PL204822B1 - Izolowane przeciwciało, wiążące antygen fragmenty tego przeciwciała, linia komórkowa hybrydomy, kompozycja farmaceutyczna zawierająca izolowane przeciwciało, zastosowanie izolowanego przeciwciała, zestaw zawierający izolowane przeciwciało oraz środek ukierunkowany na komórki nowotworowe zawierający izolowane przeciwciało - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Zakres wynalazku

Obecny wynalazek dotyczy izolowanego przeciwciała, wiążących antygen fragmentów tego przeciwciała, linii komórkowej hybrydomy, kompozycji farmaceutycznej zawierającej izolowane przeciwciało, zastosowania izolowanego przeciwciała, zestawu zawierającego izolowane przeciwciało oraz środka ukierunkowanego na komórki nowotworowe zawierającego izolowane przeciwciało.

Tło wynalazku

Linia komórkowa E710.2.3 to klon mysiej linii komórkowej CD4- CD8-grasiczego chłoniaka z limfocytów T, wyizolowanych początkowo z guza grasiczego mysiego szczepu AKR/J. Hodowana samodzielnie w niskiej gęstości, E710.2.3 nie proliferuje spontanicznie, jeśli nie jest stymulowana 12-mirystyniano-13-octano forbolem (PMA). Proliferację E710.2.3 można stymulować przez kontakt z tymocytami lub splenocytami. Jednakże E710.2.3 może proliferować spontanicznie podczas hodowli w dużej gęstości bez obecności PMA lub innych komórek. Kiedy syngenicznym myszom poda się injekcję z E710.2.3, rosną one jako złośliwe guzy w narządach limfatycznych i w grasicy.

Podsumowanie wynalazku

Wynalazek opiera się na wytworzeniu, przeciwciał monoklonalnych, które mogą wiązać się specyficznie do białka 40 kDa ulegającego ekspresji na powierzchni licznych typów komórek nowotworowych, ale nie wiążą się do normalnych komórek krwiotwórczych pochodzących z dorosłych osobników. Nowe przeciwciała monoklonalne mogą blokować proliferację i indukować apoptozę komórek nowotworowych, do których specyficznie się wiążą.

Przedmiotem wynalazku jest izolowane przeciwciało charakteryzujące się tym, że jest wybrane spośród:

monoklonalnego przeciwciała produkowanego przez linię komórkową hybrydomy wybraną z grupy obejmującej ATCC nr PTA-377, PTA-405 lub PTA-404, gdzie przeciwciało stanowi odpowiednio DMF10.62.3, DMF10.167.4 lub DMF10.34.36;

chimerycznego przeciwciała zawierającego pochodzące od ludzi części stałe łańcuchów lekkich i ciężkich oraz części zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała wybranego spośród DMF10.62.3, DMF10.167.4 lub DMF10.34.36; i humanizowanego przeciwciała posiadającego regiony określające komplementarność (CDR) przeciwciała wybranego spośród DMF10.62.3, DMF10.167.4 lub DMF10.34.36.

Korzystnie, jest to przeciwciało monoklonalne DMF10.62.3 produkowane przez linię komórkową hybrydomy ATCC nr PTA-377.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, jest to przeciwciał o monoklonalne DMF10.167.4 produkowane przez linię komórkową hybrydomy ATCC nr PTA-405.

W jeszcze innym korzystnym wariancie wynalazku, jest to przeciwciało monoklonalne DMF10.34.36 produkowane przez linię komórkową hybrydomy ATCC nr PTA-404.

Korzystnie, izolowane przeciwciało zawiera część zmienną przeciwciała DMF10.167.4 oraz część stałą pochodzącą od przeciwciała ludzkiego.

W innym korzystnym wariancie wynalazku, izolowane przeciwciało zawiera regiony CDR przeciwciała DMF10.167.4.

Korzystnie, izolowane przeciwciało zawiera wykrywalny znacznik.

Przedmiotem wynalazku jest również wiążący antygen fragment przeciwciała według wynalazku, charakteryzujący się tym, że wybrany jest z grupy obejmującej Fab, F(ab')2 oraz Fv.

Przedmiotem wynalazku jest również linia komórkowa hybrydomy produkująca przeciwciało według wynalazku.

Korzystnie, jest to linia komórkowa ATCC nr PTA-377, PTA-404 lub PTA-405.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca izolowane przeciwciało według wynalazku oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie izolowanego przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia nowotworu wybranego z grupy obejmującej chłoniak grasicy, nowotwór z limfocytów T, chłoniak z limfocytów B, czerniak, kostniakomięsak oraz białaczkę limfoblastyczną z komórkami T, w którym przeciwciało hamuje rozrost komórki nowotworowej.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest także zestaw diagnostyczny charakteryzujący się tym, że zawiera (i) izolowane przeciwciało według wynalazku, (ii) koniugat specyficznego związku wiążącego przeciwciało i znacznika do wykrywania związanego przeciwciała, jak również instrukcje jego stosowania.

PL 204 822 B1

Korzystnie, zestaw służy do diagnozowania nowotworu wybranego z grupy obejmującej chłoniak grasicy, nowotwór z limfocytów T, chłoniak z limfocytów B, czerniak, kostniakomięsak oraz białaczkę limfoblastyczną z komórkami T.

Przedmiotem wynalazku jest również środek ukierunkowany na komórki nowotworowe znamienny tym, że zawiera izolowane przeciwciało według wynalazku połączone z cząsteczką wybraną z grupy obejmują cej ś rodki przeciwnowotworowe, cytotoksyny, cytokiny lub grupy reporterowe.

W opisie niniejszego wynalazku ujawniono przeciwciała monoklonalne, lub ich fragmenty wiążące antygen, które to monoklonalne przeciwciała (a) wiążą się z tymocytami płodowymi, (b) hamują proliferację komórkową komórki po związaniu się z tą komórką i (c) nie wiążą się z tymocytami z dorosłych osobników. Przeciwciała monoklonalne mogą również indukować homotypową agregację po związaniu się z komórką indukować apoptozę w komórce, do której się wiążą i mogą specyficznie wiązać się do jednej lub więcej nowotworowych linii komórkowych z grupy E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat i Cos. Przeciwciała mogą być znakowane, np. za pomocą wykrywalnego znacznika.

Wynalazek obejmuje również przeciwciało monoklonalne DMF10.62.3 produkowane przez linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-377, przeciwciało monoklonalne DMF10.167.4 produkowane przez linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-405, i przeciwciało monoklonalne DMF10.34.36 produkowane przez linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-404. W opisie wynalazku ujawniono również przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z białkiem takim samym, jak białko wiązane przez przeciwciała monoklonalne produkowane przez linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-377, linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-405, i linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-404. Przeciwciało monoklonalne może być humanizowane. W innym aspekcie opis wynalazku ujawnia przeciwciała monoklonalne, lub ich fragmenty wiążące antygen, które wiążą się specyficznie z białkiem 40 kDa wiązanym przez przeciwciała monoklonalne produkowane przez linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-377, linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-405, i linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-404.

W kolejnym aspekcie opis wynalazku ujawnia chimeryczne przeciwciała monoklonalne, lub ich fragmenty wiążące antygen, które wiążą się z białkiem takim samym, jak białko wiązane przez przeciwciała monoklonalne produkowane przez linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-377, linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-405, i linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-404, gdzie chimeryczne przeciwciała zawierają części zmienne nie pochodzące od ludzi, i ludzkie części stałe lekkich i ciężkich łańcuchów.

Przeciwciała ujawnione w opisie niniejszego wynalazku, lub ich fragmenty wiążące antygen, mogą również wiązać się z epitopem takim samym, jak epitop wiązany przez przeciwciała monoklonalne produkowane przez linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-377, linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-405, i linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-404.

W oipsie wynalazku ujawniono też przeciwciała monoklonalne, lub ich fragmenty wiążące antygen, które specyficznie wiążą się z białkiem które, (i) ma masę cząsteczkową 40 kDa, (ii) jego ekspresja zachodzi na powierzchni tymocytów płodowych, (iii) jego ekspresja nie zachodzi na powierzchni tymocytów dorosłych, (iv) blokuje proliferację komórek po związaniu się z przeciwciałem i (v) indukuje agregację homotypową po związaniu się z przeciwciałem. Przeciwciało monoklonalne wiąże się specyficznie z białkiem, które charakteryzuje się ponadto tym, że (vi) indukuje apoptozę w komórce po związaniu się z przeciwciałem i (vii) ulega ekspresji na powierzchni grupy nowotworowych linii komórkowych składającej się z E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat i Cos.

Wynalazek obejmuje ponadto wiążące antygen fragmenty opisanych tu przeciwciał monoklonalnych. Fragmenty wiążące antygen mogą być znakowane, np., za pomocą wykrywalnego znacznika.

Wynalazek obejmuje także linie komórkowe hybrydomy produkujące opisane tu przeciwciała monoklonalne. Wynalazek zawiera np. linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-377, linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-405, i linię komórkową hybrydomy nr ATCC PTA-404.

Wynalazek obejmuje również kompozycję farmaceutyczną zawierającą opisane tu przeciwciało monoklonalne i farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Wynalazek może być wykorzystywany w sposobie wykrywania komórki nowotworowej u pacjenta. Sposób obejmuje kontaktowanie próbki komórkowej pochodzącej od pacjenta z jednym lub więcej spośród opisanych tu przeciwciał monoklonalnych, i wykrywanie wiązania się przeciwciała z próbą, gdzie wiązanie wskazuje na obecność komórki nowotworowej u pacjenta. Przykłady komórek nowotworowych obejmują chłoniaka grasicy, nowotwór z limfocytów T, chłoniaka z limfocytów B, czerniaka, kostniakomięsaka

PL 204 822 B1 i biał aczkę limfoblastyczną z komórkami T. Komórka nowotworowa moż e również znajdować się w organizmie pacjenta. Przeciwciał a monoklonalne uż ywane do wykrywania nowotworów mogą być znakowane.

