interferon ELISA: Ein ELISA wurde etabliert der zwei neutralisierende murine IgG MAbs für IFN-α und eine IFN-α2c Laborreferenzpräparation (s. oben) als Standard verwendet. Die Herstellung der Antikörper und ihre Eigenschaften sind beschrieben (Adolf et al. J. Cell Physiol. suppl. 2, 61-68 (1982); Adolf G.R. J. Gen. Virol. 68, 1669-1676 (1987)). Der Antikörper EBI-1 wurde zur Beschichtung der Assay Platten verwendet; der Antikörper EBI-10, kovalent gekoppelt an Meerrettich Peroxidase wurde mit der zu untersuchenden Probe zugegeben. O-Phenylendiamin und Natriumperborat wurden als Substrate für das Enzym verwendet; die Reaktion wurde durch Zugabe von Schwefelsäure unterbrochen und die Absorption des resultierenden Produktes gemessen (492 mm, Referenz 690 mm).

Reinigung des natürlichen human IFN-α2: Eine Affinitätssäule wurde durch Kopplung von 12 mg des monoklonalen Antikörpers, beispielsweise des MAb EBI-10 (gereinigt aus dem Maus-Ascites durch Ammoniumsulfat Präzipitation und Protein G2 Affinitätschromatographie nach Standardmethoden) an 1 g CNBr-aktivierter Sepharose 4B nach den Empfehlungen des Herstellers (Pharmacia) hergestellt. Das endgültige Bettvolumen der Säule betrug annähernd 3 ml. Teilweise gereinigtes human Leukozyteninterferon (Cantell et al. Methods Enzymol. 78, 29-38 (1981); Cantell et al. ibid. 499-512) bei dem der IFN-ω Anteil entfernt worden war (Adolf et al. J. Biol. Chem. 265, 9290-9295 (1990)) und das etwa 2-3 · 10⁶ IU/ml mit einer totalen Protein Konzentration von 2 mg/ml enthielt, wurde mit einer Durchflußrate von 1 ml/Min auf die Säule aufgetragen (200 und 350 ml). Die Säule wurde dann mit 0,1 M Natriumphosphat Puffer pH 7,5 (Puffer A) gewaschen und mit einem Lineargradienten aus Puffer A und Puffer B (0,1 M Natriumcitrat pH 2,1) in einem FPLC-System (Pharmacia) bei einer Durchflußrate von 1 ml/Min eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf IFN-Aktivität mit Hilfe des ELISA geprüft. Entsprechende Fraktionen beider Ansätze wurden gesammelt, mit 1 M NaOH neutralisiert und erneut auf dieselbe Säule aufgetragen, die mit Puffer A reäquilibriert worden war. Dasselbe Elutionsprogramm wurde verwendet. (Durchflußrate 0,25 ml/Min) Entsprechende Fraktionen wurden wieder gesammelt, neutralisiert und in Aliquots eingefroren.

SDS Gelelektrophorese, HPLC-Techniken und Aminosäuresequenzierungen: SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese und Reverse Phase HPLC wurden verwendet um das gereinigte IFN-α2 zu analysieren; sämtliche Methoden sind ausführlich beschrieben worden (Adolf et al., J. Biol. Chem. 265, 9290-9295 (1990)).

Die Bestimmung der N-terminalen Sequenz wurde in einem automatischen Sequenator (Applied Biosystems, Modell 477A) durchgeführt; Aminosäurederivate wurden on-line durch RP-HPLC analysiert (Adolf et al., J. Biol. Chem. 265, 9290-9295 (1990)).

