CZ303771B6 - Antitumorové protilátky, proteiny a jejich pouzití - Google Patents

Abstract

Izolovaná protilátka DMF 10.62.3 produkovaná hybridomovou linií ATCC c. PTA-377, která se váze k 40 DA proteinu, který je exprimován na tumorech, ale není exprimován na normálních adultních hemopoetických bunkách. Humanizované a chimerické protilátky odvozené od protilátky DMF 10.62.3. Zpusoby produkce a pouzití takových protilátek.

Description

Antitumorové protilátky, proteiny ajejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se vztahuje k protilátkám a k proteinům, k nimž se tyto protilátky specificky váží, k metodám jejich výroby a k použití takovýchto protilátek, které se specificky váží k tumorovým buňkám.

Dosavadní stav techniky

Buněčná linie E710.2.3, je klonovaná buněčná linie CD4-CD8 myšího T lymfomu, původně izolovaná z tumoru thymu AKR/J myší. Pokud je E710.2.3. kultivována sama při nízké hustotě, nedochází k její spontánní proliferaci, dokud není stimulována forbol-12-myristát-l3-acetátem (PMA). E710.2.3. může být stimulována k proliferaci kontaktem s buňkami sleziny nebo thymu. Pokud je tato linie kultivována při vysoké hustotě, proliferuje spontánně i v nepřítomnosti PMA nebo jiných buněk. Kdyžje E710.2.3. injikována do syngenních myší, roste jako maligní tumor v lymfatíckých orgánech a v thymu.

Podstata vynálezu

Tento vynález je založen na objevu monoklonálních protilátek, které se specificky váží k 40 kD proteinu, syntetizovanému na povrchu četných typů tumorových buněk, ale ne k normálním dospělých hematopoetickým buňkám. Tyto nové monoklonální protilátky mohou blokovat proliferaci a indukovat apoptózu tumorových buněk, ke kterým se specificky váží.

Předmětem vynálezu je izolovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment, vybraná z:

protilátky produkované hybridomovou buněčnou linií ATCC č. PTA-377, kde uvedenou protilátkou je DMF 10.62.3;

chimérické protilátky mající konstantní oblasti lidského lehkého a těžkého řetězce a variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce protilátky DMF 10.62.3; a humanizované protilátky mající oblasti určující komplementaritu (CDR) protilátky DMF 10.62.3.

Monoklonální protilátky nebo jejich antigen-vážící fragmenty podle vynálezu se (a) váží k fetálním thymocytům, (b) inhibují buněčnou proliferaci vazbou na tyto buňky a (c) neváží se na adultní thymocyty. Tyto monoklonální protilátky mohou také po jejich navázání se na buňky indukovat homotypickou agregaci těchto buněk, indukovat apoptózu v buňce, na kterou se váží, a mohou se specificky vázat na jednu nebo více tumorových buněčných linií ze skupiny E710.2.3., RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat a Cos. Tyto protilátky mohou být označeny, např., detekovatelnou značkou.

Příkladem je monoklonální protilátka DMF 10.62.3., produkovaná buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-377, monoklonální protilátka DMF 10.167.4, produkovaná buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-404.

Tyto monoklonální protilátky se váží ke stejnému proteinu, jako je protein vázaný monoklonální protilátkou produkovanou buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-377, buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-405 nebo buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA^104. Tato monoklonální protilátka může být humanizována.

V jiném ohledu se tyto monoklonáíní protilátky specificky váží k proteinu 40 kDa, který je vázaný monoklonáíní linií hybridomu ATCC No. PTA-405 nebo buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-404.

Výhodné je chimérní monoklonáíní protilátky nebo jejich antigen vážící fragmenty, které se váží ktomu samému proteinu, jako je protein vázaný monoklonáíní protilátkou produkovanou buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-377, buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-405 nebo buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-404, kde uvedené chimérické protilátky zahrnují jiné než lidské variabilní a lidské konstantní oblasti lehkých a těžkých řetězců.

V úvahu připadají i monoklonáíní protilátky nebo jejich antigen vážící fragmenty, které se váží ke stejnému epitopu, jako je epitop vázaný monoklonáíní protilátkou produkovanou buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA-377, buněčnou linií hybridomu ATC No. PTA-405 nebo buněčnou linií hybridomu ATCC No. PTA 404.

Monoklonáíní protilátky nebo jejich antigen vážící fragmenty podle vynálezu se specificky váží k proteinu charakterizovanému (i) molekulovou hmotností 40 kDa, (ii) expresí na povrchu fetálních thymocytů, ale ne (iii) na povrchu adultních thymocytů a schopností po navázání protilátek (iv) blokovat proliferaci buněk a (v) indukovat hemotypickou agregaci. Tato monoklonáíní protilátka se specificky váže na protein, který je dále charakterizován (vi) schopností indukovat apoptózu v buňce po navázání protilátky a (vii) expresí na povrchu skupiny tumorových buněk sestávající zE710.2.3., RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat a Cos.

Tento vynález dále představuje antigen vážící fragmenty zde popsaných monoklonálních protilátek. Tyto antigen vážící fragmenty mohou být značeny, např. detekovatelnou značkou.

Tento vynález také představuje hybridomové buněčné linie, které produkují zde popsané monoklonální protilátky. Tento vynález např. uvádí hybridomovou buněčnou linii ATCC No. PTA377, hybridomovou buněčnou linií ATCC No. PTA-405 nebo buněčnou linii hybridomu ATCC No. PTA-404.

Tento vynález dále představuje v podstatě čistý protein charakterizovaný (i) molekulární hmotností 40 kDa, expresí (ii) na povrchu fetálních thymocytů a ne (iii) na povrchu adultních thymocytů, (iv) schopností blokovat proliferaci buněk po navázání zde popsaných protilátek a (v) schopností indukovat hemotypickou agregaci po navázání zde popsaných protilátek. Tento protein může být dále charakterizován (vi) expresí na skupině tumorových buněk sestávající zE710.2.3., RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP3027, 293T, 143Btk, Jurkat a Cos a (vii) schopností indukovat apoptózu v buňce po navázání zde popsané protilátky.

V jiném aspektu tento vynález představuje v podstatě čisté proteiny, které se vážou na monoklonální protilátku produkovanou hybridomovou buněčnou linii ATCC No. PTA-377, hybridomovou buněčnou linii ATCC No. PTA-405 nebo buněčnou linii hybridomu ATCC No. PTA404.

Tento vynález také zahrnuje farmaceutickou kompozici obsahující zde popsanou monoklonáíní protilátku a farmaceuticky přijatelný nosič. Tento vynález dále představuje metodu detekce tumorové buňky v objektu. Tato metoda zahrnuje kontakt buněčného vzorku subjektu s jednou nebo více zde popsanými protilátkami a detekci vazby této protilátky k tomuto vzorku, přičemž vazba indikuje přítomnost tumorové buňky v tomto subjektu. Příklady tumorových buněk zahrnují lymfom thymu, tumor T-buněk, lymfom B-buněk, melanom, osteosarkom a akutní leukémii Tbuněk. Tato tumorová buňka může také být v pacientovi. Uvedené monoklonáíní protilátky použité pro detekci tumorů mohou být značeny.

-2CZ 303771 B6

Tento vynález také představuje metodu inhibice proliferace tumorových buněk. Tato metoda zahrnuje kontakt tumorové buňky s takovým množstvím zde popsané monoklonální protilátky, kteréje dostatečné pro inhibicí proliferace této tumorové buňky.

V jiném uspořádání také tento vynález představuje metodu indukce apoptózy v buňce. Tato metoda zahrnuje kontakt této buňky s množstvím jedné nebo více monoklonálních zde popsaných protilátek, které dostačuje k indukci apoptózy v této buňce. Tato buňka může být tumorová buňka vybraná ze skupiny lymfom thymu, tumor T-buněk, lymfom B-buněk, melanom, osteosarkom a akutní leukemie T-buněk. Tato buňka může být in vitro nebo in vivo.

Tento vynález také zahrnuje kit pro diagnosu tumoru, obsahující jednu nebo více zde popsaných monoklonálních protilátek a návod pro jeho použití. Tento kit může obsahovat tumorovou buňku vybranou ze skupiny sestávající z lymfomu thymu, tumoru T-buněk, lymfomu B-buněk, melanomu, osteosarkomu a akutní leukemie T-buněk. Tento vynález také zahrnuje činidlo zacílené na tumorovou buňku a obsahující jednu nebo více zde popsaných monoklonálních protilátek, které mohou být konjugovány s nějakou částí, za účelem dopravení této části do tumorové buňky. Příklady částí zahrnují antitumorová činidla, cytotoxiny, cytokiny nebo signální skupiny.

Jiným uspořádáním tohoto vynálezu je metoda selektivního doručení nějaké části do tumorové buňky savce. Tato metoda zahrnuje podávání zacíleného, zde popsaného činidla s navázanou částí tomuto savci a ponechání dostatečné doby k tomu, aby zmíněné zacílené činidlo mohlo dosáhnout tumorovou buňku, čímž dojde k navázání protilátky obsažené v cíleném činidlem na tumorovou buňku a v důsledku toho k selektivnímu doručení uvedené části do tumorové savčí buňky. Příklady částí zahrnují antitumorová činidla, cytotoxiny, cytokiny nebo signální skupiny.

Tento vynález dále obsahuje metodu izolace zde popsaného proteinu 40 kDa. Tato metoda zahrnuje kontakt vzorku obsahujícího tento protein s monoklonální, zde popsanou protilátkou po dobu a za podmínek nutných pro tvorbu komplexů monoklonální protilátky s proteinem, oddělení jednoho nebo více těchto komplexů, pokud existují, ze vzorku a oddělení tohoto proteinu z uvedeného komplexu, čímž je tento protein izolován.

Termín „izolovaná sekvence nukleové kyseliny“ je sekvence nukleové kyseliny, která je v podstatě prostá genů, které jsou po jejích stranách v přirozeně se vyskytujícím genomu daného organizmu. Tento termín tudíž zahrnuje sekvenci rekombinantní nukleové kyseliny inkorporovanou do vektoru, do autonomně se replikujícího plazmidů nebo viru nebo do sekvence genomové nukleové kyseliny prokaryontů nebo eukaryontů. Zahrnuje také separátní molekuly jako je cDNA, fragment nějakého genomu, fragment produkovaný polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) nebo restrikční fragment.