Wynalazek może również znaleźć zastosowanie w sposobie hamowania proliferacji komórek nowotworowych. Sposób obejmuje kontaktowanie komórki nowotworowej z ilością opisanych tu przeciwciał monoklonalnych, która wystarcza do zahamowania proliferacji komórek nowotworowych. Wynalazek może również znaleźć zastosowanie w sposobie indukowania apoptozy w komórce. Sposób obejmuje kontaktowanie komórki nowotworowej z jednym lub więcej spośród opisanych tu przeciwciał monoklonalnych, w ilości wystarczającej do indukcji apoptozy w komórce. Komórki mogą być komórkami nowotworowymi wybranymi z grupy składającej się z chłoniaka grasicy, nowotworu z limfocytów T, chłoniaka z limfocytów B, czerniaka, kostniakomięsaka i białaczki limfoblastycznej z komórkami T. Komórki mogą być poddawane działaniu tych przeciwciał in vitro bądź in vivo.

Wynalazek obejmuje również zestaw do diagnozowania nowotworów, zawierający jedno lub więcej spośród opisanych tu przeciwciał monoklonalnych oraz instrukcję jego stosowania. Zestaw może zawierać komórki nowotworowe wybrane z grupy składającej się z chłoniaka grasicy, nowotworu z limfocytów T, chł oniaka z limfocytów B, czerniaka, kostniakomię saka i biał aczki limfoblastycznej z komórkami T. Wynalazek obejmuje również ś rodek ukierunkowany na nowotwór obejmują cy jedno lub więcej spośród opisanych tu przeciwciał monoklonalnych, które mogą zostać połączone z cząsteczką w celu dostarczenia tej cząsteczki do komórki nowotworowej. Przykłady cząsteczek obejmują środki przeciwnowotworowe, cytotoksyny, cytokiny lub grupy reporterowe.

Innym zastosowaniem wynalazku jest sposób selektywnego dostarczania cząsteczki do komórki nowotworowej w ciele ssaka. Sposób obejmuje podanie ssakom opisanego tu środka ukierunkowanego na nowotwór połączonego z cząsteczką, oraz odczekanie odpowiedniego okresu czasu wystarczającego na dotarcie środka ukierunkowanego na nowotwór do komórki nowotworowej, gdzie przeciwciało zawarte w tym środku wiąże się z komórką nowotworową, w selektywny sposób dostarczając cząsteczkę do komórki nowotworowej w ciele ssaka. Przykłady cząsteczek obejmują środki przeciwnowotworowe, cytotoksyny, cytokiny lub grupy reporterowe.

Wynalazek może również znaleźć zastosowanie w sposobie izolowania wspomnianego białka o masie 40 kDa. Sposób obejmuje trwają cy odpowiednio dł ugo kontakt próbki zawieraj ą cej białko z opisanymi tu przeciwciałami monoklonalnymi w warunkach wystarczają cych do powstania kompleksów przeciwciało-białko, odzyskanie jednego lub więcej kompleksów z próbki, jeśli jakiekolwiek powstaną, i oddzielenie białka z kompleksu, czyli jego izolację.

Określenie „izolowana sekwencja kwasu nukleinowego” oznacza sekwencję kwasu nukleinowego, która zasadniczo nie zawiera genów otaczających tę sekwencję kwasu nukleinowego w genomie organizmu, w którym naturalnie występuje. Termin ten oznacza więc rekombinowaną sekwencję kwasu nukleinowego włączoną w wektor, w autonomicznie replikujący się plazmid lub wirus, lub w genomową sekwencję kwasu nukleinowego prokarionta lub eukarionta. Obejmuje również oddzielną cząsteczkę taką jak cDNA, fragment genomowy, fragment uzyskany za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub fragment uzyskany za pomocą enzymów restrykcyjnych.

Przeciwciało, które „wiąże się specyficznie” z białkiem, to przeciwciało, które wiąże się z białkiem, ale nie rozpoznaje i nie wiąże się z innymi cząsteczkami w próbce, np. w próbce biologicznej, która naturalnie zawiera białko, np. białko 40 kDa.

„Konserwatywne” podstawienia aminokwasowe to podstawienia, w których jedna reszta aminokwasowa jest zastępowana przez inną resztę aminokwasową mającą podobny łańcuch boczny. Rodziny reszt aminokwasowych mających podobne łańcuchy boczne są zdefiniowane w dziedzinie. Rodziny te obejmują aminokwasy z łańcuchami bocznymi zawierającymi grupy zasadowe (np. lizyna, arginina, histydyna), łańcuchami bocznymi zawierającymi grupy kwasowe (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), łańcuchami bocznymi z polarnymi grupami nie wykazującymi ładunku (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), rozgałęzionymi łańcuchami bocznymi (np. treonina, walina, izoleucyna) i łańcuchami bocznymi zawierającymi pierścień aromatyczny (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). W podstawieniu konserwatywnym każdy aminokwas z danej rodziny aminokwasów może zostać użyty do zastąpienia każdego innego członka tej rodziny. Terminy „polipeptyd, peptyd i białko” są tu używane wymiennie w odniesieniu do łańcucha reszt aminokwasowych.

PL 204 822 B1

Określenie „fragment wiążący antygen” przeciwciała to część przeciwciała, która ma zdolność wiązania się z epitopem na antygenie, np. na białku 40 kDa, wiązanym przez całe przeciwciało.

Określenie „epitop” to szczególny rejon antygenu, np. białka, do którego wiąże się przeciwciało, i który może wywołać odpowiedź immunologiczną.

Białko 40 kDa „o znacznym stopniu czystości” to białko 40 kDa, które w co najmniej 60% wagowo jest wolne od białek i naturalnie występujących cząsteczek organicznych, z którymi jest związane w stanie naturalnym. Korzystny jest preparat białka 40 kDa czysty w co najmniej 75%, bardziej korzystnie czysty w co najmniej 90%, a najbardziej korzystnie czysty w 99% wagowo. Białko 40 kDa o znacznym stopniu czystości moż na uzyskać np. przez chromatografię powinowactwa przy uż yciu przeciwciał lub przeciwciał monoklonalnych opisanych tutaj, i/lub przez fizyczne techniki oczyszczania.

Określenie „izolowane” przeciwciało to przeciwciało zasadniczo wolne od innych naturalnie występujących cząstek organicznych, z którymi występuje w naturze.

Przeciwciało lub inna cząsteczka blokująca proliferację komórek to przeciwciało lub cząsteczka, która hamuje cykl komórkowy, podział, albo oba te procesy.

Określenie „homotypowa agregacja” oznacza biologicznie aktywny proces, w którym komórki tego samego typu są stymulowane do tego, by łączyły się ze sobą nawzajem.

Określenie „grupa reporterowa” to cząsteczka albo związek mający taką cechę chemiczną lub fizyczną jak luminescencja, fluorescencja, aktywność enzymatyczna, gęstość elektronowa lub radioaktywność, która może być łatwo zmierzona lub wykryta za pomocą odpowiednich systemów lub procedur detekcji.

O ile nie są zdefiniowane inaczej, wszystkie uż yte tu techniczne i naukowe okre ś lenia maj ą takie samo znaczenie, jakie mają dla osób zajmujących się dziedziną, do której należy ten wynalazek. Chociaż przy stosowaniu lub testowaniu tego wynalazku można używać sposobów i materiałów podobnych lub odpowiadających opisanym tutaj, poniżej zostały przedstawione odpowiednie sposoby i materiały. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne wspomniane tu odnośniki są włączone w całości poprzez ich wzmiankowanie. W przypadku konfliktu prezentowany opis, włącznie z definicjami, będzie rozstrzygający. Dodatkowo materiały, sposoby i przykłady służą tylko ilustracji i nie są ograniczające. Wynalazek obejmuje przeciwciała, które rozpoznają białko 40 kDa ulegające ekspresji na komórkach nowotworowych. Przeciwciał można użyć do zahamowania proliferacji komórek nowotworowych i indukowania apoptozy komórek nowotworowych, do których się specyficznie wiążą. Przeciwciał monoklonalnych można użyć w celach diagnostycznych (np. do stwierdzenia obecności komórek nowotworowych), lub w celach terapeutycznych przeciw komórkom nowotworowym, samodzielnie lub poprzez dostarczanie za ich pomocą środka przeciwnowotworowego.

Inne cechy i zalety wynalazku są wyjaśnione w poniższym szczegółowym opisie oraz w zastrzeżeniach.

Krótki opis ilustracji

Na Fig. 1A-D znajdują się cztery wykresy z cytometru przepływowego pokazujące ekspresję białka 40 kDa na komórkach linii E710.2.3 (Fig. 1A), A20 (Fig. 1B), Jurkat (Fig. 1C) i RF33.70 (Fig. 1D) wykrytą za pomocą przeciwciała DMF10.62.3.

Na Fig. 2A-D znajdują się cztery wykresy z cytometru przepływowego pokazujące ekspresję białka 40 kDa w grasicy 14-dniowego płodu (Fig. 2A), całkowitej śledzionie dorosłego osobnika (Fig. 2B), całkowitej grasicy dorosłego osobnika (Fig. 2C) i całkowitym szpiku kostnym dorosłego osobnika (Fig. 2D) wykrytą za pomocą przeciwciała DMF10.62.3.

Na Fig. 3A-G znajduje się siedem wykresów z cytometru przepływowego pokazujących ekspresję białka 40 kDa na niestymulowanych, świeżo zebranych limfocytach T i B (Fig. 3A), aktywowanych limfocytach T po 24 godzinach (Fig. 3B), aktywowanych limfocytach T po 48 godzinach (Fig. 3C), aktywowanych limfocytach T po 72 godzinach (Fig. 3D), aktywowanych śledzionowych limfocytach B po 24 godzinach (Fig. 3E), aktywowanych śledzionowych limfocytach B po 48 godzinach (Fig. 3F) i aktywowanych śledzionowych limfocytach B po 72 godzinach (Fig. 3G), wykrytą za pomocą przeciwciała DMF10.62.3.

