CN1390233A - 抗肿瘤抗体、蛋白质及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与40kDa蛋白质结合的抗体,该蛋白质在肿瘤上表达、但不在正常成人造血细胞上表达。还公开了这些抗体的生产方法和应用。

Description

抗肿瘤抗体、蛋白质及其应用
发明领域
本发明涉及与肿瘤细胞特异性结合的抗体和蛋白质，以及涉及与肿瘤细胞特异性结合的这些抗体的生产方法和应用。
发明背景
E710.2.3细胞系是一种克隆化鼠CD4-CD8-胸腺T淋巴瘤细胞系，最初是从一种AKR/J小鼠的胸腺肿瘤分离的。当低密度自身培养时，E710.2.3不会自动增殖，除非用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)刺激。通过与胸腺细胞或脾细胞结合，可以刺激E710.2.3增殖。但是，当在没有PMA或其它细胞存在下以高密度培养时，E710.2.3可以自动增殖。如果将E710.2.3注入同系小鼠中，它则长成淋巴器官和胸腺中的恶性肿瘤。
发明概述
本发明是基于发现如下单克隆抗体，这些单克隆抗体可与在多型肿瘤细胞的表面表达的40kDa蛋白质特异性结合，但不与正常成人造血细胞结合。这些新的单克隆抗体可阻断与其特异性结合的肿瘤细胞的增殖并诱导编程性细胞死亡。
基于这些发现，本发明特别描述了单克隆抗体或其抗原结合片段，其中单克隆抗体(a)与胎儿胸腺细胞结合；(b)与该细胞结合时抑制细胞的增殖；并(c)不与成人胸腺细胞结合。这些单克隆抗体在与细胞结合时也可诱导同型聚集、诱导与其结合细胞的编程性细胞死亡、并可与E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos中的一种或多种肿瘤细胞系特异性结合。可以用例如可检测的标记物标记这些抗体。
由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377产生的单克隆抗体DMF 10.62.3、由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-405产生的单克隆抗体DMF 10.167.4、由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-404产生的单克隆抗体DMF 10.34.36也在本
发明范围内。
本发明还描述了单克隆抗体，它们与杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-405或杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-404产生的单克隆抗体结合的蛋白质相同的蛋白质结合。该单克隆抗体可以人源化。
另一方面，本发明描述了单克隆抗体或其抗原结合片段，它与杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、杂交瘤细胞系PTA-404或杂交瘤细胞系PTA-405产生的单克隆抗体结合的40kDa蛋白质相结合。
还有一方面，本发明描述了嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，它们与杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-405或杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-404产生的单克隆抗体结合的相同的蛋白质结合，其中嵌合抗体包括非人可变区和轻链和重链的人的恒定区。
还有一方面，本发明描述了单克隆抗体或其抗原结合片段，它们与杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-405或杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-404产生的单克隆抗体结合的表位相同的表位结合。
本发明还描述了单克隆抗体或其抗原结合片段，它们与具有下列特征的蛋白质特异性结合：(i)分子量为40kDa；(ii)在胎儿胸腺细胞表面表达；(iii)在成人胸腺细胞表面无表达；(iv)与该抗体结合时能阻断细胞增殖；和(v)与抗体结合时能诱导同型聚集。该单克隆抗体与一种蛋白质特异性结合，该蛋白质的特征还在于(vi)与该抗体结合时能诱导细胞的编程性细胞死亡；和(vii)在包含E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos的一种或多种肿瘤细胞系的细胞表面表达。
本发明还描述了本文所述的单克隆抗体的抗原结合片段。该抗原结合片段可以用例如可检测的标记物进行标记。
本发明还描述了产生本文所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。例如，本发明描述了杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-405或杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-404。
本发明还描述了一种实质上纯的蛋白质，其特征在于：(i)分子量为40kDa；(ii)在胎儿胸腺细胞表面表达；(iii)在成人胸腺细胞表面无表达；(iv)能阻断本文所述抗体所结合的细胞增殖；和(v)能诱导本文所述与抗体结合时的同型聚集。该蛋白质还可具有以下特征(vi)在包含E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos的一种或多种肿瘤细胞系的细胞表面表达，和(vii)能诱导本文所述的抗体结合细胞的编程性细胞死亡。
另一方面，本发明描述了与单克隆抗体结合的实质上纯的蛋白质，该单克隆抗体由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、杂交瘤细胞系PTA-405或杂交瘤细胞系PTA-404产生。
本发明还描述了包含本文所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体的一种药物组合物。
本发明还描述了一种检测受检者体内肿瘤细胞的方法，该方法包括将受试者细胞样品与本文所述的一种或多种单克隆抗体结合，并且检测该抗体与样品的结合，其中结合表示受检者体内有肿瘤细胞存在。肿瘤细胞的例子包括胸腺淋巴瘤、T细胞瘤、B细胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤和急性T细胞白血病。该肿瘤细胞也可存在于患者体内。可以对用于检测肿瘤的单克隆抗体进行标记。
本发明还描述了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括：将该肿瘤细胞与其量足以抑制肿瘤细胞增殖的本文所述的单克隆抗体接触。
在另一个实施方式中，本发明描述了一种诱导细胞的编程性细胞死亡的方法，该方法包括：将该细胞与其量足以诱导细胞的编程性细胞死亡的本文所述的一种或多种单克隆抗体接触，该细胞可以是选自由胸腺淋巴瘤、T细胞瘤、B细胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤和急性T细胞白血病的肿瘤细胞。该细胞可以是体外或体内的细胞。
本发明也包括一种肿瘤诊断试剂盒，该试剂盒包含本文所述的一种或多种单克隆抗体及其使用说明。该试剂盒可以含有选自胸腺淋巴瘤、T细胞瘤、B细胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤和急性T细胞白血病的肿瘤细胞。本发明还包括一种肿瘤细胞导向剂，它包含本文所述的一种或多种单克隆抗体，该抗体可与一种成分缀合以将该成分传递至肿瘤细胞。该成分的例子包括抗肿瘤剂、细胞毒素、细胞因子或信息组(reporter group)。
本发明的另一个实施方式是选择性地将一种成分传送至哺乳动物肿瘤细胞的方法。该方法包括：对哺乳动物给予本文所述的与一种成分连接的导向剂，和给予充分的时间以使导向剂到达肿瘤细胞、其中导向剂中的抗体与肿瘤细胞结合，由此选择性地将该成分传递至哺乳动物肿瘤细胞。该成分的例子包括抗肿瘤剂、细胞毒素、细胞因子和信息组。