Protilátka, který se „specificky váže“ k proteinu, je taková, která se váže k nějakému proteinu, ale která nerozpozná a tudíž se neváže k jiným molekulám v nějakém, např., biologickém vzorku, který přirozeně tento protein, např., 40 kDa protein, obsahuje.

„Konzervativní“ aminokyselinové substituce jsou substituce, při kterých je jeden aminokyselinový zbytek nahrazen druhým aminokyselinovým zbytkem, který má podobný postranní řetězec. Skupiny aminokyselinových zbytků s podobnými postranními řetězci jsou v oboru dobře známy. Tyto skupiny zahrnují aminokyseliny s bazickými postranními řetězci (např. lysin, arginin, histidin), kyselými postranními řetězci (např. kyselina asparagová a glutamová), nenabitými polárními postranními řetězci (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin a cystein), nepolárními postranními řetězci (např. alanin, valin, leucin, isolucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), beta-větvenými postranními řetězci (threonin, valin, isolucin) a aromatickými postranními řetězci (např., tyrosin, fenylalanin, trypofan a histidin). V rámci dané skupiny může být libovolný člen této skupiny použit k náhradě a bude se jednat o konzervativní substituci. Termíny „polypeptid, peptid a protein“ jsou zde používány zcela zaměnitelně a popisují řetězec aminokyselinových zbytků.

-3 CZ 303771 B6 „Antigen vážící fragment“ protilátky je část této protilátky, která je schopna vazby na epitop antigenu, např., 40 kDa proteinu, který je vázaný celou protilátkou.

„Epitop“ je zvláštní oblast antigenu, např., protein, ke kterému se protilátka váže a která je schopna vyvolání imunitní odpovědi.

„V podstatě čistý“ 40 kDa protein je 40 kDa protein, který je hmotnostně nejméně ze 60 % prostý těch proteinů a přirozeně se vyskytujících organických molekul, s kterými je přirozeně asociován. Je lépe, když tento přípravek je hmotnostně ze 75 %, ještě lépe ze 90 % a nejlépe z 99 % tvořen 40 kDa proteinem. V podstatě čistý 40 kDa protein lze získat například afínitní chromatografií při použití zde popsaných protilátek nebo monoklonálních protilátek a eventuelně fyzikálními purifikačními technikami.

„Izolovaná“ protilátka je protilátka, která je v podstatě prostá ostatních přirozeně se vyskytujících organických molekul, se kterými je přirozeně spojena.

Protilátka nebo jiné molekuly, které blokují proliferaci, jsou takové, které inhibují buněčný cyklus, dělení neb obojí.

„Homotypickou agregací“ je míněn biologicky aktivní proces, při kterém jsou buňky stejného typu stimulovány ke vzájemné adhezi.

„Signální skupina“ je molekula nebo sloučenina, která má fyzikální nebo chemickou charakteristiku, jako je luminiscence, fluorescence, enzymatická aktivita, elektronová hustota nebo radioaktivita, která může být snadno měřena a detekována vhodným detekčním systémem nebo postupem.

Pokud není definováno jinak, jsou všechny zde použité technické a vědecké termíny používány ve stejném významu, jako jsou chápány odborníkem v oblasti, do které tento vynález patří. Přesto, že pro realizaci nebo testování tohoto vynálezu mohou být použity materiály a metody podobné nebo ekvivalentní zde popsaným, jsou níže uvedeny vhodné metody a materiály. Všechny publikace, patentové přihlášky, patenty ajiné zde uvedené odkazy jsou zde začleněny vjejich celistvosti citací. V případě sporu bude předkládaná specifikace, včetně definic, kontrolována. Navíc, materiály, metody a příklady jsou pouze pro ilustraci a nejsou myšleny jako jakákoliv omezení. Tento vynález zahrnuje protilátky, které rozpoznají 40 kDa protein, který je exprimován na tumorových buňkách. Tyto protilátky mohou být použity pro inhibici proliferace tumorových buněk a indukci apoptózy tumorových buněk, ke kterým se specificky váží. Tyto monoklonální protilátky mohou být použity diagnosticky (např. pro určení přítomnosti maligních buněk) nebo terapeuticky pro léčbu tumorových buněk prostřednictvím jich samých nebo přenosem na ně připojených antitumorových činidel do těchto buněk.

Ostatní uspořádání nebo výhody tohoto vynálezu budou zřejmá z následujícího detailního popisu a z patentových nároků.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky 1A-D jsou čtyři cytometrické grafy ukazující expresi 40 kDa proteinu na E710.2.3 (obr. ΙΑ), A20 (obr. IB), Jurkat (obr. IC) a RF33.70 (obr. ID) na základě detekce DMF 10.62.3.

Obrázky 2A-D jsou čtyři cytometrické grafy ukazující expresi 40 kDa proteinu v 14 denním fetálním thymu (obr. 2A), celkové dospělé slezině (obr. 2B), celkovém dospělém thymu (obr. 2C) a celkové dospělé kostní dřeni (obr. 2D), na základě detekce DMF10.62.3.

-4CZ 303771 B6

Obrázky 3A-G je sedm cytometrických grafů ukazujících expresi 40 kDa proteinu v nestimulovaných, čerstvě odebraných T a B buňkách (obrázek 3A), aktivovaných T buňkách po 24 hodinách (obrázek 3B), aktivovaných T buňkách po 48 hodinách (obr. 3C), aktivovaných T buňkách po 72 hodinách (obr. 3D), aktivovaných slezinných B buňkách po 24 hodinách (obr. 3E), aktivovaných B buňkách po 48 hodinách (obr. 3F) a aktivovaných slezinných buňkách po 72 hodinách (obr. 3G), na základě detekce DMF 10.62.3.

Obrázky 4A-C jsou tři liniové grafy ukazující inhibici spontánní proliferace E710.2.33. buněk (obr. 4A), RMA-S buněk (obr. 4B) nebo RF33.70 buněk (obr. 4C), podle monoklonální protilátky DMF10.62.3.

Obrázky 5A-I představují devět cytometrických grafů ukazujících indukci apoptózy v E710.2.3 buňkách ovlivněných 1 pg/ml DMF 10.62.3 po 1 hodinu (obr. 5A), 1 pg/ml DMF 10.62.3 po 2 hodiny (5B), 1 pg/ml DMF 10.62.3 po 3 hodiny (5C), IgG křečka po 3 hodiny (5D), 15 pg/ml DMF10.62.3 po 1 hodinu (5E), 15 pg/ml DMF10.62.3 po 2 hodiny (obr. 5F), 15 pg/ml DMF 10.62.3 po 3 hodiny (obr. 5G), IgG křečka po 3 hodiny (obr. 5H) a žádnou protilátkou (obr. 51).

Detailní popis

Předkládaný vynález uvádí protilátky, např., monoklonální protilátky, které se specificky váží k 40kDa proteinu. Tento 40 kDa protein je nový povrchový protein exprimovaný na různých typech tumorových buněk včetně lymfomu thymu, tumoru T-buněk, lymfomu B-buněk, melanomu, osteosarkomu a akutní leukemie T-buněk a v různých biologických druzích, včetně člověka, opic a myší. Tyto protilátky nereagují s normálními adultními hemopoetickými buňkami. Po navázání protilátky podle tohoto vynálezu na buňku, která exprimuje 40 kDa protein, přestane tato buňka proliferovat a přechází do apoptózy. Tento nový 40 kDa protein je protein indukující zánik buňky, založený na pozorování, že pokud se monoklonální protilátka naváže na tento protein na buňce, přechází tato buňka do apoptózy.

Tři hybridomové buněčné linie, které produkují monoklonální protilátky vážící se specificky na 40 kDa protein, byly uloženy v ATCC pod přístupovým číslem PTA-377 (DMF10.62.3), PTA-405 (DMF 10.167.4) nebo PTA-404 (DMF 10.34.36).

Tyto popsané protilátky mají různá použití. Mohou být použity v in vitro diagnostických postupech pro zjištění přítomnosti maligních buněk u savců, např., u člověka, v tkáních. Tyto protilátky mohou být také použity pro lokalizaci tumoru in vivo podáním zde popsané izolované protilátky, značené signální skupinou, subjektu. Tyto protilátky mohou také mít terapeutická použití. Tyto protilátky mohou být navíc použity pro léčbu tumorů nebo cílený přenos antitumorového činidla.

Metody přípravy protilátek

Protilátky jsou imunoglobulinové molekuly a imunologicky aktivní části molekul imunoglobulinu. Příklady fragmentů imunoglobulinových molekul zahrnují fragmenty protilátek, např., F(ab) a F(ab')₂ části, které se specificky váží k proteinu 40 kDa. Fragmenty lze připravit ovlivněním protilátky enzymem, např. pepsinem. Termín monoklonální protilátka nebo monoklonální protilátková kompozice se vztahuje k populaci protilátkových molekul, které obsahují pouze jeden druh vazebných míst pro antigen, schopných imunitní reakce s určitým epitopem polypeptidu nebo proteinu. Monoklonální protilátková kompozice tedy typicky vykazuje jednoduchou vazebnou afinitu vůči tomu proteinu, ke kterému se specificky váže.

-5 CZ 303771 B6

Imunizace

Vznik polyklonálních a monoklonálních protilátek proti 40 kDa proteinu může být vyvolán imunizací vhodného subjektu (např. králík, koza, myš nebo jiný savec) imunogenním preparátem, který obsahuje vhodný imunogen. Imunogeny obsahují buňky, jako např. buňky z usmrcených buněk linií E710.2.3., RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat a Cos. Buňky všech těchto linií exprimují nový 40 kDa protein.

Obdobně může tímto imunogenem být i sám purifikovaný nebo izolovaný protein 40 kDa. Například, monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií uloženou v ATCC pod č. PTA-377, ΡΤΛ-405 nebo PTA-404. může použita pro izolaci proteinu z buňky, která produkuje tento protein, např. E710.2.3., RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEH1-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat a Cos, použitím afínitní chromatografie, imunoprecipitace nebo jiných technik, které jsou dobře známy v oboru.