Na Fig. 4A-C znajdują się trzy liniowe wykresy pokazujące zahamowanie spontanicznej proliferacji komórek linii E710.2.3 (Fig. 4A), komórek RMA-S (Fig. 4B) i komórek RF33.70 (Fig. 3C) przez przeciwciało monoklonalne DMF10.62.3.

Na Fig. 5A-I znajduje się dziewięć wykresów z cytometru przepływowego pokazujących indukcję apoptozy w komórkach linii E710.2.3 traktowanych 1 μg/ml DMF10.62.3 przez 1 godzinę (Fig. 5A), 1 μg/ml DMF10.62.3 przez 2 godziny (Fig. 5B), 1 μg/ml DMF10.62.3 przez 3 godziny (Fig. 5C), chomiczym IgG

PL 204 822 B1 przez 3 godziny (Fig. 5D), 15 μg/ml DMF10.62.3 przez 1 godzinę (Fig. 5E), 15 μg/ml DMF10.62.3 przez 2 godziny (Fig. 5F), 15 μg/ml DMF10.62.3 przez 3 godziny (Fig. 5G), chomiczym IgG przez 3 godziny (Fig. 5D) i inkubowanych bez przeciwciał (Fig. 5I).

Szczegółowy opis

Prezentowany wynalazek obejmuje przeciwciała, np. przeciwciała monoklonalne, które wiążą się specyficznie z białkiem 40 kDa. Białko 40 kDa to nowe białko powierzchniowe ulegające ekspresji na wielu typach komórek nowotworowych, włączając w to chłoniaka grasicy, nowotwór z limfocytów T, chłoniaka z limfocytów B, czerniaka, kostniakomięsaka i białaczkę limfoblastyczną z komórkami T oraz u wielu różnych gatunków, włącznie z ludźmi, małpami i myszami. Przeciwciała nie wykazują żadnej reaktywności w stosunku do normalnych komórek krwiotwórczych dorosłych osobników. Po związaniu przeciwciał opisanych w wynalazku z komórką wyrażającą białko 40 kDa, komórka ta przestaje proliferować i ulega apoptozie. Białko 40 kDa jest nowym białkiem wywołującym śmierć, co opiera się na obserwacji, że na skutek związania się przeciwciał monoklonalnych z tym białkiem na powierzchni komórki komórka ulega apoptozie.

Trzy linie komórkowe hybrydomy produkujące przeciwciała monoklonalne wiążące się specyficznie z białkiem 40 kDa zostały zdeponowane w ATCC pod numerami dostępu PTA-377 (DMF10.62.3), PTA-405 (DMF10.167.4) i PTA-404 (DMF10.34.36).

Opisane tu przeciwciała mają wiele zastosowań. Przeciwciała te mogą być używane w testach diagnostycznych in vitro, aby stwierdzić obecność złośliwych komórek w tkankach ssaków, np. ludzkich. Przeciwciała te mogą być również stosowane do lokalizacji nowotworów in vivo przez podanie badanemu opisanego tu izolowanego przeciwciała znakowanego grupą reporterową. Przeciwciała te mają również zastosowania terapeutyczne. Dodatkowo przeciwciała te mogą zostać użyte do leczenia nowotworów lub dostarczania leków przeciwnowotworowych.

Metody produkcji przeciwciał

Przeciwciała to immunoglobuliny i aktywne immunologicznie fragmenty cząsteczek immunoglobulin. Przykłady fragmentów cząsteczek immunoglobulin obejmują fragmenty przeciwciała, np. fragmenty F(ab) i F(ab')2, które mogą specyficznie wiązać się z białkiem 40 kDa. Fragmenty można uzyskać przez działanie na przeciwciało takim enzymem jak pepsyna. Określenie przeciwciało monoklonalne lub kompozycja przeciwciał monoklonalnych odnosi się do populacji przeciwciał, która zawiera tylko jeden rodzaj miejsca wiążącego antygen, mogący reagować z danym epitopem polipeptydu lub białka. Kompozycja przeciwciał monoklonalnych zazwyczaj wykazuje pojedyncze powinowactwo do białka, z którym się specyficznie wiąże.

Immunizacja

Przeciwciała poliklonalne i monoklonalne przeciwko białku 40 kDa można uzyskać immunizując odpowiedniego osobnika (np. królika, kozę, mysz lub innego ssaka) preparatem immunogenicznym zawierającym odpowiedni immunogen. Immunogeny obejmują komórki takie, jak komórki z unieśmiertelnionych linii komórkowych E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat lub Cos, co do których wykazano, że u wszystkich zachodzi ekspresja nowego białka 40 kDa. Immunogenem może być również oczyszczone lub wyizolowane samo białko 40 kDa. Na przykład przeciwciało monoklonalne, produkowane przez linie komórkowe hybrydomy zdeponowane w ATCC jako PTA-377, PTA-405 i PTA-404, może być wykorzystane do izolacji białka z komórki, która je wytwarza, np. E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat lub Cos, przy użyciu chromatografii powinowactwa, immunoprecypitacji, lub innych metod znanych w dziedzinie.

Przeciwciała uzyskane od immunizowanego osobnika można poddać badaniom w celu określenia, czy wiążą się one z tymocytami płodowymi, nie wiążąc się równocześnie z tymocytami osobników dorosłych. Takie przeciwciała można poddać badaniom przesiewowym za pomocą opisanych tutaj testów. Na przykład można przeprowadzić test sprawdzający, czy te przeciwciała hamują proliferację komórek, do których się wiążą; czy indukują homotypową agregację komórek; i/lub indukują apoptozę w komórkach, do których się wiążą. Odpowiednie sposoby identyfikacji przeciwciał o odpowiednich właściwościach są tu opisane. Na przykład indukowanie śmierci komórkowej na skutek związania się przeciwciała z komórką można badać za pomocą dostępnych w handlu zestawów z R&D (Minneapolis, MN) lub Pharmingen (San Diego, CA).

Dawka jednostkowa immunogenu (na przykład oczyszczonego białka, komórki nowotworowej eksprymującej białko, lub rekombinowanego białka 40 kDa) oraz sposób immunizacji zależą od osobnika, który ma być immunizowany, jego stanu immunologicznego, oraz jego masy ciała. Aby wzmocnić

PL 204 822 B1 odpowiedź immunologiczną immunizowanego osobnika, można immunogen podać z adiuwantem, na przykład pełnym lub niepełnym adiuwantem Freunda. Immunizacja badanego osobnika immunogenem, jak to opisano powyżej, powoduje humoralną odpowiedź poliklonalną. Miano przeciwciał w immunizowanym osobniku można monitorować w czasie wykorzystując standardowe metody takie, jak ELISA, używając unieruchomionego antygenu, np. opisanego tutaj białka 40 kDa.

Inne metody uzyskiwania przeciwciał przeciwko białku 40 kDa obejmują użycie myszy transgenicznych wyrażających ludzkie geny immunoglobulinowe (patrz np. Wood et al., Zgłoszenie PCT WO 91/00906; Kucherlapati et al., Zgłoszenie PCT WO 91/10741; czy Lonberg et al., Zgłoszenie PCT WO 92/03918). Ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą być również produkowane przez wprowadzenie antygenu do myszy z niedoborem immunologicznym, którym przeszczepiono uprzednio ludzkie komórki lub tkanki produkujące przeciwciała (np. ludzkie komórki szpiku kostnego, limfocyty z krwi obwodowej (PBL), ludzkie płodowe tkanki węzłów chłonnych, lub krwiotwórcze komórki macierzyste). Takie sposoby obejmują uzyskiwanie przeciwciał z myszy SCID-hu (patrz Duchosal et al., Zgłoszenie PCT WO 93/05796; US Patent Number 5,411,749; lub McCune et al. (1988) Science 241:1632-1639) lub myszy pozbawione Rag-1/Rag-2. Myszy z niedoborem odporności produkujące ludzkie przeciwciała również są dostępne handlowo. Na przykład myszy pozbawione Rag-2 można uzyskać z Taconic Farms (Germantown, NY).

Hybrydomy

Przeciwciała monoklonalne można uzyskać przez immunizację odpowiedniego osobnika za pomocą immunogenu. W odpowiednim czasie po immunizacji, np. kiedy miano przeciwciał osiąga wystarczająco wysoki poziom, komórki produkujące przeciwciała można pobrać z immunizowanego zwierzęcia i użyć do przygotowania przeciwciał monoklonalnych przy użyciu standardowych sposobów. Na przykład można przeprowadzić za pomocą standardowych procedur fuzji komórek somatycznych fuzję komórek produkujących przeciwciała z unieśmiertelnionymi komórkami takimi, jak komórki szpiczaka, aby otrzymać komórki hybrydomy. Takie techniki są dobrze znane w tej dziedzinie, i obejmują na przykład, sposób uzyskiwania hybrydomy przedstawioną początkowo przez Kohlera i Milsteina, (1975 Nature, 256:495-497), sposób uzyskiwania hybrydomy ludzkich limfocytów B (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4:72), i sposób uzyskiwania hybrydomy EBV do produkcji ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc, str. 77-96). Techniki produkcji linii hybrydomy wytwarzających przeciwciała monoklonalne są dobrze znane.

Przeciwciała monoklonalne można również uzyskać pobierając komórki produkujące przeciwciała, np. limfocyty śledzionowe, od wyrażających ludzkie geny immunoglobulinowe myszy transgenicznych, które zostały immunizowane białkiem 40 kDa. Limfocyty śledzionowe można immortalizować przez fuzję z ludzkim szpiczakiem lub przez transformację wirusem Epstein-Barra (EBV). Takie hybrydomy można uzyskać stosując metody uzyskiwania hybrydomy z limfocytów B i uzyskiwania hybrydomy EBV znane w tej dziedzinie (patrz np. Boyle et al., Europejski dokument patentowy No. 0 614 984).