本发明还包括一种分离本文所述40kDa蛋白质的方法。该方法包括：将含该蛋白质的样品与本文所述的单克隆抗体结合一定时间、并且该结合是在足以形成单克隆抗体/蛋白质复合物的条件下进行的，如果需要，则从该样品中取出一种或多种复合物，从该复合物中取出蛋白质，由此分离该蛋白质。
“分离的核酸序列”是实质上没有与自然产生的生物体基因组中的核酸序列侧面相接基因的核酸序列。因此该术语包括掺入载体、掺入自主复制的质粒或病毒、或掺入原核生物或真核生物的基因组核酸序列的重组核酸序列。也包括单独的分子，例如cDNA、基因组片段、由聚合酶链反应(PCR)产生的片段或限制片段。
与蛋白质“特异性结合”的抗体是一种与蛋白质结合的抗体，但不识别和结合样品(例如生物学样品)中的其它分子，所述样品自然包括蛋白质，如40kDa蛋白质。
“保存性”氨基酸置换是指其中一种氨基酸残基被具有相似侧链的另一种氨基酸残基代替的替换。本领域中已经对具有相似侧链的氨基酸残基家族进行了规定。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在保存性置换中，氨基酸家族中的任何一个都可用于代替该家族的任何其它成员。
本文可互换使用的术语“多肽、肽和蛋白质”是指氨基酸残基的链。
抗体的“抗原结合片段”是能与抗原上的表位结合的抗体部分，例如40kDa蛋白质，它被全部抗体结合。
“表位”是抗原的特殊区域，例如，一种与抗体结合并能引起免疫应答的蛋白质。
“实质上纯的”40kDa蛋白质是指至少为60重量％的40kDa蛋白质，不含与其天然相随的蛋白质和天然存在的有机分子。该制剂较佳为至少75重量％、更优选至少90重量％、最优选至少99重量％的40kDa蛋白质。例如，可通过使用本文所述的抗体或单克隆抗体的亲和层析和/或通过物理学纯化技术获得实质上纯的40kDa蛋白质。
“分离的”抗体是指实质上不含与其天然相随的其它天然存在的有机分子的一种抗体。
阻断细胞增殖的抗体或其它分子是指抑制细胞循环、分裂或抑制两者的抗体或分子。
“同型聚集”是指生物活性过程，由此刺激同型细胞相互粘附。
“信息组”是一种具有诸如发光、荧光、酶活性、电子密度或放射性之类的物理或化学特性的分子或化合物，这些特性可通过适合的检测器系统或方法很容易测定或检测。
除非另有定义，所有本文使用的技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等同的方法和原料可用于本发明的实践或试验中，但适合的方法和原料如下所述。本文所述的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献全部引作参考。在出现冲突的情况下，本说明书、包括定义将进行控制。另外，原料、方法和实施例仅仅是举例说明而不是为了限定。
本发明描述了识别在肿瘤细胞上表达的40kDa蛋白质的抗体。这些抗体可用于抑制肿瘤细胞增殖和诱导与其特异性结合的肿瘤细胞的编程性细胞死亡。在诊断上可使用这些单克隆抗体(例如，测定恶性细胞的存在)、或治疗上可以将其本身或通过它们传递所附着的抗肿瘤剂来用于治疗肿瘤细胞。
本发明的其它特征和优势从下列详细的说明书和权利要求书中是显而易见的。
附图的简要说明
图1A-D是表示以DMF 10.62.3检测的E7 10.2.3(图1A)、A20(图1B)、Jurkat(图1C)和RF33.70(图ID)上40kDa蛋白质表达的四个流动细胞计数图。
图2A-D是表示以DMF 10.62.3检测的14天胎儿胸腺(图2A)、成人全脾A20(图2B)、成人全胸腺(图2C)和成人全部骨髓(图2D)上40kDa蛋白质表达的四个流动细胞计数图。
图3A-G是表示以DMF 10.62.3检测的未刺激的新鲜收集的T和B细胞(图3A)、24小时时激活的T细胞(图3B)、48小时时激活的T细胞(图3C)、72小时时激活的T细胞(图3D)、24小时时激活的脾脏B细胞(图3E)、48小时时激活的脾脏B细胞(图3F)和72小时时激活的脾脏B细胞(图3G)上40kDa蛋白质表达的七个流动细胞计数图。
图4A-C是表示单克隆抗体DMF10.62.3抑制E710.2.3细胞(图4A)、RMA-S细胞(图4B)或RF33.70细胞(图4C)自发增殖的三个线性图。
图5A-I是表示用1μg/ml DMF10.62.3处理1小时的E710.2.3细胞(图5A)、用1μg/ml DMF10.62.3处理2小时的E710.2.3细胞(图5B)、用1μg/mlDMF10.62.3处理3小时的E710.2.3细胞(图5C)、用仓鼠IgG处理3小时的E710.2.3细胞(图5D)、用15μg/ml DMF10.62.3处理1小时的E710.2.3细胞(图5E)、用15μg/ml DMF10.62.3处理2小时的E710.2.3细胞(图5F)、用15μg/ml DMF10.62.3处理3小时的E710.2.3细胞(图5G)、用仓鼠IgG处理3小时的E710.2.3细胞(图5H)、和无抗体的E710.2.3细胞(图5I)中编程性细胞死亡的诱导的九个流动细胞计数图。
详细描述
本发明描述了抗体，例如单克隆抗体，该抗体与40kDa蛋白质特异性结合。该40kDa蛋白质是一种在各种肿瘤细胞上和在包括人、猴和小鼠的各种不同种中表达的新的细胞表面蛋白质，该肿瘤细胞包括胸腺淋巴瘤、T细胞瘤、B细胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤、或急性T细胞白血病细胞。这些抗体对正常成人造血细胞无反应性。当将本发明的抗体与一种表达40kDa蛋白质的细胞结合时，该细胞停止增殖并进行编程性细胞死亡。根据当单克隆抗体与细胞上的这种蛋白质结合时细胞进行编程性细胞死亡这一观察，可见该40kDa蛋白质是一种诱导死亡的新蛋白质。
与40kDa蛋白质特异性结合并产生单克隆抗体的三种杂交瘤细胞系已经由ATCC以登记号PTA-377(DMF10.62.3)、登记号PTA-405(DMF10.167.4)、或登记号PTA-404(DMF10.34.36)进行了保藏。
本文所述的抗体有各种用途。这些抗体可用于体外诊断检测以确定哺乳动物如人、组织中的恶性细胞的存在。通过给患者使用用信息组标记的本文所述的分离抗体也可将这些抗体用于局限体内的肿瘤。这些抗体也具有治疗学应用。另外，这些抗体可用于治疗肿瘤或传送抗肿瘤剂。制备抗体的方法
抗体是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性蛋白质。免疫球蛋白分子片段的例子包括抗体的片段，例如F(ab)和F(ab′)2部分，它们可与40kDa蛋白质特异性结合。通过用诸如胃蛋白酶的酶处理抗体可产生这些片段。术语单克隆抗体或单克隆抗体组合物是指仅含一种能与多肽或蛋白质的特殊表位产生免疫反应抗原结合位点的一群抗体分子。因此单克隆抗体组合物对与其特异性结合的蛋白质尤其具有单一的结合亲和力。免疫
通过用含适当免疫原的免疫原性制剂免疫适合的受试者(例如，家兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)，可产生抗40kDa蛋白质的多克隆或单克隆抗体。免疫原包括以下细胞，例如来自无限增殖化细胞系E710.2.3、RMA-S、CTLL、LB17.4、A20、WEHI-231、PBK101A2、C2.3、B16、MC57、WOP-3027、293T、143Btk、Jurkat或Cos的细胞，已证实它们均表达新的40kDa蛋白质。
或者，免疫原可以是纯化的或分离的40kDa蛋白质自身。例如，采用亲和层析、免疫沉淀或本领域众所周知的其它技术，由以ATCC No.PTA-377、PTA-405或PTA-404保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体可用于从产生该蛋白质的细胞，例如E710.2.3、RMA-S、CTLL、LB17.4、A20、WEHI-231、PBKlOlA2、C2.3、B16、MC57、WOP-3027、293T、143Btk、Jurkat或Cos中分离该蛋白质。
然后可以筛选受试者体内产生的抗体以确定这些抗体是否与胎儿胸腺细胞结合而不与成人胸腺细胞结合。在本文所述的测定中可对这些抗体进一步筛选。例如，可将这些抗体用于确定它们是否抑制与它们结合的细胞的细胞增殖；是否诱导细胞的同型聚集；和/或诱导与它们结合的细胞的编程性细胞死亡。确定具有所需特性的抗体的适合方法在本文进行了描述。例如，用购自R & D(Minneapolis，MN)或Pharmingen(San Diego，CA)的试剂盒可以测定一种抗体与细胞结合时的诱导细胞死亡的能力。