Tyto protilátky, vzniklé v subjektu mohou být skrínovány pro určení vazby protilátek k fetálním thymocytům a nikoliv kadultním thymocytům. Takové protilátky mohou být dále testovány, jestli: inhibují proliferaci buněk, ke kterým se váží; indukují homotypickou agregaci buněk; eventuelně indukují apoptózu v buňkách, ke kterým se váží. Vhodné metody identifikace protilátky s požadovanými charakteristikami jsou zde uvedeny. Například, schopnost protilátky indukovat buněčnou smrt po navázání na buňku může být testována použitím dostupných kitů od R&D (Minneapolis, MN) nebo Pharmingen (San Diego, CA).

Dávkové množství imunogenu (např., purifikovaného proteinu, tumorových buněk vylučujících tento protein nebo rekombinantně exprimovaného 40 kDa proteinu) a režim imunizace bude záviset na subjektu, který má být imunizován, jeho imunitním stavu a hmotnosti těla subjektu. Pro zvýšení imunitní odpovědi subjektu může být imunogen podáván s adjuvantem, jako např. Freundovým kompletním nebo nekompletním adjuvantem. Imunizace subjektu imunogenem, jak je popsáno shora, indukuje polyklonální protilátkovou odpověď. Titr protilátek v imunizovaném subjektu může být sledován v průběhu doby standardními technikami, jako je ELISA používající imobilizovaný antigen, např., zde popsaný 40 kDa protein.

Ostatní metody indukce protilátek proti proteinu 40 kDa zahrnují použití transgenních myší, které exprimují lidské imunoglobulinové geny (viz, např. Wood et al. PCT publikace WO 91/00 906, Kucherlapati et al. PCT publikace WO 91/1074; nebo Lonberg et al. PCT publikace WO 92/03 918). Podobně, lidské monoklonální protilátky mohou být produkovány zavedením antigenu do imunitně deficientní myši, které byly implantovány buňky nebo tkáně produkující lidskou protilátku (např., buňky lidské kostní dřeně, periferální krevní lymfocyty (PBL), tkáň lidské fetální lymfatické uzliny nebo hematopoetické kmenové buňky). Tyto metody zahrnují vznik protilátek v SCID-hu myších (viz Duchosal et al. PCT publikace WO 93/05 796; patent US 5 411 749; nebo McCune et al. (1988) Science 241: 1632 až 1639)) nebo Rag-l/Rag-2 deficientních myších. Imunitně deficientní myši s implantovanými tkáněmi produkujícími lidskou protilátku jsou rovněž komerčně dostupné. Rag-2 deficientní myši jsou, např., komerčně dostupné od Taconic Farms (Germantown, NY).

Hybridomy

Monoklonální protilátky mohou být generovány imunizací subjektu imunogenem. Po vhodné době po imunizaci, např., když protilátkové titry jsou na dostatečně vysoké hladině, mohou být buňky produkující protilátky imunizovanému živočichu odebrány a použity pro přípravu monoklonálních protilátek pomocí standardních metod. Buňky, produkující protilátky, mohou být, například, spojeny standardním postupem buněčné fúze s nesmrtelnými buňkami, jako např., buňkami myelomu, za vzniku hybridomů. Tyto techniky jsou v oboru dobře známy a zahrnují, např., původně vyvinuté hybridomové techniky (Kohler and Milstein, (1975) Nátuře, 256:495 až

-6CZ 303771 B6

497), hybridomovou techniku lidských B buněk (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72) a techniku EBV hybridomu pro produkci lidských monoklonálních protilátek (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne. Str. 77 až 96). Technologie produkce monoklonálních protilátek je velmi dobře známa.

Monoklonální protilátky mohou také být vyrobeny oddělením buněk produkujících protilátky, např., slezinných buněk z transgenních myší, exprimujících lidské imunoglobulinové geny a imunizovaných 40 kDa proteinem. Tyto slezinné buňky byly učiněny nesmrtelnými fúzí s lidským myelomem nebo transformací s Epstein-Barrovým virem (EBV). Tyto hybridomy mohou být realizovány při použití technik lidských B buněk- nebo EBV-hybridomů, jak je popsáno (viz např. Boyle et al., evropská patentová přihláška č. 0 614 984).

Hybridomové buňky produkující monoklonální protilátku, která se specificky váže na 40 kDa protein, jsou detekovány skríninkem supernatantu hybridomových kultur, např., na výběr protilátek, které se specificky váží na imobilizovaný 40 kDa protein nebo testováním těchto protilátek, jak je zde popsáno, např. na schopnost inhibovat buněčnou proliferaci. Hybridomové buňky, které produkují monoklonální protilátky, které jsou pozitivně testované ve zde popsaných skríninkových postupech, mohou být pěstovány v živných mediích za podmínek a po dobu dostatečnou pro vyloučení dostatečného množství monoklonální protilátky hybridomem do kultivačního média, čímž je získáno dostatečné množství monoklonálních protilátek. Techniky tkáňových kultur a kultivační média vhodná pro hybridomové buňky jsou obecně popsány (viz, např., R. H. Kenneth, v Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenům, Publishing Corp., New York (1980). Supernatanty kondicionovaných hybridomových kultur, obsahující protilátky, lze potom spojit.

Rekombinantní kombinační protilátkové knihovny

Monoklonální protilátky lze vyrobit konstrukcí rekombinantní kombinační imunoglobulinové knihovny a skríninkem této knihovny pomocí 40 kDa proteinu. Rity pro tvorbu a skrínink fágových zobrazovacích knihoven jsou komerčně dostupné (např., Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; a Stratagene SurfZAV Phage Display Kit, Catalog No. 240612). V stručnosti, protilátková knihovna je skrínována pro identifikaci a izolaci fágů, které exprimují protilátku, která se specificky váže na 40 kDa protein. V doporučeném uspořádání zahrnuje primární skrínink této knihovny skrínink s imobilizovaným 40 kDa proteinem.

Po tomto skríninku je detekovaný fág izolován a může být z něho získána nukleová kyselina, která kóduje zvolenou protilátku (např., z fágového genomu) a subklonována v jiných expresních vektorech technikami dobře známé rekombinace DNA. Tato nukleová kyselina může být dále manipulována (např., navázána na nukleovou kyselinu kódující přídavné domény imunoglobulinu, tak jako jsou přídavné konstantní oblasti), nebo eventuelně exprimována v hostitelské buňce.

Chimérické a humanizované protilátky

Rekombinantní formy protilátek, tak jako chimérické nebo humanizované protilátky, lze také připravit, aby byla minimalizována odpověď lidského pacienta na tuto protilátku. Jsou-li protilátky produkované vjiném než lidském objektu nebo pocházející zjiných než lidských protilátkových genů použity terapeuticky u člověka, jsou potom v různém rozsahu rozpoznávány jako cizí a u pacienta vzniká imunitní odpověď. Jedním přístupem k minimalizaci nebo vyloučení této imunitní reakce je produkce chimérických protilátkových derivátů, tj., protilátkových molekul, které kombinují jinou než lidskou živočišnou variabilním oblast a lidskou konstantní oblast. Takové protilátky zachovávají epitopovou vazebnou specifitu originální monoklonální protilátky, ale měly by být méně imunogenní, jsou-li podány člověku a tudíž být více tolerovány pacientem.

-7CZ 303771 B6

Chimeické monoklonální protilátky lze produkovat běžně používanými technikami rekombinantní DNA. Například, gen kódující konstantní oblast molekuly jiné než lidské protilátky je substituován genem kódujícím lidskou konstantní oblast (viz, Robinson et al., patentová přihláška PCT/US86/02269; Akira et al., evropská patentová přihláška č. 184,187; nebo Taniguchi, M., evropská patentová přihláška č. 171,496). Chimérická protilátka může být dále humanizována nahrazením částí variabilní oblasti, které nejsou zapojeny do vazby antigenu, ekvivalentními částmi lidské variabilní oblasti. Přehledné studie o „humanizovaných“ chimérických protilátkách jsou: Morrison, S. L. (1985) Science, 229:1202 až 1207 a Oi et al. (1986) BioTechniques, 4: 214. Tyto metody zahrnují izolaci, manipulaci a expresi těch sekvencí nukleové kyseliny, které kódují celou nebo část variabilní oblasti imunoglobulinu nejméně jednoho lehkého nebo těžkého řetězce. cDNA, kódující humanizovanou chimérickou protilátku nebo její fragment, může být klonována ve vhodných expresních vektorech. Vhodné „humanizované“ protilátky mohou být případně produkovány pomocí substituce v oblasti určující komplementaritu (complementarity determining region (CDR)), viz patent US 5 225 539; Jones et al. (1986) Nátuře 321: 552 až 525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534 a Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053 až 4060).

Otisk epitopu lze rovněž použít pro produkci „lidských“ dimerů protilátkových polypeptidů, které si zachovávají vazebnou specifitu křeččích protilátek specifických vůči 40 kDa proteinu produkovaných hybridomem uloženým pod ATCC č. PTA-3787, ATCC No. PTA nebo ATCC No. PTA-404, V krátkosti, gen kódující jinou než lidskou variabilní oblast (VH) se specifickou vazbou k antigenu a lidskou konstantní oblast (CH1), je exprimován \ E. coli a infikován ve fágové knihovně pro lidské NKCk řetězce a E. coli obsahující tyto řetězce byla infikována fágovou knihovnou pro lidské VHCH1 geny a tato knihovna je subjektem skríninku zkumavkami povlečenými antigenem. Viz Hoogenboom et al. PCT publikace WO 93/06 213.

Protilátkové fragmenty

Předkládaný vynález zahrnuje nové antitumorové protilátky a jejich libovolné fragmenty, obsahující aktivní vazebnou oblast protilátky, jako je Fab, F(ab')₂ a Fv fragmenty. Tyto fragmenty mohou být produkovány protilátkou při použití dobře známých technik (viz např. Rousseaux et al., in Methods Enzymol., 121:663 až 69, Academie Press, (1986)). F(ab')₂ fragmenty mohou být například produkovány pepsinovou digescí protilátkové molekuly a Fab fragmenty lze připravit redukcí disulfidických můstků F(ab')₂ fragmentů.