"Mapping" der proteolytischen Peptide

Affinitätsgereinigtes IFN-α2 wurde weiterhin durch Reverse Phase HPLC gereinigt, denaturiert und entsalzt wie bei Adolf et al., J. Biol. Chem. 265, 9290-9295 (1990) beschrieben. Die Peakfraktionen wurden gesammelt und in einem SpeedVac Konzentrierer getrocknet. 29 µg (Peak 1) und 66 µg (Peak 2) Protein wurden in 0,1 ml 1%iger Ammoniumbicarbonatlösung aufgelöst; 0,5 bzw. 1 µg Trypsin (Boehringer Mannheim) in 3 bzw. 6 µl 0,01%iger Trifluoressigsäure wurden zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei 37°C inkubiert. Nach 6 h Inkubationszeit wurde dieselbe Menge Trypsin erneut zugegeben und für weitere 18 h inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde vor der Analyse durch Zugabe von 10 µl 0,5 M Dithiothreitol und 100 µl 6 M Harnstoff 2 h bei Raumtemperatur reduziert. Reverse Phase HPLC wurde auf einer Delta Pak C18 Säule (Waters; 3,9×150 mm; Teilchengröße 5 µm; Porendurchmesser 100°A) bei 30°C unter Verwendung folgender Lösungsmittel durchgeführt: Lösungsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser; Lösungsmittel B: 0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril. Das folgende Gradientenprogramm wurde verwendet (Durchflußrate 1 ml/Min): 0-55 Min: 0-55% B (linearer Gradient); 55-70 Min: 50% B. Detektiert wurden die Peptide durch ihre Absorption bei 214 und 280 nm. Die resultierenden Muster wurden mit denen des rekombinanten aus E. coli stammenden IFN-α2c verglichen. Die Peptide des natürlichen IFN-α2, die sich in ihrem Elutionsverhalten anders verhielten als ihre rekombinanten Counterparts wurden gesammelt und N-terminal sequenziert oder wurden mit Staphylococcus aureus V8 Protease weiter abgebaut (Endopeptidase Glu-C, Boehringer Mannheim). 0,88 µg (Peak 1/I), 2,6 µg (Peak 2/Ia) und 1,5 µg (Peak 2/Ib) der Peptide wurden jeweils in 0,1 ml 25 mM Phosphatpuffer pH 7,8 gelöst. In Wasser gelöste Protease wurde zugegeben (17,5 ng, 52,5 ng bzw. 29 ng) und die Reaktionsmischung wurde bei 37°C inkubiert. Nach 6 h wurden dieselben Mengen Protease erneut zugegeben und 18 h inkubiert. Die Proben wurden daraufhin einer Reverse Phase HPLC Analyse unterzogen (s. oben). Entsprechende Fraktionen wurden gesammelt und N-terminal sequenziert.

Deglykosylierung des IFN-α2: Gereinigtes, denaturiertes und entsalztes IFN-α2 wurde mit Vibro cholerae Neuraminidase (Boehringer Mannheim) (50 mU/ml, 18 h bei 37°C in 20 µl 50 mM Natriumacetat pH 5,5, 4 mM CaCl ) und/oder Endo-α-N-acetyl­ galactosaminidase (Boehringer Mannheim) (100 mM/ml, 18 h bei 37°C im selben Puffer) behandelt. Chemische Eliminierung wurde durch Inkubation in 0,1 M NaOH 20 h bei Raumtemperatur erreicht.

Cf Plasma Desorptions Massenspektrometrie: Massenspektren der tryptischen Peptide wurden auf einem "BIO-ION 20 time-of-flight" Massenspektrometer (BIO-ION Nordec AB, Uppsala, Schweden) gemessen. Die Proben wurden in wäßriger Trifluoressigsäure (0,1%) gelöst und auf Nitrozellulose-beschichtete Targets aufgebracht (BIO-ION). Die spektralen Akkumulationszeiten bewegten sich zwischen 0,5 und 12 h, abhängig von der Ausbeute. Die Spektren wurden gemessen bei einer Beschleunigungsspannung von 17 kV.

1. Reinigung des natürlichen human IFN-α2

Humanes Leukozyten-Interferon, erhalten aus Sendai Virus induzierten humanen peripheren Leukozyten und teilweise gereinigt nach dem Reinigungsverfahren von Cantell et al. (Methods Enzymol 78, 29-38 und 78, 499-512 (1981)), wurde als Ausgangsmaterial für die Isolierung und Reinigung des IFN-α2 verwendet. Durch selektive Affinitätschromatographie mit Anti IFN-ω monoklonalen Antikörper, beispielsweise OMG-4, OMG-5 oder OMG-7 war der Anteil an IFN-ω entfernt worden (Adolf et al. Virology 175, 410-417 (1990); EPA 262 571. Die spezifische antivirale Aktivität betrug 1-2×10⁶ IU/mg; IFN-α mit einer spezifischen Aktivität von 2×10⁸ IU/mg war demnach nur mit etwa 1% des gesamten Proteinanteils vertreten. Zur Reinigung des IFN-α2 von kontaminierenden Fremdproteinen und gleichzeitig von anderen IFN-α Spezies wurden hoch selektive Anti IFN-α2 monoklonale Antikörper verwendet. Diese Antikörper besitzen in standardisierten Neutralisations-Bioassays hohe Spezifität für das IFN-α2 (Adolf G.R. J. Gen. Virol. 68, 1669-1676 (1987)).