免疫原(例如，纯化蛋白质，表达该蛋白质的肿瘤细胞，或重组表达的40kDa蛋白质)的单位剂量和免疫方案将根据要进行免疫的受试者、其免疫情况、和受试者的体重而决定。为了增强受试者的免疫应答，可以将免疫原与佐剂例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂一同给药。上面所述的用免疫原免疫受试者诱导了多克隆抗体应答。采用诸如ELISA的标准技术，用固定化抗原如本文所述的40kDa蛋白质，可以对所免疫的受试者的抗体滴度作经时性监测。
产生抗40kDa蛋白质的抗体的其它方法包括使用表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(参见例如，Wood等，PCT公开文本WO 91/00906，Kucherlapati等，PCT公开文本WO 91/10741；或Lonberg等，PCT公开文本WO 92/03918)。或者，通过将一种抗原导入免疫缺陷小鼠可产生人单克隆抗体，该小鼠已移植了人的产抗体细胞或组织(例如，人骨髓细胞、外周血淋巴细胞(PBL)、人胎儿淋巴节组织、或造血干细胞)。这些方法包括在SCID-hu小鼠(参见Duchosal等，PCT公开文本WO 93/05796；美国专利No.5,411,749；或McCune等(1988)《科学》241：1632-1639))或Rag-1/Rag-2缺陷小鼠中产生抗体。人抗体-免疫缺陷性小鼠也是市售可获得的。例如，Rag-2缺陷性小鼠可从Taconic Farms(Germantown，NY)获得。杂交瘤
通过用免疫原免疫受试者可产生单克隆抗体。在免疫后的适当时间，例如，当抗体滴度水平足够高时，可从免疫动物收获产生抗体的细胞，并用标准技术制备单克隆抗体。例如，通过标准的体细胞融合方法、用无限增殖细胞如骨髓瘤细胞以得到杂交瘤细胞，可融合产生抗体的细胞。这些技术均是本领域众所周知的，包括，例如开发的最初杂交瘤技术(Kohler和Milstein(1975)自然，256：495-497)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等，(1983)今日免疫学(Immunology Today)，4：72)、和用于产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)单克隆抗体和癌治疗，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。产生单克隆抗体杂交瘤的技术是众所周知的。
也可通过从已用40kDa蛋白质免疫的表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠收获产生抗体的细胞例如脾细胞来制备单克隆抗体。通过与人骨髓瘤的融合或通过用Epstein-Barr病毒(EBV)的转化可使脾细胞无限增殖化。用本领域所述的人B细胞或EBV-杂交瘤技术可制备这些杂交瘤(参见，例如，Boyle等，欧洲专利出版物No.0 614 984)。
通过筛选杂交瘤培养物上清液、例如筛选选择与固定化40kDa蛋白质特异性结合的抗体，或通过测试本文所述的抗体以确定抗体是否具有所需的特性，例如抑制细胞增殖的能力，可检测产生与40kDa蛋白质特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞。可以将在本文所述的筛选测定中测试阳性的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞在营养培养基中进行条件培养、并培养一定时间以使杂交瘤细胞分泌单克隆抗体至培养基中，由此产生全部抗体。适合杂交瘤细胞的组织培养技术和培养基一般是本领域所述的(参见，例如，R.H.Kenneth，单克隆抗体：生物学分析中的新标准(MonoclonalAntibodies：A New Dimension In Biological Analyses)，Plenum出版公司，New York，New York(1980)。然后可收集含抗体的杂交瘤条件杂交瘤培养物上清液。重组组合的抗体库
通过构建重组组合的免疫球蛋白文库和用40kDa蛋白质筛选该文库可改造单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可以从市售获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统(Recombinant Phage AntibodySystem)，Catalog No.27-9400-01；和Stratagene SurfZAP噬菌体展示试剂盒(Phage Display Kit)，Catalog No.240612)。简言之，筛选抗体文库以确定和分离表达与40kDa蛋白质特异性结合的抗体的噬菌体。在一个优选的实施方式中，文库的初期筛选包括用固定化40kDa蛋白质的筛选。
筛选后，分离展示噬菌体、并可从展示噬菌体(例如，从噬菌体基因组)回收编码所选择的抗体的核酸、并通过众所周知的重组DNA技术将该核酸亚克隆至其它表达载体中。可将此核酸进一步处理(例如，与编码另外的免疫球蛋白结构域如另外的恒定区的核酸连接)和/或在宿主细胞中表达。嵌合抗体和人源化抗体
也可制备重组形式抗体例如嵌合抗体和人源化抗体以使病人对抗体的应答最小。当治疗上将非人被试者所产生的抗体或来源于非人抗体基因表达的抗体用于人时，它们在不同程度上被识别为外来抗体，患者体内可能产生免疫应答。使这种免疫反应最小化或消除这种免疫反应的一种方法是产生嵌合抗体衍生物，即联合非人的动物可变区和人的恒定区的抗体分子。这些抗体保留有原始的单克隆抗体的表位结合特异性，但当对人给药时可能较少致免疫性，因此更可能为患者所忍受。
可以用本领域已知的重组DNA技术制备嵌合单克隆抗体。例如，用编码人恒定区的基因置换编码非人抗体分子恒定区的基因(参见，Robinson等，PCT专利公开文本PCT/US86/02269；Akira，等，欧洲专利申请184,187；或Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496)。可以通过用人的可变区的等同部分代替不涉及结合抗原的可变区部分来进一步使嵌合抗体“人源化”。“人源化”嵌合抗体的总的评述由Morrison，S.L.(1985)《科学》，229：1202-1207和Oi等(1986)《生物技术》，4：214提供。这些方法包括，从至少一个重链或轻链分离、处理和表达编码全部或部分免疫球蛋白可变区的核酸序列。然后可将编码人源化嵌合抗体或其片段的cDNA克隆入适当的表达载体中。或者可通过互补性决定区(CDR)置换来生产适合的“人源化”抗体(参见美国专利5,225,539；Jones等(1986)《自然》321：552-525；Verhoeyan等(1988)科学239：1534；和Beidler等(1988)免疫学杂志141：4053-4060)。
表位印记也可用于生产“人”抗体多肽二聚物，该二聚物保留有对40kDa蛋白质专一的仓鼠抗体的结合特异性，其中40kDa蛋白质是由以ATCC No.PTA-377、ATCC No.PTA405、或ATCC No.PTA-404保藏的杂交瘤制备的。简言之，使编码与抗原和人恒定区(CH1)特异性结合的非人可变  区(VH)的基因在大肠杆菌中表达、并用人类VλCλ基因的噬菌体文库感染。然后筛选噬菌体展示抗体片段以结合40kDa蛋白质。对所选择的人类Vλ基因再克隆以表达VλCλ链，用人类VHCH1基因的噬菌体文库感染保护这些链的大肠杆菌，并将该文库进行采用涂布抗原的试管的筛选循环。参见Hoogenboom等，PCT公开文本WO 93/06213。抗体片段
本发明包括新的抗肿瘤抗体和含该抗体的活性结合区的任何片段，例如，Fab，F(ab’)2和Fv片段。可使用本领域已经建立的技术从该抗体中制备这些片段(参见，例如，Rousseaux等，<免疫学方法>，121：663-69，Academic出版社，(1986))。例如，通过胃蛋白酶消化该抗体分子可产生F(ab’)2片段，通过减少F(ab’)2的二硫键可产生Fab片段。抗体的利用