Použití protilátek

Zde popsané protilátky mají mnohé použití. Tyto protilátky lze použít in vivo pro diagnostické postupy určení přítomnosti maligních buněk v lidských tkáních. Tato metoda zahrnuje zkoušení vzorku tkáně na přítomnost 40 kDa proteinu. Například, tento tkáňový vzorek může být v kontaktu s monoklonální protilátkou produkovanou buněčnou linií hybridomů ATCC No. PTA-377, ATCC No. ΡΤΛ-405 nebo ATCC No. PTA-404 a poté je určena schopnost této protilátky se specificky vázat k buňkám v tkáňovém vzorku. Vazba indikuje přítomnost tumorové buňky. Tato protilátka může být obdobně použita pro skrínink vzorků krve na uvolněný antigen.

Tyto protilátky mohou být také použity pro lokalizaci in vivo podáním izolované protilátky podle předkládaného vynálezu, kteráje značena signální skupinou, jež poskytuje detekovatelný signál, subjektu. Vázané protilátky jsou potom detekovány použitím externí scintigrafie, emisní tomografie nebo radionukleárního skenování. Tato metoda může být použita pro popis rakoviny u pacienta s ohledem na rozsah této choroby a k zobrazeným změnám při odpovědi na terapii.

Tyto protilátky mají také terapeutické aplikace. Tyto nové protilátky mohou být použity pro léčbu tumorů, protože specifická vazba této protilátky na tumorovou buňku způsobuje, že buňka zastavuje proliferaci a hyne.

-8CZ 303771 B6

Tyto protilátky mohou být také použity terapeuticky, např., jako zacílená činidla, pro přenesení antitumorových činidel do tumorů. Tato antitumorová činidla zahrnují chemoterapeutická léčiva, toxiny, modulátory imunologické odpovědi, enzymy a radioizotopy.

Detekovatelné značky

Protilátky, které reagují s 40 kDa proteinem mohou být použity diagnosticky, např., pro detekci přítomnosti tumoru v subjektu. Detekce může být usnadněna spojením protilátky s detekovatelnou značkou. Příklady detekovatelných značek zahrnují různé enzymy, prostetické skupiny, fluorescenční materiály, luminiscenční materiály, bioluminiscenční materiály, značky elektronové hustoty, značky pro MRI a radioaktivní materiály. Příklady vhodných enzymů zahrnují křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, β-galaktozidázu nebo acetylcholinesterázu; příklady vhodných komplexů prostetických skupin zahrnují streptavidin/biotin; příklady vhodných fluorecenčních materiálů zahrnují umbelliferon, fluorescein, fluorescein isothiokyanát, rhodamin, dichlortriazynylamin fluorescein, dansyl chlorid nebo fytoerytrin; příklad luminiscenčního materiálu zahrnuje luminol; příklady bioluminiscenčních materiálů zahrnují luciferázu, luciferin a ekvorin a příklady vhodného radioaktivního materiálu zahrnují ^l25I, ¹³'i, ³’S nebo ³H.

Protilátky jako zacílená činidla

Zde popsané protilátky ajejich fragmenty mohou být konjugovány k nějaké části a tato protilátka může být použita pro směrování uvedené části na místo tumoru, který exprimuje 40 kDa protein. Příklady takových částí zahrnují toxiny, radionuklidy nebo chemoterapeutická léčiva použitelná pro usmrcení tumorových buněk nebo zobrazovací činidla, která mohou být použita pro lokalizaci a určení velikosti tumorů exprimujících 40 kDa protein. Tyto protilátky použité pro směrování části na tumor u člověka jsou přednostně monoklonální protilátky, např., humanizované monoklonální protilátky.

Tyto protilátky mohou být napojeny na zmíněnou část, např. toxin, buď kódováním spojeným genem, který kóduje hybridní protein, nebo prostřednictvím konjugace, např. nepeptidovou kovalentní vazbou, např. neamidickou vazbou, která je použita pro spojení odděleně produkovaných protilátek a oněch částí. Zde popsané protilátky mohou být rovněž fúzovány s jinou protilátkou, která je specifická pro imunitní buňky a stimuluje tyto imunitní buňky k zabití tumoru.

Toxiny

Použitelné toxinové molekuly zahrnují peptidové toxiny, které jsou signifikantně cytotoxické, jsou-li přítomny intracelulárně. Příklady toxinů zahrnují cytotoxiny, metabolické přerušovače (inhibitory a aktivátory), které přerušují metabolické dráhy a tím zabíjejí tumorové buňky a radioaktivní molekuly, které zabíjejí buňky v definovaném poloměru účinnosti. Metabolicky přerušovač je molekula, např., nějaký enzym nebo cytokin, který mění metabolismus buňky tak, že dojde ke změně její normální funkce. V širším slova smyslu termín toxin zahrnuje libovolný efektor, který způsobuje smrt tumorové buňky.

Mnohé peptidové toxiny mají obecnou vazebnou doménu eukaryontních receptorů; v tomto ohledu musí být tento toxin modifikován tak, aby nezabíjel buňky, které nenesou cílový protein (např., zabránit zabíjení buněk, které nenesou 40 kDa protein, ale mají receptor pro nemodifikovaný toxin). Takové modifikace musí být provedeny způsobem, který uchovává cytotoxické funkce této molekuly. Možné použitelné toxiny zahrnují, ale bez omezení: difterický toxin, toxin cholery, ricin, toxin podobný O-Shiga (SLT-1, SLT-I1, SLT-II_V). LT toxin, C3 toxin, Shiga toxin, toxin černého kašle, tetanus toxin, Pseudomonas exotoxin, alorin, saponin, modeccin a gelanin. Ostatní toxiny zahrnují faktor alfa tumorové nekrozy (TNF-α) a lymfotoxin (LT). Jiným toxinem s antitumorovou aktivitou je calicheamicin gama 1, diyn—en obsahující antitumorové antibiotikum s význačným účinkem proti tumorům (Zein, N., et al., Science, 240:1198 až 201 (1988)).

-9CZ 303771 B6

Difterický toxin může být, například, konjugován se zde popsanou protilátkou Difterický toxin, jehož sekvence je známa, je detailně popsán v (Murphy, patent US 4 675 382, který je zde začleněn citací). Přirozená molekula difterického toxinu vylučovaná Corynebacterium diphtheriae, sestává z několika funkčních domén, které mohou být charakterizovány, počínaje amino koncem molekuly, jako enzymaticky aktivní fragment A (aminokyseliny Glyi - Arg|₉₃) a fragment B (aminokyseliny Seri94-Ser₅₃₅), který zahrnuje translokační doménu a obecnou buněčnou vazebnou doménu (aminokyseliny 475 až 535).

Vazba toxinů k protilátkám

Protilátková a toxinová část mohou být spojeny několika způsoby. Pokud je tato sloučenina produkována expresí fúzovaného genu, je spojovacím článkem mezi toxinem a protilátkou peptidová vazba. V alternativním případě jsou obě části produkovány odděleně a posléze spojeny nepeptidovou kovalentní vazbou. Tato kovalentní vazba může být, například, disulfidická.

V tomto případě může být DNA, která kóduje tuto protilátku, sestrojena pomocí konvenčních metod tak, aby obsahovala jeden cysteinový kodon navíc.

V případě disulfidické vazby je toxinová molekula také derivována sulfhydrylovou skupinou, která reaguje s cystinem modifikované protilátky. V případě této vazby mezi toxinem a protilátkou může být vše usnadněno inzercí cysteinové kodonu do DNA sekvence, kódující tento toxin. Alternativně může být sulfhydrylová skupina, buď sama, nebo jako část cysteinového zbytku, zavedena pomocí technik polypeptidů v pevné fázi. Taková introdukce sulfhydrylové skupiny je popsána v Hiskey, Peptides, 3:137 (1981).

Derivatizace může být také provedena podle metody popsané pro derivatízací peptidového hormonu u Bacha et al., patent US 4 468 382. Zavedení sulfhydrylové skupiny do proteinu je také popsáno u Maasen et al., Eur. J. Biochem., 134: 32(1983). Jsou-li potřebné sulfhydrylové skupiny přítomny, jsou cytotoxin a protilátka purifikovány, obě sírové skupiny jsou redukovány, cytotoxin a protilátka smíseny (v poměru asi 1:5 až 1:20) a disulfidická vazba je kompletována v průběhu asi 20 až 30 minut stání při teplotě laboratoře. Tato směs je potom dialyzována proti fosfátovému fyziologickému roztoku (PBS) pro odstranění nezreagovaných molekul protilátek a toxinů. Pro separaci požadovaných toxin-proti látkových konjugátů od typu toxin-toxin nebo typu protilátka-protilátka, je použita chromatografíe na Sephadexu® nebo jiném podobném nosiči, na principu molekulárního síta.

Modulátory imunitní odpovědi

Antitumorová část může být také modulátorem imunitního systému, která buď aktivuje, nebo inhibuje imunitní systém organizmu na lokální úrovni. Například, cytokiny, např., lymfokiny, tak jako IL-2, dopravené do tumoru, mohou způsobit proliferaci cytotoxických T-lymfocytů nebo přirozených buněk zabíječů v blízkosti tumoru.

Radioaktivní molekuly

Částí nebo signální skupinou může být i radioaktivní molekula, např., radionukleotid nebo tzv. senzibilizátor, např., prekurzorová molekula, která se stane radioaktivní za specifických podmínek, např., bor, vystavený svazku neutronů o nízké energii, v tzv. „terapii zachycování neutronů borem“ (BNCT), Barth et al., Scientific American, říjen 1990: 100 až 107 (1990). Sloučeniny s takovouto efektorovou radioaktivní částí mohou být použity pro inhibici proliferace tumorových buněk a pro označení tumorových buněk v zobrazovacích procesech.

Radionuklidy jsou jednoduché radioaktivní molekuly, která mohou emitovat buď α, β, nebo γ částice. Emitorům alfa částic je dávána přednost před emitory beta a gama částic, protože uvolňují mnohem vyšší energii na kratší vzdálenost a jsou tedy účinnější, bez signifikantně pronikavého

- 10CZ 303771 B6 a škodlivého působení na normální tkáně. Vhodné radionuklidy vyzařující alfa částice jsou ^2llAt, ^2l2Pba²¹²Bi.