Eine Immunoaffinitätssäule wurde hergestellt, indem ein solcher monoklonaler Antikörper, beispielsweise der EBI-10 oder EBI-1 hergestellt z. B. gemäß J. Gen. Virol. 68, 1669-1676 (1987) oder DE 33 06 060.6 an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt wurde. Der Antikörper war aus dem Maus-Ascites durch Ammoniumsulfat Präzipitation und Protein G Affinitätschromatographie nach Standardverfahrensweisen gereinigt worden. Verwendet wurden beispielsweise 12 mg des monoklonalen Antikörpers EBI-10, die an 1g CNBr-aktivierter Sepharose 4B gekoppelt wurden, wobei die vom Hersteller empfohlenen Bedingungen eingehalten wurden (Pharmacia). Das endgültige Bettvolumen der Säule betrug etwa 3 ml.

Die Leukozyten-Interferon Präparation wurde auf die Säule aufgetragen; ungefähr 20% der antiviralen Aktivität wurden gebunden. Die Säule wurde mit einem linearen Puffergradienten aus 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5 und 0,1 M Natriumcitrat pH 2,1 eluiert. Zwei Proteinpeaks konnten im Eluat festgestellt werden (Fig. 1): Fraktion A und Fraktion B. Beide Fraktionen wurden auf ihren Gehalt an IFN-α analysiert, wobei ein "zwei-Seiten ELISA" verwendet wurde, bei dem sowohl EBI-10 als auch EBI-1 verwendet wurde. Beide Antikörper zeigen hohe Spezifität für IFN-α2 (Adolf et al. J. Cell Physiol.suppl. 2, 61-68 (1982)). Rekombinantes IFN-α2c wurde als Standard verwendet. Die Fraktion, die bei niedrigem pH eluiert worden war (Fig. 1, Peak "A"), ebenso wie die Probe ergaben Titrationskurven, die parallel zu der Titrationskurve des rekombinanten IFN-α2C verliefen. Der Durchlauf und Fraktionen des 1. Peaks ("B") ergaben Kurven mit verschiedenen Steigungen; sie konnten daher nicht durch den ELISA quantifiziert werden (Fig. 2), sondern wurden im biologischen Assay überprüft (Tabelle I).

Der niedrige, zur Elution des Peak "A" erforderliche pH, ebenso wie die Ergebnisse des ELISA deuteten darauf hin, daß IFN-α2 ein Hauptbestandteil des Peak "A" war. Um sicherzustellen, daß sämtliches immunreaktives IFN-α durch den Antikörper gebunden worden war, wurde der Durchlauf erneut über die Säule gegeben und wie oben beschrieben ein zweites Mal eluiert. Das eluierte Material ergab weniger als 10% der IFN-Aktivität, die beim ersten Durchlauf gebunden worden war.

Sowohl die Fraktionen "A" als auch "B" wurden getrennt gesammelt, neutralisiert und erneut einer chromatographischen Reinigung auf derselben Affinitätssäule unterzogen. In beiden Fällen wurde mehr als 95% der IFN-Aktivität gebunden; Elution erfolgte an derselben Gradientenposition wie im ersten Zyklus. Ausgangsprodukt, Durchlauf und die gesammelten Fraktionen beider Chromatographien wurden durch Coomassie Blau Färbungsassaays auf ihren Proteingehalt und durch einen antiviralen Bioassay auf ihren IFN-Aktivitätsgehalt hin untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