本文所述的抗体具有各种用途。这些抗体可用于体外诊断以确定人组织中的恶性细胞的存在。该方法包括检测组织样品中40kDa蛋白质的存在。例如，可将组织样品与单克隆抗体结合，该单克隆抗体由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、ATCC No.PTA-405或ATCC No.PTA-404，产生，并检测组织样品中抗体与该细胞特异性结合的能力。结合表示肿瘤细胞存在。或者，也可将该抗体用于筛选血液样品的释放性抗原。
通过给患者使用以具有可监测信号的信息组标记的本发明的分离抗体也可将这些抗体用于局限体内的肿瘤。然后用外闪烁显像术、发射断层成像术、或放射性核素扫描检测结合抗体。该方法可用于根据疾病的程度对患者的癌症分级，并监测对治疗的反应变化。
这些抗体也具有治疗学应用。新抗体可用于治疗肿瘤，因为抗体与肿瘤细胞的特异性结合可导致细胞停止增殖并死亡。
治疗上抗体也可用作例如导向剂以将抗肿瘤剂传递至肿瘤。这些抗肿瘤剂包括化疗药物、毒素、免疫应答调节剂、酶和放射性同位素。可检测的标记物
诊断上与40kDa蛋白质反应的抗体可用于例如检测患者体内肿瘤的存在。通过将抗体与可检测的标记物结合可有利于检测。可检测的标记物包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、电子密度标记物、MRI的标记物和放射性物质。适合的酶包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合体包括例如链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光物质包括例如伞形酮、荧光黄、荧光黄异硫氰酸酯、若丹明、二氯三吖嗪基胺荧光黄、丹磺酰氯或藻红素；发光物质包括例如鲁米诺；生物发光物质包括例如荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；适合的放射性物质包括例如125I、131I、35S或3H。作为导向剂的抗体
可以将本文所述的抗体和抗体片段与一种成分接合、并且可以将该抗体用于指示该成分到达表达40kDa蛋白质的肿瘤细胞部位。这些成分包括例如毒素、放射性核素，或可用于杀死肿瘤细胞的化学治疗剂，或可用于使表达40kDa蛋白质的肿瘤定位和定大小的显象剂。用于指示所述成分到达人的肿瘤的抗体优选单克隆抗体，例如人源化单克隆抗体。
可以将抗体融合于该成分，例如毒素，借助该成分和被编码杂交蛋白质分子的融合基因所编码的抗体，或者通过接合作用，例如非肽共价键，如非酰胺键，它用于单独连接所产生的抗体和该成分。
也可将此处所述的抗体与另一种抗体融合，该抗体对免疫细胞具有专一性并刺激免疫细胞以杀死肿瘤。毒素
有用的毒素分子包括肽毒素，当存在于细胞内时它是重要的细胞毒素。毒素的例子包括细胞毒素、破坏酶活性的代谢破坏剂(抑制剂和活化剂)，由此杀死肿瘤细胞，以及在效应物部分的规定半径内杀死所有细胞的放射性分子。代谢破坏剂是一种诸如酶或细胞因子的分子，它们改变细胞的代谢以致于改变其正常功能。广义上，术语毒素包括引起肿瘤细胞死亡的任何效应物。
许多肽毒素具有一般化真核受体结合区域；在这些情况下，必须使毒素改性以阻止杀死细胞而不产生导向蛋白质(例如，阻止杀死不载有40kDa蛋白而具有未改性毒素受体的细胞)。必须以保持分子的细胞毒素功能的方式进行这些改性。可能有用的毒素包括但不限于：白喉毒素、霍乱毒素、篦麻毒蛋白、0-志贺样毒素(SLT-I，SLT-II，SLT-IIv)，、LT毒素、C3毒素、志贺菌毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、假单胞杆菌属外毒素、alorin、皂苷、modeccin，、和gelanin。其它毒素包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和淋巴毒素(LT)。具有抗肿瘤活性的另一种毒素是刺孢霉素γ1，一种具有相当强度抗肿瘤能力的含二炔-烯抗肿瘤抗生素(Zein，N.，等，《科学》，240：1198-201(1988))。
例如，可将白喉毒素与本文所述的抗体接合。在Murphy的美国专利No.4,675,382中详细描述了白喉毒素，其序列是已知的，该文献在此引作参考。天然白喉毒素分子隐藏在白喉棒杆菌中，该杆菌含可被鉴定的7个功能区域，起始于分子的氨基末端，作为酶催化活性片段A(氨基酸Gly1-Arg193)和片段B(氨基酸Ser194-Ser535)，它包括易位区域和非特异性细胞结合区域(氨基酸残基475-535)。毒素与抗体的连接
可以以几种方式的中任何一种连接抗体和毒素成分。如果化合物是通过融合基因的表达制备的，则肽键作为细胞毒素和抗体之间的连接。或者，可以分别制备毒素和抗体、随后用非肽共价键的方式接合。例如，共价连接可采取二硫键的形式。在此情况下，通过常规方法可以改造编码这种抗体的DNA、以含有特殊的半胱氨酸密码子。
对于二硫键连接，用巯基基团与改性抗体的半胱氨酸反应也可以得到毒素分子。在肽毒素的情况下，可以通过在编码该毒素的DNA序列中插入半胱氨酸密码子来完成这种连接。或者，采用固相多肽技术可以导入巯基(其本身或作为半胱氨酸残基的一部分)。例如，Hiskey，《多肽》，3：137(1981)描述了将巯基导入多肽中。
也可根据Bacha等的美国专利No.4,468,382中所述的肽激素的衍生方法进行衍生。Maasen等，<欧洲生化杂志>134：32(1983)中描述了将巯基导入蛋白质中。一旦存在所需的巯基，则纯化细胞毒素和抗体，减少两种硫基团，混合细胞毒素和抗体(按大约1∶5-1∶20的比例)，在室温下完成使二硫键形成(通常20-30分钟)。然后以磷酸缓冲盐水透析该混合物以除去未反应的抗体和毒素分子。将SephadexR层析法或类似方法用于根据分子大小将所需的毒素-抗体缀合化合物与毒素-毒素和抗体-抗体缀合物分离。免疫应答调节剂
抗肿瘤成分也可以是免疫系统调节剂，其在局部水平激活或者抑制机体的免疫系统。例如，细胞因子，如，被释放至肿瘤的淋巴因子如IL-2可以引起肿瘤附近的细胞毒性T淋巴细胞或自然杀伤细胞的增殖。放射性分子
组成成分或信息组也可以是放射性分子，例如放射性核苷酸，或所谓的光敏剂，如前体分子，它们在特定情况下变成具有放射性，例如，在所谓的“硼中子截留疗法”(BNCT)中、当暴露于低能量中子束时的硼。Barth等， Scientific American，October 1990：100-107(1990)。含这种放射性效应子部分的化合物可用于抑制肿瘤细胞增殖和用于显象目的的标记肿瘤细胞。
放射性核素是可以发射α、β或γ粒子的单原子放射性分子。α粒子发射体优于β或γ粒子发射体，因为它们释放短距离的很高能量发射，因此有效而不显著穿透和损害正常组织。适合的发射α粒子的放射性核素包括211At、212Pb和212Bi。
放射性分子必须与抗体直接或通过双功能螯合紧紧地连接。这种螯合不允许洗脱和由此而产生的体内放射性分子的过早释放。Waldmann，<科学>，252：1657-62(1991)。为了使BNCT适于本发明，选择硼的稳定同位素如硼10作为化合物的抗肿瘤成分或效应子部分。通过抗体与肿瘤细胞的特异性结合将硼传送并浓集在肿瘤细胞中或其上。在允许足够量硼积聚的一段时间后，肿瘤成像并用低能量中子束照射，该中子束具有约0.025eV的能量。当该中子照射时，其本身对肿瘤周围的健康组织、或肿瘤本身极少引起损伤，硼10(例如，在肿瘤细胞表面)截留中子，从而形成一种不稳定的同位素硼11。硼11立即分裂，产生锂7核和有能量的α粒子，大约2.79百万Ev。这种大能量的粒子是高度致死的、但非常局限的放射形式，因为粒子仅有约一个细胞直径(10微米)的路径长度。
计算表明，为了消灭肿瘤细胞，每平方厘米约需要1百万硼原子和1012-1013个中子的热中子流，因此由α粒子产生的照射超过了氮和氢中子截留反应产生的背景照射。显像成分