Radioaktivní molekula musí být těsně vázána na protilátku, buď přímo, nebo bifunkčním chelátem. Tento chelát nesmí dovolit eluci a tudíž předčasné uvolňování radioaktivních molekul in vivo. Waldmann, Science, 252:1657 až 62 (1991). Pro přizpůsobení BNCT na předkládaný vynález, byl stabilní izotop boru, např. bor 10, vybrán jako antitumorová neboli efektorová část sloučeniny. Tento bor je přenesen a koncentrován na nebo do tumorové buňky prostřednictvím specifické vazby protilátky k tumorové buňce. Po čase nutném pro akumulaci boru je tumor zobrazen a ozářen svazkem neutronů o nízké energii, asi 0,025 eV. Zatímco toto ozáření samo o sobě způsobuje pouze malé poškození buněk, jak tumorových, tak i obklopujících tumor, bor 10 (např., na povrchu tumorové buňky) zachycuje neutrony, čímž se mění na nestabilní izotop, bor 11. Bor 11 se okamžitě štěpí na jádra lithia 7 a energetická alfa částice, o energii asi 2,79 milionů eV. Tyto těžké částice jsou vysoce letální, ale velmi lokalizované, mají délku dráhy asi průměru jedné buňky (10 mikronů).

Byly uvedeny kalkulace znázorňující, jak pro zničení jedné buňky je potřeba asi jedné miliardy atomů boru, při toku tepelných neutronů od 10¹² do 10¹’ neutronů na cm², takže radiace tvořená těmito alfa částicemi převyšuje radiaci pozadí tvořenou zachycovací reakcí s dusíkem a vodíkem.

Zobrazovací části

Zde popsané protilátky se specificky váží ke 40 kDa proteinu a jsou tudíž použitelné pro detekci lidských tumorů. Jeden takový přístup zahrnuje detekci tumorů in vivo, tumor zobrazujícími technikami za použití protilátek značených vhodnou částí nebo signální skupinou, např., zobrazujícím činidlem, které poskytuje detekovatelný signál. Zobrazující činidla a postupy pro značení protilátek jsou dobře známy (viz, např. Wensel and Meares, Rádio Immunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York (1983); Colcher et al., Meth. Enzymol., 121:802 až 16 (1986)). Tyto značené protilátky mohou být detekovány technikami jako je radionukleární skenování (viz, např., Bradwell et al. in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (ed.) str. 6 až 85, Academie Press (1985)).

Podání

Zde popsané protilátky mohou být podány subjektu, např., živočichu nebo člověku, za účelem zobrazení nebo léčby tumorů. Tyto protilátky mohou být podávány samotné nebo ve směsi, např., v přítomnosti farmaceuticky přijatelného excipientu nebo nosiče (např., fyziologického roztoku). Excipient nebo nosič jsou vybrány podle druhu a způsobu podání. Vhodné farmaceutické nosiče jsou uvedeny v Remingtonů Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin), známém referenčním textu v tomto oboru a v USP/NF (United States Pharmacopeia and the National Formularly).

Farmaceutická kompozice je formulována, aby byla kompatibilní s plánovaným způsobem podání. Příklady způsobu podání zahrnují parenterální, např., intravenózní, intradermální, subkutánní, orální (např., inhalace), transdermální (topické), transmukozální a rektální podání. Roztoky nebo suspenze použité pro parenterální, intradermální nebo subkutánní aplikaci mohou zahrnovat následující komponenty: sterilní rozpouštědlo, tak jako voda pro injekci, fyziologický roztok, fixační oleje, polyethylenglykoly, glycerín, propyienglykol nebo jiná organická rozpouštědla; antibakteriální činidla, jako benzylalkohol nebo methylparabeny; antioxidanty, jako kyselina askorbová nebo hydrogensiřičitan sodný; chelatační činidla, jako kyselina ethylendiamintetraoctová; pufry, jako acetáty, citráty nebo fosfáty a činidla pro nastavení osmotické síly, jako chlorid sodný nebo glukóza. Ph může být nastaveno kyselinami nebo louhy, jako kyselina chlorovodíková nebo hydroxid sodný. Parenterální preparáty mohou být uzavřeny v ampulích, dávkovačích pipetách nebo dávkovačích ze skla nebo plastu.

-11CZ 303771 B6

Nejúčinnější způsob podání a dávkový režim kompozic podle tohoto vynálezu závisí na rozsahu a průběhu onemocnění, pacientově zdraví a reakci na léčbu a na vyjádření ošetřujících lékařů. V souhlase s tím by dávka měla být titrována pro každého individuálního pacienta. Účinná dávka proti látkových kompozic podle tohoto vynálezu je v rozsahu od asi 1 pg do asi 5000 mg, lépe od asi 1 do asi 500 mg nebo ještě lépe asi 100 až 200 mg.

Diagnostické kity

Tento vynález také obsahuje diagnostické kity pro provádění metod popsaných shora. Tento diagnostický kit obsahuje (a) zde popsanou monoklonální protilátku a (b) konjugát specifického vazebného partnera pro protilátku a značky pro detekci navázané protilátky. Tento kit také obsahuje pomocná činidla, jako pufrační činidla a činidla stabilizující protein, např. polysacharidy a jim podobné. Tento diagnostický kit může v případě potřeby dále obsahovat ostatní složky systému poskytujícího signály, včetně činidel pro snížení interference pozadí, kontrolních činidel a aparátu pro provádění testu. Vjíném uspořádání obsahuje diagnostický kit konjugát monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu a značku schopnou produkce detekovatelného signálu. Pomocná shora zmíněná činidla mohou být také přítomna. Vždy jsou přítomny instrukce pro použití diagnostického kitu.

Polypeptidy

Zde popsané monoklonální protilátky mohou být použity pro izolaci a charakterizaci 40 kDa proteinu, ke kterému se váží. Tento protein rozpoznatelný monoklonální protilátkou je novým proteinem buněčného povrchu nalezeným v mnoha tumorových buňkách včetně lymfomu thymu, tumoru T-buněk, lymfomu B-buněk, melanomu, osteosarkomu a akutní leukemie T-buněk. Tento protein je molekulou, která indukuje buněčnou smrt, založenou na pozorování, že když se monoklonální protilátka váže ktomuto proteinu, buňka, na které je tento protein exprimován, hyne.

Protein rozpoznatelný těmito monoklonálními protilátkami může být izolován z buněk, které ho exprimují (E710.2.3., RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEH1-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat a Cos). Zde popsané monoklonální protilátky mohou být použity pro imunoprecipitaci tohoto proteinu. Pro určení sekvence tohoto proteinu může být purifikován pomocí SDS-PAGE, přenesen na membránu (Immobilon, Millipore Corp., Bedford, MA) a tato membrána obarvena Coomassie Brilliant Blue. Obarvený proteinový pás (M_r=40 kDa) může být potom vyříznut pomocí holicí čepelky pro následnou analýzu N-koncové aminokyselinové sekvence. Sekvenční analýzy N-konců, jako např., automatizovaná Edmanova degradace, jsou dobře známé.

Tento vynález také představuje fúzní proteiny, které obsahují 40 kDa protein, fúzovaný k cizímu (nepříbuznému) proteinu. Tento cizí protein může být vybrán pro usnadnění purifikace, detekce, solubilizace nebo aby poskytl nějakou jinou funkci. Fúzní proteiny mohou být produkovány synteticky nebo může být tento protein navázán na nějaký cizí protein při použití spojovacích činidel, jako např., dicyklohexylkarbodiimid (DCC). Fúzní proteiny mohou být alternativně produkovány rekombinačně klonováním nukleotidové sekvence, která kóduje tento fúzní protein, ve vhodném expresním vektoru. Takovýto rekombinantní fúzní protein může být dále čištěn od kultivačního média nebo od buněčného lyzátu.

Tento 40 kDa protein je použitelný např. jako vakcína pro imunizaci vůči určitým tumorům. Postupy přípravy takových vakcín jsou v oboru dobře známy (viz, např., Estin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 85:1052(1988)). Jenom v krátkosti, rekombinantní viry jsou konstruovány pro expresi klonovaných proteinů asociovaných s tumory. Buňky infikované těmito rekombinantními viry budou exprimovat tento protein na svém povrchu, společně s hostitelskými histokompatibilními antígeny a imunogenními virálními proteiny. Toto favorizuje indukci celulární imunity, která se klíčovým způsobem účastní odmítnutí tumoru.

- 12 CZ 303771 B6

Tento vynález také poskytuje metodu identifikace modulátorů, tj., testovacích sloučenin nebo činidel (např., peptidy, peptidomimetika, malé molekuly nebo léčiva), které se váží na 40 kDa protein nebo, které mají stimulační nebo inhibiční účinek na expresi nebo aktivitu 40 kDa proteinu. Případný antagonista 40 kDa proteinu by, například, mohl být použitelný pro inhibici apoptózy v buňce. Takový antagonista může hrát roli při inhibici apoptózy u subjektu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Tvorba antitumorových protilátek

V jednom přístupu k identifikaci nových funkčních molekul, které mohou být zahrnuty v růstu nebo přežívání lymfomů a/nebo ve funkcích normálních lymfocytů, byly z křečků injikovaných E710.2.3, vytvořeny hybridomy, tak, jakje uvedeno dále. Arménští křečci byli intraperitoneálně injikovány 10 miliony E710.2.3. Injekce byla 7 až 10 x opakována. Fúze byly provedeny za použití fúzního partnera P3X63-AG8.653, jak je popsáno (Schreiber et al. (1985) Immunol 134: 1609). Supematanty hybridů byly nejprve skrínovány pomocí imunofluorescence a průtoková cytometrie na schopnost vazby na E710.2.3A. Jedna konkrétní protilátka, zde popisovaná jako DMF10.62.3, jasně barvila povrch E710.2.3.

