CZ330992A3 - Thrombin and process for preparing thereof - Google Patents

Description

Vynález se týká thrombinu lidského nebo zvířecího původu, stejně jako způsobu jeho výroby a jeho použití.

Dosavadní stav techniky

Při srážení krve probíhá řada po sobě následujících reakcí, při kterých jsou aktivovány faktory srážení krve a nakonec se účinkem aktivovaného prothrombinu (thrombinu) na fibrinogen tvoří fibrin. Reakce prothrombinu na thrombin probíhá sama s faktorem Xa a vápníkem velmi pomalu. Tato reakce probíhá optimálně teprve poté, kdy je k dispozici opět komplex několika faktorů (prothrombinázový komplex). K tomuto komplexu kromě faktoru Xa náleží faktor V, fosfolipidy a vápník. Faktor Xa štěpí molekulu prothrombinu (molekulová hmotnost 68 kD) proteolyticky a tím vytváří aktivní enzym thrombin (molekulová hmotnost 30 kD).

Plasmová proteáza thrombin je vícefunkční enzym, který není koagulován pouze štěpením fibrinogenu na fibrin, nýbrž také aktivován srážecími faktory V, VIII a XIII a štěpen svým vlastním proenzymem (prothrombinem).

V terapii je thrombin sám nebo společně s fibrinogeny používán k zastavení krvácení nebo v chirurgii k spojováni tkání lepicí technikou.

Aktivace prothrombinu přes prothrombinázový komplex je ex šitu obtížně napodobitelná, a proto nechyběly pokusy připravit thrombin působením proteázy lidského nebo zvířecího původu. Přitom je známo, že se má vyhnout každému kontaktu produktu s materiálem lidského nebo zvířecího původu, aby se zmenšilo nebezpečí kontaminace látkou způsobující infekci.

Pokusy zpracovat prothrombinové komplexy izolované^ z plasmy s vápenatými iony, stejně jako s vápenatými ior)y a suspenzí obsahující hovězí thromboplastin ukazují, že zpracováni se samotnými vápenatými iony vede k podstatnému snížení výtěžku a čistoty vzniklého thrombinu, jako při zpracování s vápenatými ioňy a thromboplastinem (Cryobiology, 21, 661-663 /1984/).

Z DE-A 38 43 126 je známo, že z plasmy, která je adsorbována na základní hmotě a zpracována s prothrombinovým aktivátorem, se může dostat thrombin. Jako aktivátor se mohou například uvést vápenaté ionřy, vápenaté ioňy a thromboplastin nebo faktor Xa. ' Během aktivace jsou přítomny všechny biologické kofaktory, které jsou rovněž vázány na základní hmotu.

Při použití plasmatického prothrombinu k získání thrombinu vzniká nebezpečí kontaminace infekčními látkami (například viry hepatitidy nebo HIV). Kromě toho dochází ještě k tomu, že při obecně známém způsobu aktivace je vedle ionu dvojmocného vápníku doporučeno dodatečné použití biologických kofaktorů, čímž jsou dány další zdroje kontaminace.

Nyní je sice známo, že infekční látky v biologických preparátech se mohou spolehlivě inaktivovat působením tepla, zvláště v kombinaci s ošetřením parou (AT-B 385 657). Přitom se však ukázalo, že thrombin na základě své tepelné nestálosti se musí zahřívat v přítomnosti stabilizátorů (DE-A

09 991), aby se aktivita thrombinu nepoškodila. Použití stabilizátorů je však sporné, protože se během působeni tepla ochrání nejen aktivita thrombinu, nýbrž se také stabilizují viry.

Úkol vynálezu je poskytnout thrombin, který je bezpečný proti virům.

Podstata vynálezu

Thrombin bezpečný proti virům se dá získat z plasmových frakcí obsahujících prothrombin s inaktivovanými viry připojenou aktivací solemi aktivními při srážení, například vápenatými, strontnatými nebo zinečnatými iony. Takové soli podporují tvorbu thrombinu z odpovídajících srážecích faktorů.

Vynález spočívá na poznatku, že infikující látky, které jsou přítomny v plasmatickém prothrombinu, se mohou stát neškodné zpracováním prothrombinu k inaktivaci virů, aniž by se biologická aktivita thrombinu získaného z prothrombinu v podstatě poškodila.

S překvapením bylo nalezeno, že aktivace samotné frakce obsahující prothrombin s inaktivovanými viry přídavkem solí aktivujících sráženi vede jednoduchým způsobem k vyššímu výtěžku nebo čistotě produktu, bez dalšího přídavku biologického kofaktoru, jako jsou srážecí faktory V, Xa nebo fosfolipidy. Kontaminace během aktivace se také zmenší, pokud je též připravovaný thrombin, stejně jako výchozí materiál, zabezpečen proti virům.

Jako výhodné se ukazuje připravovat thrombin zabezpečný proti virům z prothrombinového komplexu s inaktivovanými viry, zvláště z aktivovaného prothrombinového komplexu s inaktivovanými viry. Aktivace aktivovaného prothrombinového komplexu probíhá přídavkem solí aktivujících srážení překvapivě vyšší reakční rychlostí. Výtěžek thrombinu se rovněž optimalizuje.

Zvláště výhodná je výroba thrombinu zabezpečeného proti virům z FEIBA. Aktivovaný prothrombinový komplex nebo FEIBA se mohou připravit pomocí již známých opatření (AT-B 350 726, AT-B 368 883 a EP-B 0 041 173) z prothrombinového komplexu.