Komórki hybrydomy produkujące przeciwciało monoklonalne, które wiąże się specyficznie z biał kiem 40 kDa, wykrywa się przez badania przesiewowe supernatantów kultur hybrydomy, na przykład przez testy szukające przeciwciał, które specyficznie wiążą się z unieruchomionym białkiem 40 kDa, lub przez badanie przeciwciał w sposób tutaj opisany, w celu stwierdzenia, czy przeciwciała mają poszukiwane właściwości, np. hamują proliferację komórkową. Komórki hybrydomy produkujące przeciwciała, które dają pozytywne rezultaty w opisanych tutaj badaniach, można hodować w odżywczym płynie hodowlanym w odpowiednich warunkach i przez odpowiednio długi czas, żeby te komórki hybrydomy wydzieliły przeciwciała do płynu hodowlanego, czyli aby wyprodukowały całe przeciwciała. Metody hodowli kultur tkankowych i płyny hodowlane odpowiednie dla komórek hybrydomy są ogólnie znane w tej dziedzinie (patrz np. R.H. Kenneth, w Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)). Wówczas można zebrać uzyskany supernatant z kultury hybrydomy, zawierający przeciwciała.

Kombinatoryjne biblioteki rekombinowanych przeciwciał

Przeciwciała monoklonalne można otrzymywać tworząc bibliotekę rekombinowanych immunoglobin i badając ją za pomocą białka 40 kDa. Zestawy do tworzenia i badania bibliotek „phage-display” są dostępne handlowo (np., Pharmacia, Recombinant Phage Antibosy System, Catalog No. 27-9400-01; i Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612). Opisują c zwięźle, biblioteka przeciwciał jest przeszukiwana w celu identyfikacji i izolacji fagów wyrażających przeciwciało, które specyficznie wiąże

PL 204 822 B1 się z białkiem 40 kDa. W korzystnym zastosowaniu zasadnicze przeszukiwanie biblioteki zawiera przeszukiwanie za pomocą unieruchomionego białka 40 kDa.

Po przeszukaniu właściwy fag jest izolowany, a następnie odzyskuje się z niego (np. z genomu faga) kodujący wybrane przeciwciało kwas nukleinowy i subklonuje do innych wektorów ekspresyjnych za pomocą dobrze znanych technik rekombinacji DNA. Kwas nukleinowy można poddawać dalszym manipulacjom (np. przyłączaniu do kwasu nukleinowego kodującego dodatkowe domeny immunoglobulinowe, jak na przykład dodatkowe części stałe) i/lub uzyskać jego ekspresję w komórce gospodarza.

Przeciwciała chimeryczne i humanizowane

W celu zmniejszenia odpowiedzi ludzkiego pacjenta na przeciwciał a mo ż na przygotować rekombinowane formy przeciwciał takie, jak przeciwciała chimeryczne i humanizowane. Kiedy w leczeniu pacjentów używa się przeciwciał produkowanych w zwierzętach lub uzyskanych przez ekspresję nie pochodzących od człowieka genów, takie przeciwciała są rozpoznawane w różnym stopniu jako obce i u pacjenta może się pojawić odpowiedź immunologiczna. Jednym z podejść służących do zmniejszenia lub zlikwidowania tej reakcji immunologicznej jest produkcja chimerycznych pochodnych przeciwciał, np. cząsteczek przeciwciał składających się z części zmiennych pochodzenia zwierzęcego i części stałych pochodzących od człowieka. Takie przeciwciała zachowują specyficzność wiązania epitopu wyjściowego przeciwciała monoklonalnego, ale mogą być mniej immunogenne, kiedy podaje się je ludziom, a więc mogą być lepiej tolerowane przez pacjenta.

Chimeryczne przeciwciała monoklonalne można uzyskać za pomocą znanych w tej dziedzinie technik rekombinacji DNA. Na przykład gen kodujący część stałą cząsteczki przeciwciała pochodzenia zwierzęcego jest zastępowany genem kodującym ludzką część stałą (patrz Robinson et al., zgłoszenie PCT/US86/02269; Akira et al., europejskie zgłoszenie patentowe nr 184,187; czy Taniguchi, M. europejskie zgłoszenie patentowe nr 171,496). Przeciwciało chimeryczne można „humanizować” bardziej przez zastępowanie fragmentów części zmiennej niezaangażowanych w wiązanie z antygenem odpowiadającymi im fragmentami pochodzącymi z ludzkich części zmiennych. Artykuły przeglądowe na temat „humanizowanych” przeciwciał chimerycznych to np. Morrison, S.L. (1985) Science, 229:1202-1207 i Oi et al. (1986) BioTechniques, 4:214. Sposoby te obejmują izolowanie, manipulację i ekspresję sekwencji kwasów nukleinowych kodujących całość lub fragment części zmiennej immunoglobuliny pochodzący przynajmniej z jednego ciężkiego lub lekkiego łańcucha. cDNA kodujące humanizowane przeciwciało chimeryczne lub jego fragment może następnie zostać sklonowane do właściwego wektora ekspresyjnego. Odpowiednie „humanizowane” przeciwciała można również uzyskać przez podstawienie regionu determinującego dopasowanie (CDR) (patrz amerykański dokument patentowy nr 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; i Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060).

Do produkcji dimeru polipeptydowego „ludzkiego” przeciwciała, które zachowuje specyficzność wiązania specyficznych dla białka 40 kDa przeciwciał chomika produkowanych przez linie komórkowe hybrydomy zdeponowane w ATCC jako PTA-377, PTA-405 i PTA-404 można wykorzystać także tzw. „imprinting epitopu”. Opisując zwięźle, gen kodujący wiążącą się specyficznie z antygenem część zmienną (VH) pochodzenia zwierzęcego oraz ludzką część stałą (CH1) ulega ekspresji w E. coli, następnie przeprowadza się infekcję biblioteką fagową ludzkich genów Vλ,Cλ. Następnie szuka się pojawiających się na powierzchni fagów fragmentów przeciwciał, które wiążą się z białkiem 40 kDa. Wybrane ludzkie geny Vλ są reklonowane, aby uzyskać ekspresję łańcuchów V1,CX, a następnie E. coli niosące te łańcuchy infekuje się biblioteką fagową ludzkich genów VHCH1, i tak otrzymaną bibliotekę przeszukuje się wielkokrotnie za pomocą probówek pokrytych antygenem. Patrz Hoogenboom et al. zgłoszenie PCT WO93/06213.

Fragmenty przeciwciał

Niniejszy wynalazek obejmuje nowe przeciwciała przeciwnowotworowe i jakiekolwiek ich fragmenty zawierające aktywny region wiążący przeciwciała takie, jak fragmenty Fab, F(ab')2 i Fv. Takie fragmenty można uzyskiwać z przeciwciał używając sposobów znanych w tej dziedzinie (patrz np. Rousseaux et al., w Methods Enzymol., 121:663-69 Academic Press (1986)). Na przykład fragmenty F(ab')2 można otrzymać za pomocą trawienia cząsteczki przeciwciała pepsyną, a fragmenty Fab można uzyskać przez redukcję mostków dwusiarczkowych fragmentów F(ab')2.

Zastosowanie przeciwciał

Opisane tu przeciwciała mają wiele zastosowań. Przeciwciała można wykorzystać in vitro do celów diagnostycznych, aby stwierdzić obecność złośliwych komórek w ludzkich tkankach. Technika obejmuje badanie próbki tkanki na obecność białka 40 kDa. Na przykład można zetknąć próbkę tkanki

PL 204 822 B1 z przeciwciałem monoklonalnym produkowanym przez linie komórkowe hybrydomy nr ATCC PTA-377, nr ATCC PTA-405, i nr ATCC PTA-404 oraz określić, czy przeciwciało wiąże się specyficznie z komórkami w próbce tkanki. Wiązanie wskazuje na obecność komórki nowotworowej. Przeciwciała mogą być również wykorzystywane do testowania próbek krwi na obecność wydzielonego antygenu.

Przeciwciała mogą też być używane do lokalizacji nowotworu in vivo przez podawanie pacjentowi opisanego w tym wynalazku izolowanego przeciwciała, które jest znakowane grupą reporterową dającą wykrywalny sygnał. Związane przeciwciała są następnie wykrywane za pomocą scyntygrafii zewnętrznej, tomografii emisyjnej lub radioscyntygrafii. Technika może być wykorzystywana do oceny zaawansowania nowotworu u badanego, zasięgu choroby i do monitorowania zmian w odpowiedzi na terapię.

Przeciwciała mają również zastosowania terapeutyczne. Nowe przeciwciała można wykorzystać do leczenia nowotworów, ponieważ specyficzne związanie się przeciwciała do komórki nowotworowej powoduje zatrzymanie proliferacji tej komórki i jej śmierć.

Przeciwciała można również używać do celów terapeutycznych jako środki ukierunkowane na nowotwór, kierujące i dostarczające leki przeciwnowotworowe do nowotworu. Takie leki przeciwnowotworowe obejmują leki chemioterapeutyczne, toksyny, modulatory odpowiedzi immunologicznej, enzymy i radioizotopy.

Wykrywalne znaczniki

Przeciwciała reagujące z białkiem 40 kDa można wykorzystywać w diagnostyce, np. w celu wykrywania obecności nowotworu u pacjenta. Detekcję można ułatwić przez sprzęgnięcie przeciwciała z wykrywalnym znacznikiem. Przykłady wykrywalnych znaczników obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, luminescencyjne, chemiluminescencyjne, znaczniki gęstości elektronów, znaczniki do rezonansu magnetycznego i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę czy acetylocholinesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminę fluoresceiny, chlorek dansylu czy fikoerytrynę; przykładem materiału luminescencyjnego może być luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują lucyferazę, lucyferynę i akworynę, a przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S czy ³H.