Imunofluorescenční analýzy ukázaly, že DMF 10.62.3 reagovala s mnoha liniemi myších buněk (tabulka I), ale sjinými ne (tabulka II). Pozitivní buněčné linie obsahovaly některé linie T buněk (např., RMA-S), některé B buňky z lymfomů (např., A20 a WEHI-231) a makrofágové buněčné linie (C2.3). DMF10.62.3 se tedy specificky váže na některé usmrcené buňky jiného než hematopoetického původu, indukuje stromatické buněčné linie (PBK101A2), melanomu (B16), sarkomu (MC57) a polyomem transformované fibroblasty (WOP-3027). Některé jiné nezralé (např., G58.2) a zralé T buňky (např., EL4), makrofágové (např. A3.1), dendritické buňky (DC2.4) a fibroblastové buněčné linie (LADp31) byly negativní na DMF10.62.3. Monoklonální protilátky překvapivě také reagovaly s některými lidskými usmrcenými buněčnými liniemi, včetně Jurkat, 293T a 143Btk- a také s opičí transformovanou SV-40 ledvinovou buněčnou linií, Cos7. DMF10.62.3 se nevázaly na určité lidské buněčné linie, jako na B-lymfoblastoidní buňky, 721 a buňky cervikálního karcinomu HeFa. Barvicí chování představitelů buněčných linií je uvedeno na obr. 1 pro DMF10.62.3-pozitivní buňky E710.2.3 (obr. 1 A), A20 (obr. 1B) a Jurkat (obr. 1C) a DMF10.62.3-negativní buňky, RF33.70 (obr.ID).

- 13 CZ 303771 B6

Tabulka

Buněčná linie	Popis
E710.2.3	lymfom myšího thymu
RMA-S	tumor myších T buněk
CTLL	linie myších IL-dependentních buněk
LB27.4	hybridom myších B buněk
A20	lymfom myších B buněk
WEEU-231	lymfom myších B buněk
PBK101A2	stromatální buněčná linie myšího
C2.3	thymu usmrcený makrofág myší kostní dřeně
B16	myší melanom
MC57	myší tumor indukovaný
WOP-3027	metylcholantrenem transformované fibroblasty myšího
293T	polyomu lidské transformované primární
143Btk-	embryonální ledviny lidský osteosarkom

Shora uvedená data naznačují, že nové protilátky se specificky váží k mnoha, ale ne ke všem usmrceným buněčným liniím, a že tato vazba není druhově ani buněčně liniově omezena.

- 14CZ 303771 B6

Tabulka II

Buněčná linie	Popis
RF33.70	myší T-T hybrid
DO11.10	myší T-T hybrid
13G7.3.2	myší T-T hybrid
HT-2	myší T buněčná linie závislá na IL-2
EL-4	T buňky myšího lymfomu
G58.2	lymfom myšího thymu
NFC105	lymfom myšího thymu
P815	myší mastocytom
P388D1	myší monocyt/makrofág tumor
LADP31	myší L buněčná linie
A3.1	makrofag odvozený od usmrcené myší kostní dřeně
DC2.4	linie myších usmrcených dendritických buněk linie lidských B buněk
HeLa	lidský epiteliální cervikální karcinom
E36	křečci karcinom plic
BHK-21	buněčná linie křečcích ledvin
CHO	vaječník čínského křečka

Příklad 2: Exprese molekuly rozpoznané DMF 10.62.3

Exprese molekuly rozpoznané DMF 10.62.3 byla testována na fetálních thymocytech, jak je následovně uvedeno. Časovaná březost C58B1/10 myší produkovala embrya, která byla usmrcena v den 14. Fetální brzlíky byla odebrána do PBS roztoku pomocí Eppendorfovy skleněné střílo kačky s pístem. Suspenze jednotlivých buněk byly inkubovány po 20 minut na ledu s anti-Fc gamma receptorem II/11I (Pharmingen) pro blokaci Fc receptoru. Buňky byly následně ovlivněny s buď DMF 10.62.3, nebo křeččím IgG po 30 minut s následným působením FITC konjugovaného kozího anti-křeččího, společně s allofykocyanin (APC)-konjugovaným anti-Thy 1.2 (Pharmingen). V některých experimentech byly také zahrnuty anti-CD25 konjugované na PE a anti15 CD44 konjugované na Cy-Chrome (Pharmingen). Obarvené buňky byly fixovány přes noc v 1% paraformaldehydu a následně analyzovány průtokovou cytometrií.

Výsledky ukázaly, že 14 denní thymocyty ovlivněné DMF 10.62.3 byly pozitivní na 40 kDa protein a tento protein byl nalezen na Thy 1.2 pozitivních buňkách (obr. 2A). Je zajímavé, že tento protein byl přítomen jak na CD25⁺CD44⁺ fetálních thymocytech, tak i na CD44 CD25 fetálních thymocytech. Barvení buněk adultního thymu (obr. 2C), adultní sleziny (obr. 2B) a adultní kostní dřeni (obr. 2D) však ukázala, že protein rozpoznaný DMF 10.62.3 není přítomen v žádné z těchto buněk v úrovni vyšší, než jaká byla pozorována s kontrolním křeččím IgG. Tento protein nebyl dále detekován na zralých CD4'CD8'thymocytech po uvedení CD4'CD8' buněk do multipara- 15 CZ 303771 B6 metrické analýzy, průtokovou cytometrií nebo analýzou populace RAG-/-myší. Buňky jater 14 dní starého plodu také nebyly reaktivní s DMF 10.62.3.

Pro určení, jestli protein rozpoznaný DMF10.62.3 byl přítomen na normálních, aktivovaných slezinných buňkách, byly slezinné T buňky aktivovány s mitogenem T buněk, ConA a obarveny na expresi proteinu rozpoznatelného DMF 10.62.3, jak následuje. Slezina, brzlík a kostní dřeň byly získány z dospělých (4 až 6 měsíců starých) Balb/c nebo C57B1/6 myší. Ze suspenzí slezinných buněk byly odstraněny červené krvinky pomocí jejich lýze pomocí chloridu amonného. Nestimulované buňky byly okamžitě obarveny. Lymfoblasty byly stimulovány v kultuře 1 pg/ml ConA nebo 10pg/ml LPS. Po 1 až 3 dnech kultivace byly buňky obarveny na expresi DMF 10.62.3. V nestimulovaných buňkách (obr. 3A) nebo v buňkách stimulovaných ConA v 24 (obr. 3B), 48 (obr. 3C) nebo 72 (obr. 3D) hodinách po aktivaci, nebylo žádné průkazné obarvení proti pozadí (žádný posun v FACs profilu). Jako pozitivní kontrola byly buňky stimulované ConA obarveny CD25. Jak bylo očekáváno, ConA ovlivnění mělo za výsledek průkazné zvýšení exprese CD25 na těchto buňkách ve srovnání s nestimulovanými buňkami (vazba CD25 k buňkám způsobuje posun v profilu FACs). Obdobně, když byly slezinné B buňky aktivovány s lipopolysacharidy (LPS), nebylo žádné obarvení s DMF10.62.3 pozorováno při 24 (obr. 3E), 48 (obr. 3F) a 72 (obr. 3G) hodinách (žádný posun v profilu FACs). Protein rozpoznatelný DMF 10.62.3 není přítomen na dospělých buňkách kostní dřeně (obr. 2D). Tato data naznačují, že protein rozpoznaný DMF 10.62.3 je přítomen na některých fetálních thymocytech, ne však na normálních, klidových, ani na aktivovaných buňkách hematopoetického původu u dospělých živočichů.

Přiklad 3: DMF 10.62.3 inhibuje proliferaci tumorových buněk

Pokud jsou pěstovány při nízké hustotě a udržovány v nepřítomnosti PMA, E710.2.3 buňky proliferují pomalu nebo vůbec. Proliferují však, jsou-li kultivovány společně s thymocyty. DMF 10.62.3 byl původně identifikován na základě jeho schopnosti blokovat tuto thymocyty indukovanou proliferaci. Jak uvádí tabulka III, DMF 10.62.3 kompletně inhibuje tuto odpověď. Proliferační studie byly provedeny jak následuje. E10.2.3 buňky byly promytím zbaveny PMA a kultivovány v kompletním RPMI po 48 hodin při nízké hustotě buněk (<10⁵/ml), aby byla snížena proliferace pozadí. Následně bylo 5x10⁵ buněk kultivováno po 72 hodin na mikrotitračních deskách s plochým dnem s 25 ng/ml PMA nebo 5x10⁵ thymocytů v přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek. V experimentech testujících vliv protilátek na spontánní proliferaci buněk, byly E710.2.3 (pěstování při vysoké hustotě >10⁵/ml) nebo RMA-S buňky kultivovány po 36 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací protilátky. H-thymidin (1 TCi/jamku) byl přidán na posledních 5 hodin a inkorporace značky do DNA byla měřena J-scinti lačním čítačem (Wallac, Gaithersburg, MD).

Tabulka IIII

	Médium	Thymocyty	PMA
Kontrola
(žádné protilátky)	8,699	33,802	54,271
DMF10.62.3	938	750	480
DMF10.132	6,646	27,156	25,216

Byla také testována schopnost CMF10.62.3 inhibovat odpověď E710.2.3 na jiné stimuly. Jak je ukázáno v tabulce III, tato protilátka rovněž blokovala proliferaci E710.2.3, indukovanou PMA.

- 16CZ 303771 B6

Kromě toho E710.2.3 spontánně proliferovala při pěstování ve vysoké hustotě a DMF 10.62.3 tuto odpověď inhibovala (obr. 4A). Proliferace je signifikantně inhibována při 3 pg/ml a úplná inhibice byla pozorována při 12,5 pg/ml. Naproti tomu, neměly křeččí IgG žádný vliv na odpověď E710.2.3 ke kterémukoliv z těchto stimulů. Mnohé monoklonální protilátky z původní fúze se vázaly ku E710.62.3, ale neinhibovaly jeho proliferaci (např., DMF10.132) (tabulka III). DMF10.62.3 tedy specificky inhiboval proliferaci E710.62.3 bez ohledu na stimul použitý pro indukci proliferace.

Protein rozpoznatelný DMF10.62.3 je přítomen na mnoha jiných buněčných liniích. Bylo proto zajímavé, určit zdali tato protilátka má podobný vliv na jejich spontánní proliferaci. DMF10.62.3 inhibovala proliferaci RMA-S (obr. 4B), tak jako mnoho jiných buněčných testovaných linií. Naopak, tato protilátka neměla žádný vliv na spontánní proliferaci RF33.70, která byla negativní na přítomnost DMF 10.62.3 proteinu (obr. 4C).