本文的抗体可与40kDa蛋白质特异性结合、因此也可用于检测人的肿瘤。一种方法是通过使用以适合的成分或信息组(例如产生可检测信号的显象试剂)标记的抗体进行肿瘤显像的技术来检测体内的肿瘤。显象试剂和用这些试剂标记抗体的方法是众所周知的(参见，例如，Wensel和Meares，<放射免疫成像和放射免疫治疗>  Elsevier，New York(1983)；Colcher等，<酶学方法>(Meth.Enzymol.)，121：802-16(1986))。通过诸如放射性核素扫描的技术可以检测被标记的抗体(参见，例如，Bradwell等，<用于癌症检测和治疗的单克隆抗体>，Baldwin等(编辑)，pp.65-85，Academic出版社(1985))。给药
可以将本文所述的抗体对受治疗者如动物或人给药、以使肿瘤显象或治疗肿瘤。该抗体可以单独给药、或以混合物的形式给药，例如，在药学上可接受的赋形剂或载体(例如，生理盐水)存在下给药。根据给药方式和途径选择赋形剂或载体。在本领域众所周知的参考教科书<Remington的药物科学>(E.W.Martin)和USP/NF(United States Pharmacopeia和the NationalFormularly)中描述了适合的药学载体。
将药物组合物配制成适合于所需的给药途径。给药途径例如包括非肠道的，如静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于非肠道、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括下列组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螫合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和渗透压调节剂，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。可以将非肠道制剂装在安瓿、一次性注射器、或多剂量玻璃或塑料小瓶中。
本发明组合物的最有效的给药方式和剂量方案根据疾病的严重程度和病程、患者的健康和对治疗的反应、以及治疗医师的判断来决定。因此，该组合物的剂量应个体化。本发明抗体组合物的有效量是约1μg-约5000mg，优选约1-500mg、或优选约100-200mg。诊断试剂盒
本发明还包括实施上面所公开的方法的诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括(a)本文所述的单克隆抗体、和(b)抗体特异性结合配偶体与检测结合抗体的标记物的结合体。该试剂盒也可包括辅助剂，例如缓冲剂和蛋白质稳定剂，例如多糖等。如需要，该诊断试剂盒还可包括信号产生系统的其它成分，该系统包括减少背景干扰的试剂、控制试剂、和进行测试的装置。在另一个实施方式中，该诊断试剂盒包括本发明的单克隆抗体和能产生可检测信号的标记物的结合体。上述辅助剂也可以存在。通常还包括如何使用诊断试剂盒的说明。多肽
本文所述的单克隆抗体可用于分离和鉴定与其结合的40kDa蛋白质。被单克隆抗体识别的蛋白质是一种在各种肿瘤细胞上发现的新的细胞表面蛋白质，该肿瘤细胞包括胸腺淋巴瘤、T细胞瘤、B细胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤、或急性T细胞白血病细胞。根据观察，当单克隆抗体与这种蛋白质结合时，有该蛋白质表达的细胞即死亡，表明这种蛋白质是一种诱导死亡的分子。
可以从该表达蛋白质的细胞(例如，E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat，或Cos)中分离被本发明的单克隆抗体识别的蛋白质。例如，本文所述的单克隆抗体可用于免疫沉淀该蛋白质。为了测定该蛋白质的序列，可以用SDS-PAGE纯化该蛋白质、电印记在Immobilon膜(Millipore Corp.，Bedford，MA)上、并用考马斯亮蓝使此膜染色。然后可用剃刀切下被染色的蛋白质带(Mr＝40kDa)、以用于随后的氨基末端序列分析。氨基末端序列分析是本领域众所周知的，例如自动埃德曼降解法。
本发明还描述了融合蛋白质，该蛋白质包括与不相关的蛋白质融合的40kDa蛋白质。可以选择这种不相关蛋白质以有利于纯化、检测、增溶、或提供一些其它作用。可以合成制备融合蛋白质、或用适当的偶联试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)将该蛋白质与不相关蛋白质连接。或者，可以通过将表达融合蛋白质的核苷酸序列克隆至适当的表达载体中来重组制备融合蛋白质。然后可以从培养基或从细胞的溶解产物中纯化该重组融合多肽。
40kDa蛋白质是有用的，例如作为对某些肿瘤致免疫的疫苗。制备这些疫苗的方法在本领域是已知的(参见，Estin等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)，85：1052(1988))。简言之，构建重组病毒以表达克隆的肿瘤相关蛋白质。以重组病毒感染的细胞将在细胞表面表达该蛋白质及宿主的组织相容性抗原和免疫原性病毒蛋白质。这有利于诱导细胞的免疫性，它在肿瘤排斥中起关键作用。
本发明还提供了鉴定调节剂，即与40kDa蛋白质结合或对40kDa蛋白质的表达或活性具有刺激或抑制作用的试验化合物或试剂(例如，肽、肽类似物、小分子或药物的方法。例如，40kDa蛋白质的拮抗剂将用于抑制细胞的编程性细胞死亡。这种拮抗剂在抑制患者不利的编程性细胞死亡中起一定作用。
实施例实施例1：抗瘤抗体的产生
在一项鉴别新的功能分子(它可能与淋巴瘤的生长或存活和/或正常胸腺细胞功能有关)的尝试中，从注射过E710.2.3的仓鼠如下产生杂交瘤。亚美尼亚仓鼠腹膜内注射1×107个E710.2.3，并且融合之前加强7-10倍，采用如介绍过的融合助手P3X63-AG8.653进行融合(Schreiber等人，(1985)Immunol 134：1609)。来自杂交体的上层清液首先采用免疫荧光法和流式细胞术筛选结合E710.2.3A的能力。一种特别的抗体，本文称为DMF10.62.3，明亮地沾染E710.2.3表面。
免疫荧光分析揭示DMF10.62.3与大量的鼠细胞系(表I)反应，但其它一些细胞系未见这种反应(表II)。阳性细胞系包括一些T细胞系(例如，RMA-S)，几种B细胞淋巴瘤(例如A20和WEHI-231)，和巨噬细胞细胞系(C2.3)。DMF10.62.3也特异性地结合于几种非生血源的无限增殖化细胞，诱导基质细胞系(PBK101A2)、黑瘤(B16)、肉瘤(MC57)和多瘤转化的成纤维细胞(WOP-3027)。几种其它的未成熟的(例如，G58.2)和成熟的T细胞(例如，EL4)、巨噬细胞(例如，A3.1)、树状细胞(DC2.4)、和成纤维细胞细胞系(LADp3 1)对于DMF10.62.3是阴性的。有趣的是，mAb亦与几种人无限增殖化细胞系反应，包括Jurkat、293T和143Btk-以及猴SV40-转化肾细胞系，Cos7。DMF10.62.3不能结合某些人细胞系，例如B成淋巴样细胞(lymphoblastoid cell)721，和子宫颈癌HeLa细胞。代表性细胞系的染色方式如图1所示，DMF10.62.3-阳性细胞E710.2.3(图1A)，A20(图1B)和Jurkat(图1C)以及DMF10.62.3-阴性细胞，RF33.70(图1D)
                              表I
     细胞系                   描述
     E710.2.3                 鼠胸腺淋巴瘤
     RMA-S                    鼠T细胞瘤
     CTLL                     鼠IL-2依赖性T细胞系
     LB27.4                   鼠B细胞杂交瘤
      A20                       鼠B细胞淋巴瘤
      WEHI-231                  鼠B细胞淋巴瘤
      PBK101A2                  鼠胸腺基质细胞系
      C2.3                      鼠无限增殖化骨髓巨噬细胞
      B16                       鼠黑瘤
      MC57                      鼠甲基胆蒽诱导瘤
      WOP-3027                  鼠多瘤转化成纤维细胞