2. Identifizierung des Affinitäts-gereinigten Protein als IFN-α2

Das Affinitäts-gereinigte IFN-α wurde zunächst durch Reverse Phase HPLC analysiert. Peak "A" zeigte zwei unvollständig aufgelöste Peaks "1" und "2" mit einem Massenverhältnis von etwa 1:2 (Fig. 3 unten); Peak "1" repräsentierte eine mehr hydrophile Proteinfraktion. Beide Peakfraktionen wurden gesammelt, rechromatographiert und einer N-terminalen Aminosäureanalyse unterzogen. Die nachfolgende Sequenz wurde aus beiden Fraktionen erhalten (die Cys-Reste in Klammern wurden nicht identifiziert, sondern auf der Basis der konservierten IFN-Sequenzen abgeleitet:

[¹CYS]-ASP-LEU-PRO-⁵GLN-THR-HIS-SER-LEU-¹⁰GLY-SER-
ARG-ARG-THR-¹⁵LEU-MET-LEU-LEU-ALA-²⁰GLN-MET-ARG-
²³ARG-ILE-²⁵SER-LEU-PHE-SER-[CYS]-³⁰LEU-

Durch Vergleich mit publizierten Sequenzen wurden beide als IFN-α2 identifiziert.

In beiden Peakfraktionen "1" und "2" wurde die Aminosäure an Position 23 eindeutig als Arginin identifiziert; die als LeIFA bezeichnete Variante, die an Position 23 Lysin aufweist (Goeddel et al., Nature, 290, 20-26 (1981)), war demnach in der verwendeten Leukozytenpräparation in nachweisbaren Mengen nicht vorhanden. Die Aminosäure an Position 34 wurde als Histidin identifiziert; das isolierte IFN-α2 war demnach die Variante IFN-α2b.

Die spezifische antivirale Aktivität des natürlichen IFN-α2 bezogen auf die internationale Referenzpräparation für IFNα2, Gxa01-901-535, basierend auf einer Bestimmung des Proteingehaltes der Probe durch dessen Absorption bei 214 nm (Adolf et al., Virology 175, 410-417 (1990), wurde zu 1,5 · 10⁸ IU/mg bestimmt (Mittelwert aus fünf unabhängigen Bioassays).

Bei einem Vergleich der Rententionszeiten des natürlichen IFN-α2 auf der Reverse Phase HPLC mit der des rekombinanten IFN-α2c wurde offensichtlich, daß das rekombinante Protein signifikant früher eluiert wurde (Fig. 3). Die erhöhte Hydrophilität des natürlichen Proteins ebenso wie dessen Heterogenität muß daher mit posttranslationalen Modifikationen zusammenhängen.

Reverse Phase HPLC des Elutionspeaks "B" ergab ein kompliziertes Muster von fünf unvollständig aufgelösten Peaks. Sequenzanalysen ergaben, daß sämtliche Peaks IFN-α Spezies darstellten, keiner jedoch IFN-α2 repräsentierte.

Das durch HPLC-gereinigte IFN-α2 wurde weiterhin durch SDS-PAGE nach Reduktion mit Dithiothreitol analysiert (Fig. 10) . Unter den gewählten Bedingungen zeigte das rekombinante IFN-α2c ein scheinbares Molekulargewicht von 17 500 D (Molekulargewicht ausgehend von der Aminosäuresequenz: 19.287 D) HPLC-Peakfraktion "1" gab ein einziges relativ breites Band (scheinbares Molekulargewicht 20.000 D) während Peakfraktion "2" in zwei Hauptkomponenten (20.000 bzw. 19.000 D) und in eine Nebenkomponente (21.000 D) aufgespalten wurde. Diese Molekulargewichtsunterschiede im Vergleich zum rekombinanten Protein, die Größenheterogenität wie auch die erhöhte Hydrophilizität deuten darauf hin, daß das natürliche IFN-α2 glycosyliert ist. Da keine Erkennungsstelle für eine N-Glycosylierung in der IFN-α2 Struktur vorhanden ist, muß O-Glycosylierung vorliegen.

3. Reaktion von natürlichem IFN-α2 mit Endo- und Exoglycosidasen

Die folgenden Versuche wurden jeweils mit beiden Peaks nach Trennung über RP-HPLC (Peaks 1 und 2 aus Fig. 3) durchgeführt. Beide Proben wurden mit Neuraminidase und anschließend mit O-Glycanase inkubiert. Nach jeder Enzymreaktion wurde ein Aliquot mittels SDS-PAGE untersucht.