Příklad 4: DMF 10.62.3 indukuje buněčnou smrt apoptózou

Apoptóza byla testována kitem od R&D (Minneapolis, MN) a Pharmingen (San Diego, CA). Stručně, 2 χ 10⁵ buněk bylo inkubováno s různými koncentracemi protilátky v 200 pl média. Na konci inkubace byly buňky promyty 2x PBS, ovlivněny PI a FITC annexinem po 15 minut a potom analyzovány průtokovou cytometrií. DNA fragmentace byla realizována elektroforézou na 2% agarosovém gelu, jak je popsáno u Schachtner et al. ((1995)7. Exp. Med. 182:1557).

Kultury buněk ovlivněných protilátkou DMF 10.62.3 byly vizuálně prohlédnuty a bylo zjištěno, že počet intaktních buněk klesá. Buňky se navíc již neuzavíraly před vitálním barvivém, trypanovou modří. Toto pozorování, rovněž jako inhibice proliferace, nasvědčovaly tomu, že tato protilátka je toxická pro buňky. Byly tudíž provedeny studie pro určení mechanizmu, kterým je DMF 10.62.3 indukoval buněčnou smrt.

Buňky mohou zahynout apoptózou nebo nekrosou. Jedna z prvních změn viditelných v buňkách podléhajících apoptóze, je externalizace fosfatidylserinu na plasmatické membráně, která může být detekována barvením FITC-annexinem. Na počátku tohoto procesu se mohou apoptotické buňky uzavírat před vitálními barvivý, jako propidium jodid a mohou být tudíž identifikovány jako FITC-annexin pozitivní a PI-negativní. Později v apoptotickém procesu, dojde ke ztrátě membránové integrity a FITC-annexin pozitivní buňky se stávají PI-pozitivní. V průběhu nekrosy naopak buňky ztrácejí membránovou integritu a stávají se současně PI-pozitivní a FITCannexin pozitivní, aniž by prošly stavem, kdy jsou FITC-annexin pozitivní a PI-negativní.

V FAC's profilech na obr. 5A až 51, jsou buňky v levém dolním kvadrantu živé, buňky v dolním pravém kvadrantu procházejí apoptózou (FITC-annexin pozitivní) a v buňky v horním pravém kvadrantu jsou buňky, které jsou mrtvé po apoptóze a/nebo nekrose (PI-pozitivní a FITCannexin pozitivní). Procento buněk v každém kvadrantu je uvedeno také. V předkládané studii prošlo spontánní apoptózou v kultuře (10,9 až 15% Annexin+, PI-) procento E710.2.3 buněk. Avšak pouze 1 pg/ml DMF 10.62.3 způsobilo průkazný nárůst apoptózy v 1 hodině (28,9% Annexin+, PI-; obr. 5A) a tato apoptóza se s časem zvyšovala (48,6% Annexin+, PI- pozitivní po 3 hodinách) (obr. 5C). Vyšší množství DMF 10.62.3 (15 pg/ml) stimulovala apoptózu rychleji (37,1% AnnexinT, PI-pozitivní po 1 hodině) a ve více buňkách (obr. 5E-G). Působení podobných množství křeččího IgG nemělo naopak žádný průkazný vliv ve srovnání se samotným médiem (obr. 5D, 5H, 51). Apoptóza byla také ověřena vizualizací DNA fragmentů při agarosové gelové elektroforéze.

Protože protein rozpoznatelný DMF10.62.3 byl exprimován na jiných buňkách a tato protilátka inhibovala jejich proliferaci (byla testována), bylo dále zjišťováno, jestli DMF 10.62.3 u nich také stimuluje přechod k apoptóze. DMF10.62.3 způsobilo průkaznou apoptózu myších buněčných

- 17CZ 303771 B6 linií RMA-S, CTTL, LB27.4 a A20 a lidských buněčných linií Jurkat a 143BTK- (tabulka IV). Apoptóza byla indukována za použití 15 pg/ml DMF 10.62.3 a zvyšovala se stoupající koncentrací protilátky. DMF10.62.3 naopak nezpůsobovala apoptózu v RF33.70, který byl negativní na tento protein. Hladina apoptóze indukované DMF10.62.3 kolísala mezi různými buněčnými linie5 mi a zdála se být závislá na hladině povrchové exprese, tak jako na procentu buněk populace, které exprimují tento protein (tabulka IV). Například většina E710.2.3 a RMA buněk exprimovala tento protein ve vysokých hladinách a DMF 10.62.3 indukovala vysoké hladiny apoptózy v těchto buňkách (tabulka IV). Tato stimulace apoptózy DMF10.62.3 se zdá být nezávislá na FAS, protože E710.2.3 a RMA-S buňky FAS neexprimují (tabulka IV).

o

Tabulka IV

Buněčná linie	% apoptotických buněk
DMF	Křečci	Žádné	Fluoresc.	% buněk	Barvení na
10.62.3	IgG	ovlivnění	intenzita	barvení	myší fas
			DMF10.62.3/pozitivní na	povrch.
			křečci IgG	DMF10.62.3	exprese
Myši T buněčné
linie
E710.2.3. 86,9	19,8	24,7	27,5	72,6	-
RMA-S 69,6	12,2	14,0	14,5	60,6	-
CTLL 36,4	14,8	16,7	8,88	51,5	-
RF33.70 8,1	8,6	7,8	0,98	0,48	-
Myší B buněčné
linie
LB27.4 16,8	7,1	10,8	1,48	7,0	+
A20 16,2	13,8	12,2	3,3	24,8	+
Lidské buněčné
linie
JURKAT 33,9	12,6	11,8	16,8	49,2	nd
143BTK- 29,7	21,1	20,5	3,8	29,5	nd

Příklad 5: DMF10.62.3 způsobuje homotypickou agregaci v liniích E710.2.3 a vjiných buněčných liniích

Homotypická agregace je biologicky aktivní proces, při kterém jsou buňky stimulovány ke vzájemné adhezi. Agregační studie byly provedeny tak, jak následuje. 10⁵ buněk bylo inkubováno s různými koncentracemi DMF 10.62.3 nebo křeččího IgG nebo bez protilátky ve 200 μϊ kompletního RPMI. Pro otestování účinku inhibitorů, bylo 10⁵ buněk preinkubováno s inhibitorem po 30 minut a poté byla přidána monoklonální protilátka DMF10.62.3 (10 pg/ml) při 6 hodin trvající přítomnosti inhibitoru. Pro otestování vlivu paraformaldehydu na agregaci, byly buňky fixovány v 1% paraformaldehydu po 10 minut, promyty a poté byl na 6 hodin přidán

DMF10.62.3. Agregace byla hodnocena vizuálně. Mikrofotografie byly sejmuty v 6. hodině pomocí termoelektricky chlazené CCD kamery (Princeton Instruments, Trenton, NJ).

- 18CZ 303771 B6

O DMF 10.62.3 bylo zjištěno, že indukuje homotypickou agregaci E710.2.3 v kultuře. V 6. hodině byla pozorována průkazná agregace buněk ovlivněných 5 pg/ml nebo více protilátky. Naopak, žádná agregace nebyla pozorována v případě ovlivnění křeččími protilátkami nebo jenom médiem. Tato agregace byla blokována ovlivněním různými činidly, včetně cytochalasinu B, který přerušuje mikrovlákna aktinu, trifluorperazinu, který inhibuje procesy závislé na kalmodulinu, azidu sodného a 2-deoxyglukozy, které inhibují syntézu ATP a EDTA, která tvoří chelátovou vazbu s Ca² a Mg²⁺. Agregace nebyla naopak ovlivněna kolchicinem, který inhibuje tvorbu mikrotubulů. Agregace byla rovněž inhibována inkubací při 40 °C a ovlivněním paraformaldehydem (tabulka V). Tyto výsledky naznačují, že tato agregace je aktivní proces a nejde jednoio duše o aglutinaci.

Tabulka V

Použitá chemikálie Vliv na buňku Homotypický účinek

cytochalasin B	cytoskelet (ruší integritu
(20 pg/ml)	aktinu mikrofilament)	-
kolchicin	inhibuje tvorbu	+
(20 pg/ml)	mikrotubulů
trifluorperazin	inhibuje procesy	-
(20 μΜ)	závislé na kalmodulinu
azid sodný (0,1%) +	inhibuje syntézu ATP	-

2-deoxyglukóza (5mM)

EDTA	chelátová vazba	-
(10 mM)	Ca2+ a Mg2+
jenom medium	kontrola (žádný vliv)	+
4°C		-
paraformaldehyd		-

DMF 10.623 také způsobuje homotypickou agregaci některých jiných buněčných linií (např., RMA-S, CTLL), které exprimují protein vážící DMF10.62.3. Agregace pouze málo převyšující kontrolní pozadí byla však pozorována u některých jiných DMF10.62.3 pozitivních buněčných linií (např., Jurkat, LB27.4, A20, 143Btk—). Žádná agregace nebyla viditelná u RF33.70, k níž se DMF 10.62.3 neváže.

Tato metoda studia agregace může být použita na pomoc určení, jestli nějaká nová protilátka je jednou z nových antitumorových protilátek tohoto vynálezu.

Příklad 6: DMF 10.62.3 imunoprecipituje 40 kDa protein, který není vázán přes GPI můstek

Pro charakterizaci proteinu vázaného DMF 10.62.3 bylo provedeno ³⁵S značení a imunoprecipitace, jak je uvedeno dále. 5 χ 10⁶ buněk bylo inkubováno po 1 hodinu v médiu neobsahujícím methionin a potom inkubováno 2 hodiny s ³⁵S methioninem při 0,5 mCi/ml. Značené buňky byly lyžovány v imunoprecipitačním pufru, jak popisuje Townsend et al. ((1990) J. lmmunol. 146:2235). Vyjasněné lyzáty byly nejprve ovlivněny křeččím IgG, imunoprecipitovány DMF 10.62.3 navázaným na Protein-A-Sepharosu a analyzovány SDS polyakrylamidovou elektroforézou na 14% gelu. Pro určení molekulární hmotnosti proteinu vážícího DMF 10.62.3,

- 19CZ 303771 B6 byly E710.2.3 buňky 2 hodiny značeny ³⁵methioninem. Imunoprecipitáty značených buněk byly analyzovány SDS-PAGE za redukčních podmínek.