      293T                      人转化原发胚胎肾
      143Btk-                   人骨肉瘤
以上数据表明新抗体特异性地结合于许多但并非全部无限增殖化细胞系，这种结合不是种或细胞谱系限制的。
                           表II
      细胞系                    描述
      RF33.70                   鼠T-T杂交体
      DO11.10                   鼠T-T杂交体
      13G7.3.2                  鼠T-T杂交体
      HT-2                      鼠IL-2依赖性T细胞系
      EL-4                      鼠T细胞淋巴瘤
       G58.2                     鼠胸腺淋巴瘤
       NFC105                    鼠胸腺淋巴瘤
       P815                      鼠肥大细胞瘤
       P388D1                    鼠单核细胞/巨噬细胞瘤
       LADP31                   小鼠L细胞系
                                 鼠无限增殖化骨髓衍生巨噬
       A3.1
                                 细胞
       DC2.4                     鼠无限增殖化树状细胞系
       721                       人B细胞系
       HeLa                      人上皮子宫颈癌
       E36                       仓鼠肺癌
       BHK-21                    仓鼠肾细胞系
       CHO                       中国仓鼠卵巢实施例2：DMF10.62.3识别的分子的表达
在胚胎胸腺细胞中如下检测DMF10.62.3识别的分子的表达。将确定妊娠时间的产生胚胎的C57B1/10小鼠在胎儿期14天处死。在PBS中采用Eppendorf管玻璃活塞收获胎鼠胸腺。在冰上以抗-Fcγ受体II/III(Pharmingen)培养单细胞悬液20分钟，以阻断Fc受体。随后将细胞以DMF10.62.3或仓鼠IgG染色30分钟，接着将FITC接合山羊抗-仓鼠，及别藻蓝蛋白(allophycoyanin(APC))-接合抗-Thy1.2(Pharmingen)。在一些实验中，亦包括抗-CD25接合于PE和抗-CD44接合于Cy-铬(Pharmingen)。染色细胞在1％低聚甲醛中固定过夜，随后通过流式细胞术分析。
结果显示以DMF10.62.3染色的14天胎鼠胸腺细胞对40kDa蛋白阳性，并且发现该蛋白位于Thy1.2阳性细胞上(图2A)。有趣的是，该蛋白位于CD25+CD44+胎胸腺细胞及CD44+CD25-胎胸腺细胞。然而，成熟胸腺(图2C)，成熟脾(图2B)和成熟骨髓细胞(图2D)的染色显示由DMF10.62.3识别的蛋白在超过以对照仓鼠IgG观察的水平上并不存在于任何这些细胞。此外，多参数分析中在闸门控制CD4-CD8-细胞之后，通过流式细胞术或来自RAG-/-小鼠群体的分析，在成熟CD4-CD8-胸腺细胞不能检测到这种蛋白。14天胎肝细胞亦不与DMF10.62.3反应。
为了测定由DMF10.62.3识别的蛋白是否存在于正常的活化细胞中，将脾T细胞以T细胞促细胞分裂剂ConA活化和作如下DMF10.62.3识别蛋白表达染色。从成年(4-6月龄)Balb/c或C57B1/6小鼠制备脾、胸腺和骨髓细胞。采用三氯化铵裂解从脾细胞清除红血细胞。立即染色未刺激细胞。在培养物中以1μg/ml ConA或10μg/ml LPS刺激成淋巴细胞。培养1-3天之后，将细胞作DMF10.62.3.表达染色。在未刺激细胞(图3A)或者以ConA刺激、活化24(图3B)，48(图3C)或72(图3D)小时的细胞中，未观察到超过背景的显著染色(FAC图谱无变化)。作为阳性对照，将ConA刺激的细胞以CD25染色。如预期的那样，ConA处理引起CD25在这些细胞上的表达，与未刺激的细胞相比显著升高(CD25结合于细胞引起FAC图谱的变化)。类似地，当脾B细胞以脂多糖(LPS)活化时，在24(图3E)，48(图3F)和72(图3G)小时时未观察到DMF10.62.3染色(FAC图谱无变化)，然而这些细胞表达CD25(FAC′s图谱变化)。DMF10.62.3识别的蛋白并不存在于成熟骨髓细胞(图2D)。这些数据表明，DMF10.62.3识别的蛋白存在于一些胎胸腺细胞，但不存在于成熟动物生血源的普通静息或活化细胞上。实施例3：DMF10.62.3抑制肿瘤细胞增殖
低密度生长并且保持于缺乏PMA时，E170.2.3细胞缓慢或根本不增殖。然而当与胸腺细胞共同培养时它们增殖。最初通过阻滞这种胸腺细胞-诱导的增殖的能力鉴别DMF10.62.3。如表III所示，DMF10.62.3完全抑制这种反应(图4A)。如下进行增殖实验。洗涤E10.2.3细胞不含PMA，在完全RPMI中低密度(＜105/ml)培养48小时，以减少背景增殖。随后，在平底微量滴定板中，以25ng/ml PMA或5×105胸腺细胞在含或不含抗体的情形下培养5×103细胞72小时。在检测抗体对细胞自发增殖的影响的实验中，E710.2.3(＞105/ml的高密度生长)或RMA-S细胞在含或不含各种浓度抗体下培养36小时。最后5小时加入3H-胸苷(1TCi/孔)并以J-闪烁计数器(Wallac，Gaithersburg，MD)测量掺入DNA的标记。
                              表III
             培养基         胸腺细胞      PMA对照(无抗体)          8,699         33,802       54,271DMF10.62.3        938           750          450DMF10.132         6,646         27,156       25,216
也研究DMF10.62.3抑制E710.2.3对其它刺激物反应的能力。如表III所示，该抗体也阻滞PMA-诱导的E710.2.3增殖。此外，高密度生长时E710.2.3自发增殖，DMF10.62.3抑制这种反应(图4A)。在3μg/ml明显抑制增殖，在12.5μg/ml观察到完全抑制。相反地，仓鼠IgG对于E710.2.3对任何这些刺激物的反应无影响(图4A)。同样地，源自最初融合体的许多mAbs与E710.2.3结合，但并不抑制其增殖(例如DMF10.132)(表III)。因此，无论用于诱导增殖的刺激物是什么，DMF10.62.3特异性地抑制E710.2.3增殖。
由DMF10.62.3识别的蛋白存在于大量的其它细胞系。因此，测定该抗体对它们的自发增殖是否具有同样的作用是有趣的。DMF10.62.3抑制RMA-S(图4B)以及大量其它受试细胞系的增殖。相反地，该抗体对于RF33.70的自发增殖无影响，这种自发增殖对DMF10.62.3蛋白的存在无反应(图4C)。实施例4：DMF10.62.3通过编程性细胞死亡诱导细胞死亡
采用来自R & D(Minneapolis，MN)和Pharmingen(San Diego，CA)的试剂盒试验编程性细胞死亡。简言之，2×105细胞以各种浓度的抗体在200il培养基中培养。培养末期，用PBS洗涤细胞两次，以PI和FITC膜联蛋白处理15分钟，接着通过流式细胞术分析。用琼脂糖凝胶电泳在2％琼脂糖凝胶上评定DNA的断裂，如Schattner等人((1995)J.Exp.Med.182：1557)介绍。
肉眼检查抗体DMF10.62.3处理细胞的培养物，注意到完整细胞的数量减少。此外，细胞不再排斥活体染料台盼蓝。此项观察，以及增殖的抑制，显示抗体对于细胞具有细胞毒性。因此，进行研究以确定DMF10.62.3诱导细胞死亡的机理。