Wie in Fig. 5 zu sehen ist, reagierte Peak 1 weder mit Neuraminidase noch mit O-Glycanase. Die scheinbare molekulare Masse blieb mit 20.000 konstant. Die drei Banden des Peaks 2 hingegen reagierten sowohl mit Neuraminidase als auch anschließend mit O-Glycanase. Die Reaktion mit Neuraminidase bewirkte eine Reduktion der scheinbaren molekularen Masse der beiden schwereren Banden (M_r 21,000 und 20,000) auf 19,000. Spuren der Bande mit der scheinbaren molekularen Masse von 20,000 blieben jedoch zurück. Anschließende Inkubation des Proteins mit O-Glycanase führte zu einer weiteren Reduktion der scheinbaren molekularen Masse von 19,000 auf 17,500 (= scheinbare molekulare Masse von E. coli-IFN-α2c). Die Komponente mit M_r 19,000 wurde dabei vollständig abgebaut. Nach wie vor blieben geringe Mengen der Bande mit der scheinbaren molekularen Masse von 20.000 detektierbar. Da die Trennung der beiden Peaks 1 und 2 aus Fig. 3 mittels RP-HPLC nicht vollständig war, ist der nicht spaltbare Anteil der Bande mit M_r 20,000 wahrscheinlich auf eine Verunreinigung des Peaks 2 mit Peak 1 zurückzuführen.

In einem weiteren Versuch wurde Peak 2 mit O-Glycanase inkubiert, ohne zuvor mit Neuraminidase behandelt worden zu sein (O-Glycanase spaltet das Disaccharid Gal(β1-3)GalNAc nur dann vom Protein ab, wenn dieses durch keine weiteren Verbindungen substituiert ist). Das Reaktionsprodukt wurde wieder mittels SDS-PAGE aufgetrennt (Fig. 6). Man erkennt hier deutlich, daß nur die leichteste Komponente des Peaks 2 eine Reduktion ihrer molekularen Masse erfährt (Reduktion von M_r 19,000 auf M_r 17,500). Die scheinbaren molekularen Massen der beiden schwereren Komponenten (M_r 21,000 und 20,000) blieben unverändert.

4. Reaktion von natürlichem IFN-α2 mit 0.1 M NaOH

Da O-Glycosylierungen schon unter milden alkalischen Bedingungen abbaubar sind, wurde versucht, die O-Glycanase-resistente Komponente (Peak 1 aus Fig. 3) mittels Inkubation mit 0.1 M NaOH zu deglycosylieren.

Die Reaktion erfolgte wie oben beschrieben. Gleichzeitig wurde als Kontrolle E. coli-IFN-α2c und Peak 2 unter denselben Bedingungen inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Wie in Fig. 7 ersichtlich ist, wurden die molekularen Massen aller Komponenten von natürlichem IFN-α2 auf die scheinbare molekulare Masse von E. coli-IFN-α2 reduziert. Die Unschärfe der Proteinbanden ist auf die unter den geschilderten Bedingungen geringfügigen Zerstörungen des Proteins zurückzuführen. Auch die Banden im höhermolekularen Bereich (M_r <30,000) traten als Folge der alkalischen Behandlung auf.

5. Identifizierung der Glycopeptide mittels Peptide Mapping

Die beiden Peaks von natürlichem IFN-α2 (Fig. 3) sowie E. coli-IFN-α2c wurden mit Trypsin gespalten, reduziert und über RP-HPLC aufgetrennt. In Fig. 8 sind Ausschnitte der Chromatogramme zu sehen. Zwei Peaks aus dem Peptide Map von E. coli-IFN-α2c fallen dabei wegen ihrer Hydrophobizität (und daher relativ späteren Elution) gegenüber den analogen Peaks aus dem natürlichen IFN-α2 auf: Peak I und Peak II ( im Peptide Map des E. coli-IFN-α2c) wurden deutlich später eluiert als ihre korrespondierenden Peaks 1/I und 1/II vom Peak 1 aus Fig. 3 bzw. Peaks 2/Ia, 2/Ib, 2/IIa und 2/IIb vom Peak 2 aus Fig. 3.