Monoklonáíní protilátka DMF 10.62.3 imunoprecipitovala asi 40 kDa protein z E710.2.3 za redukčních podmínek. Elektroforetická mobilita tohoto proteinu nebyla za redukčních podmínek změněna. Tento pás nebyl pozorován v imunoprecipitátech s normálních křeččím IgG, ani v imunoprecipitátech s anti-MHC protilátkou třídy I, Y-3. 40 kDa protein byl také identifikován v lyzátech povrchově značených buněk E710.2.3 a RMA-S. Některé molekuly buněčného povrchu, jako Thy-1 a Ly-6 A/E jsou vázány na buněčný povrch glykosylfosfatidylinositolovými (GP1) můstky. Tato vazba k povrchu je citlivá na ovlivnění s PI-PLC. Pro určení, jestli je protein rozpoznaný DMF10.62.3 vázaný pomocí GPI, byly RMA-S buňky, které na buněčném povrchu exprimují tento protein, ovlivněny PI-PLC. Toto PI-PLC ovlivnění nesnižovalo DMF10.62.3 barvení, ale snižovalo barvení u molekuly Thy-1, vázané pomocí GPI. Toto nasvědčuje tomu, že 40kDa protein rozpoznaný DMF 10.623 není na buněčný povrch ukotven pomocí GPI.

Příklad 7: Účinek protilátky DMF62.3 in vivo

AKR myši byl injikovány IV nebo IP s 5 x 10⁶ syngenními E710.2.3 tumorovými buňkami a obdržely fyziologický roztok nebo injekci IP od 0,5 mg kontroly nebo protilátky DMF62.3 v počátečním dni a znova o 10 dní později. Přežívání myší bylo sledováno po 50 dní (tabulka VI).

Tabulka VI

Ovlivnění	Přežití	Průměrná doba do smrti
1. fyziologický roztok	0%	35 dní
2. kontrolním protilátka	0%	33 dní
3. DMF62.3	100%	(žádná úmrtí)
Prohlášení o uložení

Hybridomová buněčná linie produkující monoklonáíní protilátku DMF10.62.3 byla přijata (Americkou sbírkou typových kultur) American Type Culture Collection ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, dne 20. července 1999. Hybridomové buněčné linie produkující monoklonáíní protilátky DMF 10.167.4 a DMF 10.34.36 byly přijaty American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, VA, dne 22. července 1999. Tyto hybridomy jsou uloženy za podmínek, které zajišťují, že přístup k těmto hybridomům bude v průběhu vyřizování patentové přihlášky umožněn pouze osobám oprávněným k tomu Komisařem pro patenty a ochranné známky (Commissioner of Patents and Trademarks) podle 37 CFR 1.14 a 35 USC 122. Tyto depozity jsou dostupné dle potřeby zahraničních patentových zákonů v zemích, kde jsou registrováni účastníci druhé strany této předmětné přihlášky nebo jejich potomci. Tomu je třeba však rozumět tak, že zmíněná dostupnost depozit nezakládá udělení povolení pro provozování tohoto předmětného vynálezu zeslabením patentových práv uděleným vládním opatřením.

Předmětné depozity kultur budou uchovány a učiněny dostupné veřejnosti v souhlasu s ustanoveními Budapešťské smlouvy o uchovávání mikroorganizmů, tj., že budou uchovávány se vší péčí

-20 CZ 303771 B6 nezbytnou pro jejich udržení v živém neznečištěném stavu po dobu nejméně 5 let od poslední žádosti o vybavení vzorku depozitu a vjakémkoliv případě po dobu nejméně 30 (třiceti) let od uložení depozitu nebo po vynutitelnou dobu platnosti kteréhokoliv patentu, který může rozhodnout o odtajnění těchto kultur, plus dalších pět let od poslední žádosti o vzorek depozitu. Vkladatel přiznává povinnost nahradit tento depozit v případě, že úschovna nebude schopna vybavit žádost o tento vzorek v důsledku kondičního stavu tohoto depozita. Všechna omezení veřejné dostupnosti depozita předmětných kultur budou neodvolatelně odstraněna po udělení patentu, který je odtajňuje.

Ostatní ujednání

Je třeba porozumět, že i když tento vynález je popsán ve spojení sjeho detailním popisem, je tento předcházející popis zamýšlen jako ilustrace a nikoliv jako nějaké omezení rozsahu tohoto vynálezu, který je definován rozsahem připojených patentových nároků.

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment, vybraná z:

   protilátky produkované hybridomovou buněčnou linií ATCC č. PTA-377, kde uvedenou protilátkou je DMF 10.62.3;

   chimérické protilátky mající konstantní oblasti lidského lehkého a těžkého řetězce a variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce protilátky DMF 10.62.3; a humanizované protilátky mající oblasti určující komplementaritu (CDR) protilátky DMF 10.62.3.
2. 2. Izolovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment podle nároku 1, přičemž tato protilátka indukuje homotypickou agregaci, poté co se naváže na buňku.
3. 3. Izolovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment podle nároku 1, přičemž tato protilátka nebo její antigen vážící fragment se specificky váže k jedné nebo více tumorovým buněčným liniím ze skupiny sestávající z E710.2.3., RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231. PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, JurkataCos.
4. 4. Izolovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment podle nároku 3, přičemž tato protilátka se specificky váže k buňkám E710.2.3.
5. 5. Izolovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, dále obsahující detekovatelnou značkou.
6. 6. Izolovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment podle nároku 5, přičemž tato detekovatelná značka je vybrána ze skupiny sestávajícího z fluorescenčního materiálu, luminiscenčního materiálu, bioluminiscenčního materiálu a radioaktivního materiálu.
7. 7. Izolovaná protilátka nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, přičemž tato protilátka nebo její antigen vážící fragment je konjugován k radioisotopu.
8. 8. Protilátka nebo její antigen vážící fragment podle nároku 7, přičemž tento radioisotop je vybrán ze skupiny sestávající z ¹⁰B, ^2llAt, ²¹²Pb, ^2l2Bi, ^l25I, ^l3lI, ³⁵S a ³H.

   -21 CZ 303771 B6
9. 9. Protilátka nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, přičemž tato protilátka nebo její antigen vážící fragment je konjugován s radionuklidem, který emituje částici vybranou ze skupiny sestávající z alfa částice, beta částice a gamma částice.
10. 10. Hybridom, který produkuje protilátku podle kteréhokoli z nároků 1 až 4.
11. 11. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 9 a farmaceuticky přijatelný nosič.
12. 12. Kit pro diagnózu tumoru, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 9 a instrukce pro její použití.
13. 13. Kit podle nároku 12, vyznačující se tím, že tumor, který má být diagnostikován, je vybrán ze skupiny sestávající z lymfomu thymu, tumoru T-buněk, lymfomu B-buněk, melanomu, osteosarkomu a akutní leukemie T-buněk.
14. 14. Činidlo zacílené na tumorovou buňku, které obsahuje protilátku nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, konjugovaný s detekovatelnou značkou nebo toxickou skupinou.
15. 15. Činidlo podle nároku 14, kde toxická skupina je vybrána ze souboru sestávajícího z radioaktivní molekuly, radionuklidu, radioisotopu atoxinu.
16. 16. Způsob in vitro detekce tumorové buňky u subjektu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    kontakt buněčného vzorku získaného od subjektu s protilátkou nebo jejím antigen vážícím fragmentem podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 in vitro za podmínek dostačujících k umožnění specifické vazby; a detekci veškeré specifické vazby této protilátky nebo jejího antigen vážícího fragmentu k jedné nebo více buňkám ve vzorku, přičemž vazba indikuje přítomnost tumorové buňky v subjektu.
17. 17. Způsob in vitro inhibice proliferace tumorové buňky, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    kontakt této tumorové buňky s množstvím protilátky nebo jejího antigen vážícího fragmentu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, dostatečným pro inhibici proliferace této tumorové buňky.
18. 18. Způsob in vitro indukování apoptózy v tumorové buňce, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    kontakt této tumorové buňky s množstvím protilátky nebo jejího antigen vážícího fragmentu podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, dostatečným pro indukci apoptózy v této tumorové buňce.
19. 19. Způsob podle kteréhokoli z nároků 16 až 18, vyznačující se tím, že tumorová buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk lymfomu thymu, tumoru T-buněk, lymfomu B-buněk, melanomu, osteosarkomu a akutní leukemie T-buněk.
20. 20. Protilátka nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 pro použití při detekci tumorové buňky u subjektu, přičemž specifická vazba této protilátky nebo jejího antigen vážícího fragmentu k buněčnému vzorku od subjektu za podmínek dostačujících k umožnění specifické vazby indikuje přítomnost tumorové buňky u subjektu.

    -22CZ 303771 B6
21. 21. Protilátka nebo její antigen vážící fragment podle nároku 20, přičemž tato tumorová buňka je v pacientovi.
22. 22. Protilátka nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 pro použití při inhibici proliferace tumorových buněk u subjektu.
23. 23. Protilátka nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 pro použití při indukci apoptózy v tumorové buňce.
24. 24. Protilátka nebo její antigen vážící fragment podle kteréhokoli z nároků 20 až 23, přičemž tumorovou buňkou je buňka lymfomu thymu, tumoru T-buněk, lymfomu B-buněk, melanomu, osteosarkomu nebo akutní leukemie T-buněk.
25. 25. Protilátka nebo její antigen vážící fragment podle nároků 23, přičemž tato buňka je in vitro nebo in vivo.
26. 26. Použití cíleného činidla podle nároků 14 nebo 15 pro výrobu kompozice pro selektivní dodávání toxické skupiny do tumorové buňky u savce.
27. 27. Způsob in vitro izolace proteinu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    kontakt vzorku obsahujícího proteiny s protilátkou nebo jejím antigen vážícím fragmentem podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 po dobu a za podmínek dostatečných pro umožnění vzniku komplexů proti látka-prote i n;

    oddělení těchto komplexů, pokud nějaké jsou, z tohoto vzorku; a oddělení tohoto proteinu z tohoto komplexu, čímž je tento protein izolován.