细胞死亡可以通过编程性细胞死亡或坏死。在经历编程性细胞死亡的细胞中观察到的一项早期变化是质膜上磷脂酰丝氨酸的外表化，它可以通过FITC-膜联蛋白染色检测到。该过程的早期，编程性细胞死亡细胞排斥活体染料，例如碘化丙锭，因此可以鉴定为FITC-膜联蛋白阳性和PI-阴性。编程性细胞死亡过程的后期，丧失了膜的完整性，FITC-膜联蛋白阳性细胞变成PI-阳性。相反，坏死时细胞失去膜的完整性，同时变成PI-阳性和FITC-膜联蛋白阳性，而无FITC-膜联蛋白阳性和PI-阴性阶段。
在图5A至5I的FAC图谱中，在左下象限的细胞是活细胞，右下象限的细胞正经受编程性细胞死亡(FITC-膜联蛋白阳性)，右上象限的细胞是经编程性细胞死亡和/或坏死而死亡的细胞(PI-阳性和FITC-膜联蛋白阳性)。亦显示了每个象限的细胞百分比。本研究中，一定百分比的E710.2.3细胞在培养物中经受自发的编程性细胞死亡(10.9-15％膜联蛋白+，PI-；)。然而，仅仅1μg/ml的DMF10.62.3在1小时内引起编程性细胞死亡的显著增加(28.9％膜联蛋白+，PI-；图5A)，并且这种编程性细胞死亡随着时间过去而增加(3小时，48.6％膜联蛋白+，PI-阳性)(图5C)。较高数量的DMF10.62.3(15μg/ml)时间上更快地(1小时，37.1％膜联蛋白+，PI-阳性)并在更多细胞中刺激编程性细胞死亡(图5E-G)。相反地，以类似量的仓鼠IgG处理不比单独培养基的作用显著(图5D，5H，51)。通过琼脂糖凝胶电泳目测检验DNA断裂亦可检验编程性细胞死亡。
由于DMF10.62.3识别的蛋白在其它细胞上表达，并且这种抗体抑制它们的增殖(试验处)，因此进一步研究DMF10.62.3是否亦刺激它们经历编程性细胞死亡。DMF10.62.3引起鼠细胞系RMA-S、CTLL、LB27.4和A20以及人细胞系Jurkat和143BTK-显著的编程性细胞死亡(表IV)。采用15μg/ml的DMF10.62.3诱导编程性细胞死亡，抗体浓度增加作用也增加。相反地，在对该蛋白阴性的RF33.70中DMF10.62.3不引起编程性细胞死亡。DMF10.62.3诱导的编程性细胞死亡的水平在各种细胞系之间是不同的，并且显示依赖于表面表达的水平以及表达该蛋白质的细胞群内的细胞百分比(表IV)。例如，最多的E710.2.3和RMA细胞，以高水平表达该蛋白，在这些细胞系中，DMF10.62.3诱导高水平的编程性细胞死亡。相反地，少量的A20和LB27.4细胞低水平表达40kDa蛋白，在这些细胞中DMF10.62.3诱导较低水平的编程性细胞死亡(表IV)。由DMF10.62.3刺激的编程性细胞死亡显示不依赖于fas，由于E710.2.3和RMA-S细胞不表达fas(表IV)。
                                        表IV
细胞系                         编程性细胞死亡的细胞％
DMF10.62.3 仓鼠IgG 无处理 荧光密度DMF10.62.3/仓鼠IgG DMF10.62.3染色阳性细胞％ 鼠fas表面表达染色
小鼠T细胞系
86.9  19.8  24.7  27.5  72.6 -
 E710.2.3 69.6  12.2  14.0  14.5  60.6 -
RMA-S  36.4  14.8  16.7  8.88  51.5 -
CTLL  8.1  8.6  7.8  0.98  0.48 -
RF33.70
小鼠B细胞系 16.816.2 7.113.8 10.812.2 1.483.3 7.024.8 ++
 LB27.4A20
 33.9  12.6  11.8  16.18  49.2  ND
人细胞系  29.7  21.1  20.5  3.8  29.5  ND
 JURKAT
 143BTK-
实施例5：在E710.2.3和其它细胞系中DMF10.62.3引起同型聚集
同型聚集是刺激细胞彼此粘附的生物活性过程。如下设置聚集试验。在有各种浓度DMF10.62.3或仓鼠IgG或不含抗体的200il完全RPMI中培养105细胞。为了测试抑制剂的作用，将105个细胞与抑制剂预培养30分钟，然后在持续存在抑制剂的情形下加入DMF10.62.3mAb(10μg/ml)6小时。为了试验低聚甲醛对聚集的作用，将细胞固定于低聚甲醛中10分钟，清洗，然后加入DMF10.62.3 6小时。肉眼评估聚集。采用热电冷却充电-偶联装置(CCD)照相机(Princeton Instruments，Trenton，NJ)进行6小时显微照相。发现DMF10.62.3在培养物中诱导E710.2.3的同型聚集。6小时中，以5μg/ml或更多抗体处理的细胞观察到显著的聚集。相反地，在以仓鼠IgG或培养基处理的培养物中未观察到聚集。这种聚集被各种物质处理所阻滞，这些物质包括细胞松弛素B(断裂肌动蛋白微丝)，三氟拉嗪(抑制钙调蛋白依赖性过程)，叠氮化钠+2-去氧葡萄糖(抑制ATP合成)，以及EDTA(螯合Ca2+和Mg2+)。相反地，聚集不受秋水仙碱(抑制微管形成)影响。通过4℃培养和通过低聚甲醛处理也可抑制聚集(表V)。这些结果表明聚集是一种活动过程，并不仅是凝集。
                               表V
    使用的化学品     对细胞的作用     同型粘附
细胞松弛素B(20μg/ml) 细胞支架(破坏肌动蛋白微丝完整性) -
秋水仙碱(20μg/ml) 抑制微管形成 +
三氟拉嗪(20μM) 抑制钙调蛋白依赖性过程 -
叠氮化钠(0.1％)+2-去氧葡糖(5mM) 抑制ATP合成 -
EDTA(10mM) 螯合Ca2+和Mg2+ -
仅仅培养基 对照(无作用) +
4℃ -
低聚甲醛 -
DMF10.62.3也引起表达DMF10.62.3结合蛋白的一些其它细胞系(例如RMA-S，CTLL)的同型聚集。然而，对于一些其它DMF10.62.3阳性细胞系(例如Jurkat，LB27.4，A20，143Btk-)几乎未观察到超出背景的聚集。DMF10.62.3并不结合的RF33.70，未观察到聚集。
聚集试验可以用于帮助测定一种新型抗体是否是本发明的一种新型抗肿瘤抗体。实施例6：DMF10.62.3免疫沉淀非GPI-连接的40kDa蛋白
为了表征DMF10.62.3结合的蛋白，如下进行35S标记和免疫沉淀反应。5×106个E710.2.3细胞在不含甲硫氨酸的培养基中饥锇1小时，接着以0.5mCi/ml的35S甲硫氨酸培养2小时。如Townsend等人((1990)J.Immunol146：2235所述，将标记细胞在免疫沉淀缓冲液中溶解。将澄清的溶解产物以仓鼠IgG预澄清，与结合于蛋白-A-琼脂糖的DMF10.62.3进行沉淀反应，并在14％凝胶上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。为了测定DMF10.62.3结合蛋白的分子量，以35S甲硫氨酸标记E170.2.3细胞2小时。用SDS-PAGE在还原条件下分析标记细胞的免疫沉淀物。
还原条件下mAb DMF10.62.3免疫沉淀来自E710.2.3的约40kDa的蛋白。这种蛋白的电泳移动性在非还原条件下不改变。在普通仓鼠IgG的免疫沉淀物或者抗-MHC I类抗体Y-3的免疫沉淀物中未观察到该带。在表面标记的E710.2.3和RMA-S细胞的溶解产物中也鉴别出40kDa蛋白。
几种细胞表面分子例如Thy-1和Ly-6A/E经糖基磷脂酰肌醇(GPI)固着连接于细胞表面。这种表面连接对PI-PLC处理敏感。为了确定DMF10.62.3识别的蛋白是否为GPI-连接，用PI-PLC处理在细胞表面表达该蛋白的RMA-S细胞。PI-PLC处理并不减少DMF10.62.3染色，但是减少GPI-连接分子Thy-1的染色；提示DMF10.62.3识别的40kDa蛋白不是通过GPI固着于细胞表面。实施例7：DMF62.3抗体的体内作用
AKR小鼠IV或IP注射5×106同系E710.2.3肿瘤细胞并在开始一天和10天以后各接受一次盐水或0.5mg对照抗体或DMF62.3抗体IP注射。允许动物生存50天(表VI)。
                表VI
处理 存活 平均死亡时间
1.盐水 0％ 35天
2.对照抗体 0％ 33天
3.DMF62.3 100％ (无死亡)
保藏声明