N-terminale Sequenzierung der erwähnten Peaks von natürlichem IFN-α2 sowie der beiden E. coli-Peaks ergab für die Peaks I, 1/I, 2/Ia, 2/Ib (aus Fig. 8) die Sequenz des Peptides von Aminosäure (AS) 84-112 und für die Peaks II, 1/II, 2/IIa, 2/IIb die Sequenz von AS 71-112 (Die Aminosäuresequenz von IFN-α2c ist in Fig. 4 dargestellt). Die unterschiedlichen Retentionszeiten mußten also auf eine Glycosylierung der Peptide aus natürlichem IFN-α2 zurückzuführen sein.

6. Plasmadesorptions Massenspektrometrie der Glycopeptide von natürlichem IFN-α2

Die Peaks 1/II, 2/Ia, 2/IIa und 2/IIb wurden weiterhin mit Hilfe von PD-MS charakterisiert. Die Ergebnisse der Messungen sind in Tabelle II zusammengefaßt. Die Differenz der aus der Aminosäure-Sequenz errechneten molekularen Massen und den tatsächlich erhaltenen molekularen Massen der einzelnen Peptide lassen sich mit unterschiedlichen Glycanstrukturen erklären: Die molekulare Masse des Peptides 1/II, das von der O-Glycanase-resistenten Form des IFN-α2 erhalten wurde, entspricht der molekularen Masse des Peptides (AS 71-112), das mit einem Tetrasaccharid, bestehend aus zwei N-Acetylhexosamineinheiten und zwei Hexoseeinheiten, substituiert ist. In Analogie zu bereits beschriebenen Strukturen solcher O-Glycane dürfte es sich hier um ein Oligosaccharid mit folgender Struktur handeln : Gall-3(Gall-4GlcNAcl-6)GalNAc-.

Peptid 2/Ia wies eine molekulare Masse von 3.975 amu auf, was mit der Substitution des Peptides mit dem Trisaccharid NeuAc-Gal-GalNAc erklärbar ist. Dieselbe Glycanstruktur läßt sich aus der molekularen Masse des Peptides 2/IIa (5.448 amu) ableiten. Für Peptid 2/IIb wurde ein Wert von 5.132 amu gemessen, was einer Glycosylierung mit dem Disaccharid Gal-GalNAc entspricht.

Prinzipiell wiesen alle analysierten Peaks eine um ca. 23 amu erhöhte molekulare Masse auf. Das ist durch Anlagerung von Na⁺-Ionen an das Peptid erklärbar. Diese Verunreinigungen hätten durch intensives Waschen der Targets vor der Messung vermieden werden können, wurden aber im speziellen Fall in Kauf genommen um Verluste der Glycopeptide gering zu halten. Aus den Ergebnissen des Glycosidase-Abbaues (s. oben) und der PD-MS-Messungen können die in Tabelle II angeführten Glycanstrukturen abgeleitet werden. Die kleinen Peaks, die im Bereich der Glycopeptide im Peptide Map zu sehen sind, können von weiteren Glycosylierungsvarianten stammen.

7. Identifizierung der O-glycosylierten Aminosäure mittels Gasphasensequenzierung

Da die durch Spaltung mit Trypsin erhaltenen Glycopeptide zu lang waren, um ihre gesamte Sequenz zu bestimmen, wurden diese Peptide mittels Staphylococcus aureus Protease V8 weiter gespalten und über RP-HPLC aufgetrennt. Mit dem entsprechenden Peptid aus E. coli-IFN-α2c wurde ebenso verfahren. Nach Vergleich der beiden Peptide Maps wurden alle Peptide mit unterschiedlicher Retentionszeit isoliert und sequenziert. Alle enthielten die Aminosäuren 97-112. Während im E. coli-IFN-α2c-Peptid ¹⁰⁶THR nachgewiesen werden konnte, war es in den Peptiden aus natürlichem IFN-α2 nicht nachweisbar. Damit konnte ¹⁰⁶THR als Glycosylierungsstelle identifiziert werden.