Vynález se také týká způsobu výroby thrombinu zabezpečného proti virům, který spočívá v tom, že se kombinují opatření

- připraví se aktivovaný prothrombinový komplex z plasmová frakce obsahující prothrombin,

- aktivovaný prothrombinový komplex se zpracuje k inaktivaci infekčních látek a

- přidají se soli aktivující srážení, pro zpracování aktivovaného prothrombinového komplexu, aby se připravil thrombin.

Thrombin se s výhodou dále čistí ionÉměničovou chromatografií a/nebo afinitní chromatografií.

Využitelnost

Thrombin zabezpečený proti virům podle svrchu uvedeného popisu se hodí zvláště pro použití ve farmaceutických přípravcích a k výrobě diagnostických prostředků.

Příklady provedeni vynálezu

Dále uvedené příklady ještě blíže objasňují vynález, přičemž příklady 3 a 4 se týkají dalšího čistění thrombinu připraveného podle příkladu 1.

Příklad 1 litrů lidské krevní plasmy, ochuzené o sraženinu odstraněnou kryoskopickým technickým postupem, se uvede do styku s prothrombinem (faktor II) a kromě toho srážecími faktory VII, IX a X na ionÉměničové pryskyřici (DEAE-Sephadex). Po eluování frakcí obsahujících faktor II pomocí 0,5-molárního roztoku chloridu sodného se sníží v tomto roztoku koncentrace chloridu sodného na 0,15 mol/1 diafiltrací a nakonec se provede lyofilizace.

Aby se případně obsažený původce nemoci inaktivoval, tato frakce se zahřívá podle návodu daného v AT-B 385 657 po dobu 10 hodin na teplotu 60 °C a po dobu jedné hodiny na teplotu 80 ’C. Aktivita prothrombinu činí 5250 jednotek. Prothrombin se rozpustí na roztok obsahující 2,5 jednotek na mililitr a pomalu míchá s 2,5 mmol/1 chloridu vápenatého za teploty +30 C při hodnotě pH 7,0. Po 80 minutách se stanoví aktivita thrombinu (pomocí chromogenního substrátu Th-1 firmy IMMUNO AG, Vídeň/) 48 jednotek na 1 jednotku faktoru

II.

Ochlazením na teplotu +4 ’C a přídavkem kyseliny ethylendiaminotetraoctové (EDTA) se zastaví tvorba thrombinu

Pomocí ultrafiltrace a/nebo diafiltrace za použití ultrafiltrační membrány (velikost pórů 10 000) se odstraní vápenatý komplex. Nakonec se koncentrát upraví na farmaceutický přípravek.

Příklad 2 ml roztoku obsahujícího FEIBA (firmy IMMUNO AG, Vídeň) s aktivitou FEIBA 966 jednotek a 992 jednotkami faktoru II se zředí 0,9% roztokem chloridu sodného na 330 ml a pomalu míchá s 2,75 mmol/1 chloridu vápenatého za teploty +30 ’C. Po 90 minutách dosahuje aktivita thrombinu maxima 51 jednotek na 1 jednotku faktoru II. Aktivace se zastaví ochlazením roztoku na teplotu +4 Ca přídavkem citronanu sodného.

Příklad 3

Thrombin o aktivitě 20 000 jednotek, připravený podle příkladu 1, se adsorbuje na sloupci 20 ml S-sefarózy při vodivosti 10,5 mS/cm a při hodnotě pH 6,0. Nakonec se vše promyje 140 ml 150-milimolárního roztoku chloridu sodného, aby se odstranily nevázané proteiny.

Frakce obsahující thrombin se eluují 100 ml 750-milimolárního roztoku chloridu sodného, zkoncentrují, diafiltrují a nakonec upraví na farmaceutický přípravek.

Výtěžek aktivity thrombinu je větší než 90 %.

Příklad 4

Thrombin o aktivitě 10 000 jednotek, připravený podle příkladu 1, se vnese na sloupec 10 ml lysin-sefarózy ekvilibrovaný 150-milimolárním roztokem octanu sodného, o hodnotě pH 6,7. Naplněný sloupec se promyje stejným pufrem a frakce obsahující thrombin se eluují 300-milimolárním roztokem lysinu.

Aktivita thrombinu je 9400 jednotek a specifická aktivita činí 1850 jednotek na mg proteinu.

tWDz. V&O 2ČKA ·'<?' ·: .-·;, ·; i

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Thrombin zabezpečený proti virům, lidského nebo zvířecího původu, vyrobitelný z plasmových frakcí obsahujících prothrombin s inaktivovanými viry, připojenou aktivací solemi aktivujícími srážení.
2. 2. Thrombin podle nároku 1, vyrobitelný z plasmových frakcí, které obsahují prothrombinový komplex.
3. 3. Thrombin podle nároku 1, vyrobitelný z plasmových frakcí, které obsahují aktivovaný prothrombinový komplex.
4. 4. Thrombin podle nároku 1 nebo 2, vyrobitelný z plasmových frakcí, které obsahují FEIBA.
5. 5. Farmaceutický přípravek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje thrombin podle nároků 1 až 4.
6. 6. Způsob výroby thrombinu zabezpečného proti virům, vyznačující se tím, že zahrnuje kombinaci spočívající v tom, že se

   - připraví aktivovaný prothrombinový komplex z plasmové frakce obsahující prothrombin,

   - aktivovaný prothrombinový komplex zpracuje k inaktivaci s infekčních látek a

   - přidají soli aktivující srážení, pro zpracování aktivovaného prothrombinového komplexu, aby se připravil thrombin.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se thrombin dále čistí iontoměničovou chromatografií a/nebo afinitní chromatografií.
8. 8. Použití thrombinu podle nároků 1 až 4 pro přípravu farmaceutických přípravků a pro přípravu diagnostických prostředků.