产生单克隆抗体DMF10.62.3的杂交瘤细胞系，由美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA)于1999年7月20日接受，产生单克隆抗体DMF10.167.4和DMF10.34.36的杂交瘤细胞系由美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA)于1999年7月22日接受。这些杂交瘤业已有条件地保藏，即保证按照37CFR 1.14和35USC122，在本专利申请待批期间向专利和商标官员确定给以权利的人公开并提供这些杂交瘤。在提交主题申请或其后续的副本的国家中，根据外国专利法的需要，可得到保藏物。然而应理解，保藏物的得到并不构成许可损害政府行为授予的权利实施该主题发明。
进一步地，按照微生物保藏布达佩斯条约的规定，主题培养保藏物应该保藏并对于公众是可得到的，即它们应该以一切必需的管理保藏，以使它们在最近的提供保藏样品的要求之后的至少五年的时期内保持活力并没有被污染，并且无论如何，在保藏日之后至少保藏30(三十)年时期，或者可能发布公开该培养物的任何专利的有效期限加上由该保藏品最近的样品要求之后的五年。如果因保藏条件保藏者不能在有人索取时提供样品，保藏者确认有归还保藏物的责任。关于公众得到这种主题培养保藏物的所有限制在公开这些保藏物的专利授权后将会不可改变地撤消。其它的实施方案
应当理解，当结合其详细说明描述本发明时，前面的描述旨在举例说明，而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求的范围来确定。其它的方面、优点和修改也在以下权利要求范围之内。

Claims (36)

1.一种单克隆抗体、或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体：
(a)与胎儿胸腺细胞结合；
(b)与该细胞结合抑制时细胞的增殖；并
(c)不与成年胸腺细胞结合。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，其中该抗体与细胞结合时诱导同型聚集。
3.权利要求1所述的单克隆抗体，其中该抗体诱导与其结合细胞的编程性细胞死亡。
4.权利要求1所述的单克隆抗体，其中该抗体与E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos中的一种或多种肿瘤细胞系特异性结合。
5.权利要求4所述的单克隆抗体，其中该抗体与E710.2.3细胞特异性结合。
6.权利要求1所述的单克隆抗体，其中该单克隆抗体是由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377产生的DMF10.62.3。
7.权利要求1所述的单克隆抗体，其中该单克隆抗体是由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-405产生的DMF10.167.4。
8.权利要求1所述的单克隆抗体，其中该单克隆抗体是由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-404产生的DMF10.34.36。
9.一种单克隆抗体、或其抗原结合片段，它与结合有一种单克隆抗体的蛋白质结合，该单克隆抗体由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、PTA-404、或PTA-405产生。
10.权利要求9所述的单克隆抗体，其中该抗体是人源化抗体。
11.权利要求9所述的单克隆抗体，其中该抗体是包括非人可变区和人的轻链和重链恒定区的一种嵌合单克隆抗体。
12.一种单克隆抗体、或其抗原结合片段，它与结合有一种单克隆抗体的表位结合，该单克隆抗体由杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、PTA-404或PTA-405产生。
13.一种单克隆抗体、或其抗原结合片段，它与具有下列特征的蛋白质特异性结合：
(i)分子量为40kDa；
(ii)在胎儿胸腺细胞表面表达；
(iii)在成年胸腺细胞表面无表达；
(iv)与该抗体结合时能阻断细胞增殖；和
(v)与该抗体结合时能诱导同型聚集。
14.权利要求13所述的单克隆抗体，其中该蛋白质的特征还在于：
(vi)与该抗体结合时能诱导细胞的编程性细胞死亡。
15.权利要求13所述的单克隆抗体，其中该蛋白质的特征还在于：
(vii)在包含E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos的一种或多种肿瘤细胞系的细胞表面表达。
16.一种权利要求1所述的单克隆抗体的抗原结合片段。
17.权利要求1所述的一种单克隆抗体，还包括可检测的标记物。
18.一种杂交瘤细胞系，它产生权利要求1所述的单克隆抗体。
19.权利要求18所述的杂交瘤细胞系，其中该杂交瘤细胞系是细胞系ATCC No.PTA-377、ATCC No.PTA-404或ATCC No.PTA-405。
20.一种实质上纯的蛋白质，其特征在于：
(i)分子量为40kDa；
(ii)在胎儿胸腺细胞表面表达；
(iii)在成年胸腺细胞表面无表达；
(iv)与权利要求1的抗体结合时能阻断细胞增殖；和
(v)与权利要求1的抗体结合时能诱导同型聚集。
21.权利要求20所述的蛋白质，其中该蛋白质的特征还在于：
(vi)在包含E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos的一种或多种肿瘤细胞系上表达。
22.权利要求20所述的蛋白质，其中该蛋白质的特征还在于：
(vii)与权利要求1的抗体结合时能诱导细胞的编程性细胞死亡。
23.权利要求20所述的蛋白质，它与杂交瘤细胞系ATCC No.PTA-377、PTA-404或PTA-405产生的单克隆抗体结合。
24.一种药物组合物，它包括权利要求1的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
25.一种检测受检者体内肿瘤细胞的方法，该方法包括：
将来源于受检者体内的细胞样品在足以产生特异结合的条件下与权利要求1的单克隆抗体结合；并且
检测该抗体与样品中的一个或多个细胞的任何特异性结合，其中结合表示受检者体内有肿瘤细胞存在。
26.权利要求25所述的方法，其中该肿瘤细胞是胸腺淋巴瘤、T细胞瘤、B细胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤或急性T细胞白血病细胞。
27.权利要求25所述的方法，其中该肿瘤细胞在患者体内。
28.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括：
将该肿瘤细胞与一定量的权利要求1的单克隆抗体结合，该数量足以抑制肿瘤细胞的增殖。
29.一种诱导细胞中的编程性细胞死亡的方法，该方法包括：
将该细胞与一定量的权利要求1的单克隆抗体结合，该数量足以诱导细胞中的编程性细胞死亡。
30.权利要求29所述的方法，其中该细胞是选自胸腺淋巴瘤、T细胞瘤、B细胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤或急性T细胞白血病细胞的肿瘤细胞。
31.权利要求29所述的方法，其中该细胞为体外或体内的细胞。
32.一种肿瘤诊断试剂盒，包括权利要求1的单克隆抗体、和其使用说明。
33.权利要求32所述的试剂盒，其中将被诊断的肿瘤选自胸腺淋巴瘤、T细胞瘤、B细胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤或急性T细胞白血病。
34.一种肿瘤细胞导向剂，它包括与一种成分缀合的权利要求1的单克隆抗体。
35.选择性地将一种成分传送至哺乳动物肿瘤细胞的方法，该方法包括：
对哺乳动物给予权利要求34的导向剂；和
给予充分的时间以使复合物到达肿瘤细胞和使抗体与肿瘤细胞结合，由此选择性地将一种成分传送至哺乳动物的肿瘤细胞。
36.一种分离蛋白质的方法，该方法包括：
将含蛋白质的样品与权利要求1的单克隆抗体接触一定时间、并且该结合是在足以形成抗体蛋白质复合体的条件下进行的；
如果需要，从该样品中取出该复合物；并且
从该复合物中取出该蛋白质，由此分离该蛋白质。
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