Przeciwciała jako środki kierujące

Opisane tu przeciwciała i fragmenty przeciwciał można przyłączyć do cząsteczki i wykorzystać przeciwciało do skierowania cząsteczki do miejsca, gdzie znajduje się komórka nowotworowa wyrażająca białko 40 kDa. Przykładami takich cząsteczek mogą być toksyny, radionuklidy lub leki chemioterapeutyczne, które można wykorzystać do zabicia komórek nowotworowych, lub środki obrazujące, które można wykorzystać do lokalizacji i oceny rozmiaru nowotworów wyrażających białko 40 kDa. Przeciwciała używane do kierowania cząsteczek do nowotworów i człowieka są korzystnie przeciwciałami monoklonalnymi, np. humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi.

Przeciwciało można połączyć z cząsteczką np. z toksyną za pomocą cząsteczki oraz przeciwciała kodowanego przez gen fuzyjny, który koduje hybrydowe białko, albo przez sprzężenie, np. niepeptydowym wiązaniem kowalencyjnym, np. wiązaniem nieamidowym, które służy do połączenia uzyskanych oddzielnie przeciwciała i cząsteczki. Opisane tu przeciwciało może być również połączone z innym przeciwciałem, które jest specyficzne dla komórek układu odpornościowego i stymuluje komórki odpornościowe do zabicia nowotworu.

Toksyny

Użyteczne cząsteczki toksyn obejmują toksyny peptydowe, które wewnątrzkomórkowo wykazują się znaczną cytotoksycznością. Przykłady toksyn obejmują cytotoksyny, związki przerywające metabolizm (inhibitory i aktywatory) przerywające aktywność enzymatyczną i w efekcie niszczące komórkę nowotworową oraz cząsteczki radioaktywne zabijające wszystkie komórki w określonej odległości od dawki efektorowej. Związek przerywający metabolizm to cząsteczka, np. enzym lub cytokina, która zmienia metabolizm komórki w sposób zmieniający jej normalne funkcjonowanie. Termin toksyna w szerokim znaczeniu obejmuje wszystkie czynniki wywołujące śmierć komórki nowotworowej.

Wiele toksyn białkowych posiada domenę wiążącą receptory eukariotyczne; w tych przypadkach toksyna musi być zmodyfikowana, żeby nie niszczyła komórek nie zawierających docelowego białka (np. żeby nie niszczyła komórek nie zawierających białka 40 kDa, ale mających receptor dla niezmodyfikowanej toksyny). Takie modyfikacje muszą zostać wprowadzone w taki sposób, żeby zachować cytotoksyczną funkcję cząsteczki. Potencjalnie użyteczne toksyny obejmują ale nie ograniczają

PL 204 822 B1 się do: dyfterotoksyny, toksyny cholery, rycyny, toksyn typu 0-Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIv), toksyny LT, toksyny C3, toksyny Shiga, toksyny krztuśca, toksyny tężca, egzotoksyny Pseudomonas, aloryny, saponiny, modecyny i gelaniny. Inne toksyny obejmują czynnik martwicy nowotworów alfa (TNFa) i limfotoksynę (LT). Inną toksyną o działaniu przeciwnowotworowym jest kalichemicyna gamma 1, przeciwnowotworowy antybiotyk zawierający enediyn, mający działanie przeciwnowotworowe (Zein, N. et al. Science 240:1198-201 (1988)).

Jako przykład, do opisanych tu przeciwciał może zostać przyłączona dyfterotoksyna. Toksyna błonicy, której sekwencję poznano, została szczegółowo opisana w Murphy, amerykański dokument patentowy nr 4,675,382, który jest tu włączony jako odnośnik. Wydzielana naturalnie przez Cornyebacterium diphteriae cząsteczka dyfterotoksyny składa się z kilku funkcjonalnych domen, które mogą być scharakteryzowane, zaczynając od N-końca cząsteczki, jako enzymatycznie aktywny Fragment A (aminokwasy Gly1-Arg193) i Fragment B (aminokwasy Ser194-Ser535), zawierający domenę translokazy i domenę wiązania się do komórki (aminokwasy od 475 do 535).

Przyłączanie toksyn do przeciwciał

Przeciwciało i cząsteczka toksyny mogą być połączone na kilka różnych sposobów. Jeśli związek wytwarza się za pomocą ekspresji genu fuzyjnego, połączeniem między cytotoksyną a przeciwciałem jest wiązanie peptydowe. Toksyna i przeciwciało mogą też zostać wyprodukowane oddzielnie, a następnie połączone za pomocą niepeptydowego wiązania kowalencyjnego. Wiązanie kowalencyjne może na przykład mieć formę wiązania dwusiarczkowego. W tym przypadku można za pomocą konwencjonalnych metod inżynierii genetycznej umieścić w DNA kodującym przeciwciało dodatkowy kodon cysteinowy.

W celu uzyskania wiązania dwusiarczkowego w cząsteczce toksyny można również wprowadzić grupę tiolową reagującą z cysteiną pochodzącą z modyfikowanego przeciwciała. W przypadku toksyn białkowych takie połączenie można osiągnąć poprzez włączenie kodonu cysteinowego do sekwencji DNA kodującej toksynę. Innym sposobem jest wprowadzenie grupy tiolowej, oddzielnie lub jako części reszty cysteinowej, przy użyciu metod modyfikacji polipeptydów w fazie stałej. Przykładowo wprowadzanie grup tiolowych do peptydów jest opisane w Hiskey, Peptides, 3:137 (1981).

Wytwarzanie pochodnych może być także przeprowadzone według metody opisanej dla wytwarzania pochodnych hormonu peptydowego w Bacha et al., amerykański dokument patentowy. 4,468,382. Wprowadzanie grup tiolowych do białek opisane jest też w Maasen et al., Eur. J. Biochem. 134:32 (1983). Kiedy wymagane grupy tiolowe są już obecne, oczyszcza się cytotoksynę i przeciwciało, redukuje obie grupy siarkowe, miesza cytotoksynę i przeciwciało (w proporcjach około 1:5 do 1:20), a następnie w temperaturze pokojowej w czasie około 20-30 minut zachodzi reakcja formowania wiązań dwusiarczkowych. Następnie mieszaninę dializuje się w roztworze soli buforowanym fosforanem w celu pozbycia się cząsteczek przeciwciała i toksyny, które nie wzięły udziału w reakcji. Do oddzielenia koniugatów przeciwciało-toksyna od koniugatów przeciwciało-przeciwciało i toksyna-toksyna na podstawie różnic w wielkości stosuje się chromatografię na złożu Sephadex® lub podobne metody.

Modulatory odpowiedzi immunologicznej

Cząsteczki o działaniu przeciwnowotworowym mogą być także modulatorami układu odpornościowego miejscowo aktywującymi bądź hamującymi układ odpornościowy organizmu. Przykładowo cytokiny, np. limfokiny takie jak IL-2, dostarczone do nowotworu mogą spowodować proliferację limfocytów T cytotoksycznych lub komórek NK (natural killer) w pobliżu nowotworu.

Cząsteczki radioaktywne

Cząsteczka lub grupa reporterowa może być również cząsteczką radioaktywną, np. radionukleotydem, lub tzw. sensybilizatorem, np. cząsteczką prekursorową, która w określonych warunkach staje się radioaktywna, np. bor poddany działaniu wiązki neutronów o małych energiach, w tzw. terapii borowo-neutronowej (BNCT), patrz Barth et al., Scientific American, październik 1990:100-107 (1990). Związki zawierające takie radioaktywne cząsteczki efektorowe można wykorzystywać zarówno do hamowania proliferacji komórek nowotworowych, jak i do znakowania komórek nowotworowych w celu ich obrazowania.

Radionuklidy to pojedyncze atomy emitujące cząstki α, β, lub γ. W porównaniu ze źródłami promieniowania emitującymi cząstki β lub γ preferowane są źródła promieniowania emitujące cząstki α, ponieważ wykazują znacznie wyższą emisję energii na krótszych dystansach, i w związku z tym są efektywne, nie wykazując znacznego stopnia penetracji i uszkodzenia normalnych tkanek. Odpowiednie radionuklidy emitujące cząstki α obejmują ²¹¹At, ²¹²Pb i ²¹⁷Bi.

PL 204 822 B1

Cząsteczka radioaktywna musi być silnie związana z przeciwciałem bezpośrednio lub za pomocą bifunkcjonalnych chelatów. Taki chelat nie może pozwalać na elucję, a co za tym idzie, przedwczesne uwolnienie radioaktywnej cząsteczki in vivo, patrz Waldman, Science, 252:1657-62 (1991). Adaptacja BNCT do potrzeb prezentowanego wynalazku wymaga wybrania stabilnego izotopu boru, np. boru 10, jako cząsteczki przeciwnowotworowej lub efektorowego fragmentu związku. Specyficzne wiązanie przeciwciała do komórki nowotworowej umożliwia dostarczenie i koncentrację boru we wnętrzu lub na powierzchni komórek nowotworowych. Po czasie wystarczającym do zgromadzenia się odpowiedniej ilości boru nowotwór jest obrazowany i napromieniany wiązką neutronów o małych energiach, o energii równej ok. 0,025 eV. Podczas gdy takie napromienianie samo w sobie wywołuje niewielkie uszkodzenia zdrowych tkanek otaczających nowotwór i samego nowotworu, bor 10 (np. znajdujący się na powierzchni komórek nowotworowych) wychwytuje neutrony i przechodzi w niestabilny izotop, bor 11. Bor 11 natychmiast ulega rozszczepieniu dając jądra litu 7 i wysokoenergetyczne cząstki α, około 2,79 milionów eV. Te cząstki ciężkie są silnie zabójczą ale bardzo lokalną formą promieniowania, ponieważ cząstki mają długość drogi równą mniej więcej średnicy pojedynczej komórki (10 μm).

Obliczenia wykazały, że dla zniszczenia komórki nowotworowej potrzeba około jednego miliarda atomów boru oraz przepływu neutronów termicznych w ilości 10¹² - 10¹³ neutronów na centymetr kwadratowy, tak, że promieniowanie wytwarzane przez cząstki α przekracza promieniowanie tła wytwarzane przez reakcje wychwytu neutronów przez azot i wodór.