Legenden zu den Figuren

Fig. 1 Monoklonale Antikörper Affinitätschromatographie des humanen Leukozyten Interferons.
Fig. 2 ELISA für human IFN-α:
(⚫) Referenzpräparation des rekombinanten human IFN-α2c; (○) Leukozyteninterferon (Ausgangsmaterial) () Durchfluß (∎) eine Fraktion des Eluates A; (▲) eine Fraktion des Eluates B.
Fig. 3 RP-HPLC des natürlichen IFN-α2 (b) und E. coli IFN-α2c (a).
Fig. 4 Aminosäuresequenz des IFN-α2c.
Fig. 5 SDS-PAGE von natürlichem IFN-α2 vor und nach Reaktion mit Neuraminidase und O-Glycanase. (1) Peak 1, unbehandelt; (2) Peak 1, nach Reaktion mit Neuraminidase; (3) Peak 1, nach Reaktion mit Neuraminidase und O-Glycanase; (4) Peak 2, unbehandelt; (5) Peak 2, nach Reaktion mit Neuraminidase; (6) Peak 2, nach Reaktion mit Neuraminidase und O-Glycanase; (7) E. coli-IFN-α2c.
Fig. 6 SDS-PAGE von natürlichem IFN-α2 (Peak 2 aus Fig. 3) vor (1) und nach (2) Reaktion mit O-Glycanase.
Fig. 7 SDS-PAGE von natürlichem IFN-α2 (Peak 1 und 2) und E. coli-IFN-α2c nach Inkubation mit 0.1 M NaOH. (1) E. coli-IFN-α2; (3) Peak 1; (5) Peak 2; unbehandelte Vergleichsproben von Peak 1 (2) und von Peak 2 (4) wurden ebenfalls aufgetragen.
Fig. 8 Vergleichendes Peptide Map von E. coli-IFN-α2c und natürlichem IFN-α2. (1) diese Peaks stammen von unglycosylierten Peptiden, deren Retentionszeit immer gleich war.
Fig. 9 SDS-PAGE von natürlichem IFNα2 und E. coli-IFNα2c. (1) Molekulargewichtsmarker; (2) E. coli-IFNα2c; (3) natürliches IFN-α2, Peak 1 aus Fig. 3; (4) natürliches IFN-α2, Peak 2 aus Fig. 3; Färbung: Coomassie-Blue.
Fig. 10 SDS-PAGE des HPLC gereinigten IFN-α2.

Tabelle I

Reinigung des natürlichen IFN-α2

Claims (11)

1. Humanes IFN-α2, dadurch gekennzeichnet, daß das an Position 106 konservierte Threonin durch Oligosaccharide O-glycosyliert ist.

2. Humanes IFN-α2 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das IFN-α2a, IFN-α2b oder IFN-α2c ist.

3. Humanes IFN-α2 gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligosaccharid das neutrale Disaccharid Gal(β1-3)Gal NAc, dessen mono- oder disialysierte Variante oder das neutrale Tetrasaccharid Gal-(Gal-GlcNAc-)GalNAc ist.

4. Verfahren zur Herstellung von humanem, O-glycosyliertem IFN-α2, dadurch gekennzeichnet, daß

• - humane Leukozyten mit Virus induziert werden,
• - das induzierte Interferon nach der Methode von Cantell teilweise gereinigt wird,
• - das teilweise gereinigte Interferon an eine Immunoaffinitätssäule mit hoch selektiven Anti- IFN-α2 monoklonalen Antikörpern gebunden wird,
• - das gebundene Interferon durch einen linearen Puffergradienten aus Pufferbestandteilen mit einem pH etwa 2 bzw. etwa 7 eluiert wird,
• - das eluierte Protein gesammelt wird und gegebenenfalls,
• - ein zweites Mal über die Immunoaffinitätssäule gereinigt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Anti-IFN-α2 monoklonaler Antikörper der EBI-10 oder dessen Analoga verwendet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein linearer Puffergradient aus 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5 und 0,1 M Natriumcitrat, pH 2,1 verwendet wird.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß durch selektive Affinitätschromatographie mit Anti-IFN-ω monoklonalen Antikörpern der INF-ω Anteil aus dem teilweise gereinigten Interferon entfernt wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß OMG-4, OMG-5 oder OMG-7 als Anti-IFN-ω monoklonale Antikörper verwendet werden.

9. Humanes IFN-α2 herstellbar nach einem der Ansprüche 4 bis 8.

10. O-glycosyliertes IFN-α2 enthaltendes Mittel zur Behandlung von viralen oder tumoralen Erkrankungen.

11. Mittel gemäß Anspruch 9, daurch gekennzeichnet, daß es aus einer Mischung aus mindestens zwei der O-glycosylierten IFN-α2a, IFN-α2b oder IFN-α2c besteht.