Cząsteczki obrazujące

Opisane tu przeciwciała wiążą się specyficznie z białkiem 40 kDa, więc mają zastosowanie w wykrywaniu nowotworów u człowieka. Jedno z takich podejść obejmuje wykrywanie nowotworów in vivo sposobami obrazowania nowotworów przy użyciu przeciwciał znakowanych odpowiednią cząsteczką lub grupą reporterową np. odczynnik obrazujący dający wykrywalny sygnał. Odczynniki obrazujące i procedury znakowania przeciwciał takimi odczynnikami są dobrze znane (patrz np. Wensel i Meares, Radio Immunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York (1983); Colcher et al., Meth. Enzymol. 121:802-816 (1986)). Znakowane przeciwciało można wykryć przy użyciu takich technik, jak radioscyntygrafia (patrz np. Bradwell et al. w “Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy”, Baldwin et al. (eds.), pp. 65-85, Academic Press (1985)).

Podawanie

Opisane tu przeciwciała można podawać badanemu, np. zwierzęciu lub człowiekowi, w celu obrazowania lub leczenia nowotworów. Przeciwciała mogą być podawane osobno, lub w mieszaninie, np. w obecności farmaceutycznie akceptowalnej zaróbki lub nośnika (np. roztworu soli fizjologicznej). Zaróbkę lub nośnik wybiera się na podstawie sposobu i drogi podawania. Odpowiednie nośniki farmaceutyczne opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences (E.W. Martin), szeroko znanym tekście w tej dziedzinie, oraz w USP/NF (United States Pharmacopeia and the National Formularly).

Kompozycję farmaceutyczną tworzy się tak, by pasowała do zamierzonej drogi podawania. Przykłady dróg podawania obejmują podawanie pozajelitowe, np. podawanie dożylne, śródskórne, podskórne, doustne (np. inhalacja), przezskórne (miejscowe), przezśluzówkowe i doodbytnicze. Roztwory bądź zawiesiny używane do podawania pozajelitowego, śródskórnego czy podskórnego zawierają następujące składniki: sterylne rozcieńczalniki takie jak woda do zastrzyków, roztwór soli, oleje nielotne, poli(glikole etylenowe), gliceryna, glikol propylenowy czy inne rozpuszczalniki syntetyczne; środki antybakteryjne takie jak alkohol benzylowy czy hydroksybenzoesan metylu; przeciwutleniacze takie jak kwas askorbinowy czy wodorosiarczan (IV) sodu; związki chelatujące takie jak kwas wersenowy; bufory takie jak octanowe, cytrynianowe czy fosforanowe oraz czynniki służące do regulacji ciśnienia osmotycznego takie jak chlorek sodu czy dekstroza. pH można regulować za pomocą kwasów lub zasad, takich, jak kwas chlorowodorowy czy wodorotlenek sodu. Preparat pozajelitowy może zostać zamknięty w ampułkach, jednorazowych strzykawkach czy plastikowych lub szklanych fiolkach zawierających wiele dawek.

Najbardziej efektywne sposoby podawania i sposoby dawkowania kompozycji prezentowanych w tym wynalazku zależą od ciężkości i przebiegu choroby, zdrowia pacjenta i jego odpowiedzi na terapię oraz osądu lekarza prowadzącego. Również wielkość dawek kompozycji powinna być ustalona dla pacjenta indywidualnie. Efektywna dawka kompozycji przeciwciał opisanych w tym wynalazku zawiera się w granicach od 1 μg do około 5000 mg, preferowana dawka to 1 do 500 mg, lub 100-200 mg.

Zestawy diagnostyczne

Wynalazek obejmuje również zestawy diagnostyczne służące do stosowania sposobów opisanych powyżej. Zestaw diagnostyczny zawiera (a) opisane tu przeciwciało monoklonalne oraz (b) koniugat

PL 204 822 B1 specyficznego związku wiążącego przeciwciało i znacznika do wykrywania związanego przeciwciała. Zestaw może również zawierać środki pomocnicze takie jak środki buforujące i czynniki stabilizujące białka, np. polisacharydy i tym podobne. Zestaw diagnostyczny może także zawierać, jeśli to potrzebne, inne składniki systemu wytwarzania sygnału, w tym środki zmniejszające zakłócenia wynikające z tła, odczynniki kontrolne oraz aparat do przeprowadzania testu. Inna możliwość to zestaw zawierający koniugat przeciwciała monoklonalnego opisanego w wynalazku i znacznika mogącego dać wykrywalny sygnał. Może on także zawierać środki pomocnicze, jak to opisano powyżej. Zazwyczaj zestaw zawiera również instrukcje dotyczące sposobu użycia.

Polipeptydy

Opisane tu przeciwciała monoklonalne można wykorzystać do izolacji i badania właściwości białka 40 kDa, do którego się wiążą. Białko rozpoznawane przez te przeciwciała monoklonalne to nowe białko powierzchniowe występujące na wielu komórkach nowotworowych, w tym komórkach chłoniaka grasicy, nowotworu z limfocytów T, chłoniaka z limfocytów B, czerniaka, kostniakomięsaka i białaczki limfoblastyczną z komórkami T. Białko to jest induktorem śmierci komórkowej, co opiera się na obserwacji, że związanie się przeciwciał monoklonalnych do tego białka powoduje śmierć komórki, w której ulega ono ekspresji.

Białko rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne będące przedmiotem tego wynalazku można wyizolować z komórek, w których ulega ono ekspresji (np. E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat czy Cos). Na przykład opisane tu przeciwciała monoklonalne można wykorzystać do immunoprecypitacji tego białka. Dla określenia sekwencji białka można je oczyścić przy użyciu elektroforezy SDS-PAGE, przenieść na membranę Immobilon (Milipore Corp., Bedford, MA) metodą „electroblotting” i wybarwić za pomocą Coomassie Brillant Blue. Wybarwiony prążek białka o masie ok. 40 kDa można następnie wyciąć żyletką w celu analizy sekwencji N-końcowej. Sposoby analizy sekwencji od N-końca takie jak np. zautomatyzowana degradacja Edmana, są powszechnie znane w tej dziedzinie.

Wynalazek może być również zastosowany do otrzymywania białek fuzyjnych zawierających białko 40 kDa połączone z innym białkiem. Inne białko może zostać wybrane, by ułatwić oczyszczanie, wykrywanie, rozpuszczanie, lub by uzyskać jakąś inną funkcję. Białka fuzyjne można produkować syntetycznie, albo poprzez łączenie białka 40 kDa z innym białkiem używając odpowiednich czynników sprzęgających, np. dicykloheksylokarbodiimidu (DCC). Innym sposobem uzyskiwania białek fuzyjnych jest zastosowanie metod rekombinacji DNA do wklonowania kodującej białko fuzyjne sekwencji nukleotydowej do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Rekombinowany polipeptyd fuzyjny można następnie oczyścić z pożywki hodowlanej lub z lizatów komórkowych.

Białko 40 kDa jest przydatne np. jako szczepionka uodparniająca na pewne nowotwory. Procedury przygotowywania takich szczepionek są znane w tej dziedzinie (patrz np. Estin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85:1052 (1988)). Opisując pokrótce, produkuje się rekombinowane wirusy wytwarzające sklonowane białko związane z nowotworem. W komórkach zainfekowanych rekombinowanymi wirusami białko to będzie ulegać ekspresji na powierzchni komórek razem z antygenami zgodności tkankowej gospodarza i immunogennymi białkami wirusa. To stymuluje indukcję odporności komórkowej, która odgrywa kluczową rolę w odrzucaniu nowotworów. Wynalazek dostarcza również metod identyfikowania modulatorów, np. badanych związków lub środków (np. peptydów, peptydomimetyków, małych cząsteczek lub leków) wiążących się z białkiem 40 kDa lub wywierających stymulujący bądź hamujący efekt na ekspresję lub aktywność białka 40 kDa. Na przykład antagonista białka 40 kDa byłby użyteczny do hamowania apoptozy w komórce. Taki antagonista mógłby odegrać rolę w hamowaniu anormalnej apoptozy u pacjenta.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1: Wytwarzanie przeciwciał przeciwnowotworowych

Próba identyfikacji nowych funkcjonalnych cząsteczek zaangażowanych we wzrost i przetrwanie chłoniaków i/lub w normalne funkcjonowanie tymocytów doprowadziła do następującej drogi uzyskania hybrydomy z chomików, którym podano w zastrzykach E710.2.3. Chomikom armeńskim podawano śródotrzewnowo 10 milionów komórek E710.2.3 i zwiększano dawkę 7-10-krotnie przed fuzją. Fuzje przeprowadzano przy użyciu partnera fuzyjnego P3X63-AG8.653 jak to opisano w Schreiber et al., (1985) Immunol. 134:1609. Supernatanty z hybryd badano za pomocą immunofluorescencji i cytometrii przepływowej szukając przeciwciał wiążących E710.2.3. Jedno przeciwciało, nazwane tu DMF10.62.3, silnie barwiło powierzchnię E710.2.3.

PL 204 822 B1

Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że DMF10.62.3 reagowało z licznymi mysimi liniami komórkowymi (Tabela 1), ale w innych było nieobecne (Tabela 2). Reagujące pozytywnie linie komórkowe obejmowały kilka linii pochodzących od limfocytów T (np. RMA-S), kilka linii białaczki z komórkami B (np. A20 i WEHI-231) oraz linię makrofagów (C2.3). DMF10.62.3 wiązało się specyficznie także z kilkoma unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi nie pochodzącymi od komórek krwiotwórczych, w tym zrę bową linią komórkową (PBK101A2), czerniakiem (B16), mię sakiem (MC57) oraz fibroblastami transformowanymi poliomawirusem (WOP-3027). Kilka innych niedojrzałych (np. G58.2) i dojrzałych (np. EL4) linii limfocytów T, makrofagów (np. A3.1), komórek dendrytycznych (DC2.4) oraz linii fibroblastów (LADp31) okazało się negatywnych pod względem wiązania DMF10.62.3. Co ciekawe, przeciwciało monoklonalne reagowało również z kilkoma ludzkimi unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi, w tym liniami Jurkat, 293T i 143Btk- oraz z małpią linią komórek nerki transformowanych wirusem SV40, Cos7. DMF10.62.3 nie wiązało się z niektórymi ludzkimi liniami komórkowymi, np. z linią limfoblastycznych komórek B, 721, oraz z linią raka szyjki macicy HeLa. Wzory znakowania reprezentatywnych linii komórkowych są pokazane na Fig. 1 dla pozytywnych pod względem DMF10.62.3 komórek E710.2.3 (Fig. 1A), A20 (Fig. 1B) i Jurkat (Fig. 1C) oraz negatywnych pod względem DMF10.62.3 komórek RF33.70 (Fig. 1D).

T a b e l a 1.

LINIA KOMÓRKOWA	OPIS
E710.2.3	Mysi chłoniak grasicy
RMA-S	Mysi nowotwór limfocytów T
CTLL	Mysia linia limfocytów T zależnych od IL-2
LB27.4	Mysia hybrydoma limfocytów B
A20	Mysi chłoniak limfocytów B
WEHI-231	Mysi chłoniak limfocytów B
PBK101A2	Mysia linia komórek zrębu grasicy
C2.3	Mysie unieśmiertelnione makrofagi szpikowe
B16	Mysi czerniak
MC57	Mysi nowotwór indukowany metylcholantrenem
WOP-3027	Mysie fibroblasty transformowane poliomawirusem
293T	Ludzkie transformowane pierwotne embrionalne komórki nerki
143Btk-	Ludzki kostniakomięsak

Powyższe dane wskazują, że nowe przeciwciała wiążą się specyficznie do wielu, ale nie do wszystkich unieśmiertelnionych linii komórkowych, i że wiązanie się nie jest zależne od gatunku bądź pochodzenia linii komórkowej.

T a b e l a 2.

LINIA KOMÓRKOWA	OPIS
1	2
RF33.70	Mysia hybryda T-T
DO11.10	Mysia hybryda T-T
13G7.3.2	Mysia hybryda T-T
HT-2	Mysia linia limfocytów T zależnych od IL-2
EL-4	Mysi chłoniak limfocytów T
G58.2	Mysi chłoniak grasicy
NFC105	Mysi chłoniak grasicy

PL 204 822 B1 cd. tabeli 2

1	2
P815	Mysi guz z komórek tucznych
P388D1	Mysi nowotwór monocytów/makrofagów
LADp31	Mysia linia komórek L
A3.1	Mysia unieśmiertelniona linia makrofagów szpikowych
DC2.4	Mysia unieśmiertelniona linia komórek dendrytycznych
721	Ludzka linia limfocytów B
HeLa	Ludzka linia nabłonkowych komórek raka szyjki macicy
E36	Chomiczy rak płuc
BHK-21	Chomicza linia komórek nerki
CHO	Linia komórek jajnika chomika chińskiego

P r z y k ł a d 2: Ekspresja cząsteczki rozpoznawanej przez DMF10.62.3

Ekspresja cząsteczki rozpoznawanej przez DMF10.62.3 w tymocytach płodowych została zbadana w następujący sposób. Z ciąży myszy szczepu C57B1/10 uzyskano embriony, które uśmiercono w czternastym dniu ciąży. Płodowe grasice zebrano w PBS używając szklanego tłoka do probówek Eppendorf. Zawiesiny pojedynczych komórek inkubowano przez 20 minut w lodzie z przeciwciałami przeciw receptorowi Fc gamma II/III (Pharmigen), aby zablokować receptory Fc. Następnie komórki znakowano DMF10.62.3 lub IgG chomika przez 30 minut, a następnie kozimi przeciwciałami przeciwchomiczymi wyznakowanymi FITC oraz przeciwciałami anty-Thy1.2 skoniugowanymi z allofikocyjaniną (APC) (Pharmingen). W niektórych eksperymentach użyto również przeciwciał anty-CD25 skoniugowanych z PE oraz anty-CD44 skoniugowanych z Cy-Chrome (Pharmingen). Wyznakowane komórki utrwalano przez noc w 1% para-formaldehydzie, a następnie analizowano za pomocą cytometrii przepływowej.

Wyniki pokazują, że 14-dniowe płodowe tymocyty znakowane DMF10.62.3 wykazują ekspresję białka 40 kDa, a białko znaleziono na komórkach pozytywnych pod względem Thy1.2 (Fig. 2A). Interesujący jest fakt, że białko było obecne zarówno na tymocytach płodowych CD25+CD44+, jak i na tymocytach płodowych CD44+CD25-. Jednak znakowanie tymocytów z osobników dorosłych (Fig. 2C), komórek śledziony z osobników dorosłych (Fig. 2B) i komórek szpiku kostnego z osobników dorosłych (Fig. 2D) wykazało, że białko rozpoznawane przez DMF10.62.3 nie występuje na żadnych z tych komórek na poziomie wyższym, niż wykrywalny przez kontrolne chomicze IgG. Co więcej, białko nie było wykrywalne na dorosłych CD4-CD8- tymocytach po bramkowaniu na komórki CD4-CD8- w analizie wieloparametrowej za pomocą cytometrii przepływowej czy analizy tej populacji z myszy RAG-/-. Również komórki wątroby 14-dniowego płodu nie reagowały z DMF10.62.3.

Aby stwierdzić, czy białko rozpoznawane przez DMF10.62.3 występuje na normalnych, aktywowanych komórkach, śledzionowe limfocyty T aktywowano mitogenem limfocytów T, ConA i znakowano w celu wykrycia ekspresji białka rozpoznawanego przez DMF10.62.3 w następujący sposób: komórki śledziony, grasicy i szpiku kostnego uzyskano z dorosłych (4-6 miesięcznych) myszy Balb/C lub C57B1/6. Czerwone ciałka krwi usunięto z zawiesiny komórek śledziony za pomocą lizy z użyciem chlorku trisamonu. Niestymulowane komórki natychmiast znakowano. Limfoblasty stymulowano w hodowli 1 μ g/ml ConA lub 10 μ g/ml LPS. Po 1-3 dniach hodowli komórki znakowano w celu stwierdzenia ekspresji DMF10.62.3. Nie wykryto znaczącego sygnału powyżej poziomu tła w komórkach niestymulowanych (Fig. 3A), w komórkach stymulowanych ConA 24 (Fig. 3B), 48 (Fig. 3C) czy 72 (Fig. 3D) godziny po aktywacji (nie wykazano przesunięcia na wykresie z FACS). Komórki stymulowane ConA jako kontrolę pozytywną znakowano CD25. Zgodnie z oczekiwaniami stymulacja ConA spowodowała znaczący wzrost ekspresji CD25 na tych komórkach w porównaniu z komórkami niestymulowanymi (wiązanie CD25 do komórek powoduje przesunięcie na wykresie z FACS). Podobnie aktywacja śledzionowych limfocytów B za pomocą lipopolisacharydu (LPS) nie spowodowała znakowania DMF10.62.3 po 24 (Fig. 3E), 48 (Fig. 3F) i 72 (Fig. 3G) godzinach (nie wykazano przesunięcia na wykresie z FACS), podczas gdy komórki te wykazywały ekspresję CD25 (przesunięcie na wykresie z FACS). Biał ko rozpoznawane przez DMF10.62.3 nie wystę puje na komórkach szpiku kostnego

PL 204 822 B1 osobników dorosłych (Fig. 2D). Te dane wskazują, iż białko rozpoznawane przez DMF10.62.3 występuje na niektórych tymocytach płodowych, ale nie na normalnych spoczynkowych i aktywowanych komórkach krwiotwórczych w dorosłych zwierzętach.

P r z y k ł a d 3: DMF10.62.3 hamuje proliferację komórek nowotworowych

Komórki E710.2.3 hodowane w niskiej gęstości i bez PMA proliferują powoli lub wcale. Jednakże proliferują, gdy są hodowane razem z tymocytami. DMF10.62.3 zidentyfikowano początkowo dzięki temu, że blokuje ono tę indukowaną przez tymocyty proliferację. Jak pokazano w Tabeli 3, DMF10.62.3 całkowicie hamuje tę odpowiedź (Fig. 4A). Testy proliferacji przeprowadzano w następujący sposób: komórki E710.2.3 odpłukiwano z PMA i hodowano przez 48 godzin w kompletnym RPMI w niskiej gęstości (<10⁵/ml), aby zmniejszyć tło proliferacji. Następnie 5x10³ komórek hodowano przez 72 godziny w płytkach mikrotitracyjnych z płaskim dnem z dodatkiem 25 ng/ml PMA lub 5x10⁵ tymocytów w obecności lub przy braku przeciwciał. W doświadczeniach badających wpływ przeciwciał na spontaniczną proliferację komórki E710.2.3 (hodowane w wysokiej gęstości >10⁵/ml) lub komórki RMA-S hodowano przez 36 godzin w obecności lub przy braku różnych stężeń przeciwciał. Na ostatnie 5 godzin dodawano ³H-tymidynę (1 Tci/studzienka) i mierzono inkorporację znacznika do DNA w liczniku J-scyntylacyjnym (Wallac, Gaithersburg, MD).

T a b e l a 3.

	Podłoże	Tymocyty	PMA
kontrola (bez przeciwciała)	8699	33802	54271
DMF10.62.3	938	750	450
DMF10.132	6646	27156	25216

Zbadano również wpływ DMF10.62.3 na hamowanie odpowiedzi E710.2.3 na inne bodźce. Jak pokazano w Tabeli 3, przeciwciało blokowało również proliferację E710.2.3 indukowaną przez PMA. Co więcej, E710.2.3 proliferowały spontanicznie, gdy hodowano je w wysokiej gęstości, a DMF10.62.3 hamowało także i tę odpowiedź (Fig. 4A). Proliferację znacząco hamuje stężenie 3 μg/ml, a całkowite hamowanie obserwuje się przy stężeniu 12,5 μg/ml. W przeciwieństwie do tego, chomicze IgG nie miały wpływu na odpowiedź E710.2.3 (Fig. 4A) na żaden z tych bodźców. Podobnie, liczne przeciwciała monoklonalne pochodzące z fuzji wyjściowej wiązały się z E710.2.3, ale nie hamowały ich proliferacji (np. DMF10.132) (Tab. 3). Tak więc DMF10.62.3 specyficznie hamuje proliferację E710.2.3 niezależnie od rodzaju stymulacji użytego do indukowania proliferacji.

Białko rozpoznawane przez DMF10.62.3 występuje na licznych innych liniach komórkowych. Tak więc wydawało się interesujące, czy przeciwciało to wywiera podobny efekt na ich spontaniczną proliferację. DMF10.62.3 hamowało proliferację RMA-S (Fig. 4B) oraz licznych testowanych linii komórkowych. Nie wykazywało jednak wpływu na spontaniczną proliferację RF33.70, które nie wykazywały ekspresji białka wiążącego się z DMF10.62.3 (Fig. 4C).

P r z y k ł a d 4: DMF10.62.3 indukuje śmierć komórek w wyniku apoptozy

Apoptozę badano używając zestawów z R&D (Minneapolis, MN) i Pharmingen (San Diego, CA). Pokrótce, 2x10⁵ komórek inkubowano z różnymi stężeniami przeciwciała w 200 il podłoża. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS, traktowano PI i FITC sprzężonym z aneksyną przez 15 minut, a następnie analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Fragmentację DNA analizowano za pomocą elektroforezy w 2% żelu agarozowym, jak to opisano w Schattner et al., J. Exp. Med. (1995) 182:1557.

Hodowle komórek traktowanych przeciwciałem DMF10.62.3 oglądano i zanotowano, że ilość nietkniętych komórek spadała. W dodatku komórki barwiły się błękitem trypanu, który nie wnika do żywych komórek. Ta obserwacja, jak również zahamowanie proliferacji, sugerowała, że przeciwciało było dla komórek cytotoksyczne. Tak więc przeprowadzono badania, by określić mechanizm, za pomocą którego DMF10.62.3 indukuje śmierć komórkową.

Komórki mogą umierać przez apoptozę albo przez nekrozę. Jedną z wczesnych zmian w komórkach wchodzących w apoptozę jest pojawienie się fosfatydyloseryny na zewnętrznej stronie błony komórkowej, co można wykryć za pomocą znakowania aneksyną związaną z FITC. W początkowych fazach procesu komórka może nie barwić się barwnikami przyżyciowymi, np. jodkiem propidyny, więc można ją określić jako FITC-aneksyna-pozytywną i Pl-negatywną W dalszych etapach procesu apoptozy błona komórkowa traci ciągłość i komórki FITC-aneksyna pozytywne stają się Pl-pozytywne.

PL 204 822 B1

Natomiast komórki nekrotyczne tracą ciągłość błony komórkowej i stają się równocześnie FITC-aneksyna pozytywne i PI-pozytywne, nie przechodząc fazy komórek FITC-aneksyna pozytywnych i PI-negatywnych.

Na wykresach z FACS przedstawionych na Fig. 5A do 5I komórki w lewej dolnej ćwiartce to żywe komórki, komórki w prawej dolnej ćwiartce wchodzą w apoptozę (FITC-aneksyna pozytywne), a komórki w górnej prawej ćwiartce to komórki martwe na skutek apoptozy i/lub nekrozy (Pl-pozytywne i FITC-aneksyna pozytywne). Pokazano również procent komórek w każdej ćwiartce. W prezentowanych badaniach pewien procent komórek E710.2.3 w hodowli spontanicznie wszedł w apoptozę (10,9-15% aneksyna+, PI-). Jednakże zaledwie 1 μg/ml DMF10.62.3 powodował znaczący wzrost apoptozy w przeciągu 1 godziny (28,9% aneksyna+, PI-; Fig. 5A), a z czasem ilość komórek apoptotycznych wzrastała (48,6% aneksyna+, PI- po 3 godzinach; Fig. 5C). Większe ilości DMF10.62.3 (15 μg/ml) stymulowały apoptozę szybciej (37,1% aneksyna+, PI- po 1 godzinie) i w większej ilości komórek (Fig. 5E-G). Traktowanie komórek podobnymi stężeniami IgG chomika nie miało znaczącego wpływu wyższego, niż sama pożywka (Fig. 5D, 5H, 5I). Apoptozę potwierdzano także przez obserwację fragmentacji DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Ponieważ białko rozpoznawane przez DMF10.62.3 ulegało ekspresji na innych komórkach, i przeciwciało to hamowało ich proliferację (tych komórek, które testowano), zbadano, czy DMF10.62.3 stymuluje je również do wejścia w apoptozę. DMF10.62.3 powodowało znaczącą apoptozę w mysich liniach komórkowych RMA-S, CTLL, LB27.4 i A20 oraz w ludzkich liniach komórkowych Jurkat i 143Btk- (Tab. 4). Apoptozę indukowało podanie 15 μg/ml DMF10.62.3, a zwiększenie stężenia przeciwciała powodowało zwiększenie apoptozy. DMF10.62.3 nie indukowało apoptozy komórek RF33.70, w których nie zachodzi ekspresja rozpoznawanego przez nie białka. Poziom apoptozy indukowanej przez DMF10.62.3 różni się dla różnych linii komórkowych i wydaje się być zależny od poziomu ekspresji powierzchniowej i od procentu komórek w populacji, które produkują rozpoznawane przez DMF10.62.3 białko (Tabela 4). Na przykład DMF10.62.3 indukowało wysoki poziom apoptozy w komórkach E710.2.3 i RMA, u większości których ekspresja rozpoznawanego przez to przeciwciało białka zachodzi na wysokim poziomie. W przeciwieństwie do nich, nieliczne komórki A20 i LB27.4 produkują białko 40 kDa na niskim poziomie i DMF10.62.3 indukowało u nich niższe poziomy apoptozy (Tabela 4). Stymulacja apoptozy przez DMF10.62.3 wydaje się nie być zależna od białka Fas, ponieważ w komórkach E710.2.3 i RMA Fas nie ulega ekspresji (Tab. 4).

T a b e l a 4.

Linia komórkowa	% komórek apoptotycznych
mysie linie limfocytów T	DMF10.62.3	Chomicze IgG	Nie traktowane	Intensywność fluorescencji DMF10.62.3 /chomicze IgG	% komórek znakowanych pozytywnie na DMF10.62.3	barwienie na powierzch. ekspresję mysiego Fas
E710.2.3	86,9	19,8	24,7	27,5	72,6	-
RMA-S	69,6	12,2	14,0	14,5	60,6	-
CTLL	36,4	14,8	16,7	8,88	51,5	-
RF33.70	8,1	8,6	7,8	0,98	0,48	-
mysie linie limfocytów B
LB27.4	16,8	7,1	10,8	1,48	7,0	+
A20	16,2	13,8	12,2	3,3	24,8	+
ludzkie linie
Jurkat	33,9	12,6	11,8	16,18	49,2	ND
143Btk-	29,7	21,1	20,5	3,8	29,5	ND

PL 204 822 B1

P r z y k ł a d 5: DMF10.62.3 powoduje agregację homotypową w E710.2.3 i innych liniach komórkowych

Agregacja homotypowa to aktywny biologicznie proces, w którym komórki są stymulowane, by łączyły się ze sobą. Testy agregacji przeprowadzono w następujący sposób: 10⁵ komórek inkubowano z różnymi stężeniami DMF10.62.3 lub IgG chomika lub bez przeciwciała w 200 il kompletnego RPMI. Aby zbadać wpływ inhibitorów 10⁵ komórek preinkubowano z inhibitorem przez 30 minut a następnie dodawano przeciwciało monoklonalne DMF10.62.3 (10 μg/ml) w obecności inhibitora i inkubowano przez 6 godzin. Aby zbadać wpływ para-formaldehydu na agregację komórki utrwalano w 1% para-formaldehydzie przez 10 minut, przemywano, dodawano DMF10.62.3 i inkubowano przez 6 godzin. Agregację badano przez obserwację. Zdjęcia fotomikrograficzne wykonywano po 6 godzinach używając chłodzonej termoelektrycznie kamery CCD (Princeton Instruments, Trenton, NJ). DMF10.62.3 wywoływało agregację homotypową komórek E710.2.3 w hodowli. Po 6 godzinach obserwowano znaczącą agregację komórek inkubowanych z 5 μg/ml lub większą ilością przeciwciała. Nie zaobserwowano agregacji w hodowlach inkubowanych z IgG chomika lub z samym podłożem. Agregację blokowało traktowanie komórek różnymi czynnikami, w tym cytochalazyną B, która rozrywa filamenty aktynowe, trifluoperazyną, która hamuje procesy zależne od kalmoduliny, azydkiem sodu i 2-deoksyglukozą które hamują syntezę ATP, oraz EDTA, która chelatuje Ca²⁺ i Mg²⁺. W przeciwieństwie do tego, kolchicyna, hamująca powstawanie mikrotubul, nie wpływała na agregację. Również inkubacja w 4°C i traktowanie para-formaldehydem hamowały agregację (Tabela 5). Te wyniki wskazują że agregacja jest aktywnym procesem, a nie po prostu aglutynacją.

T a b e l a 5

Użyty związek	Wpływ na komórkę	Adhezja homotypowa
cytochalazyna B (20 μg/ml)	cytoszkielet (rozrywa mikrofilamenty aktynowe)	-
kolchicyna (20 μg/ml)	hamuje formację mikrotubul	+
trifluoperazyna (20 μM)	hamuje procesy zależne od kalmoduliny	-
azydek sodu (0,1%) + deoksyglukoza (5 mM)	2- hamuje syntezę ATP	-
EDTA (10 mM)	chelatuje Ca2+ i Mg2+	-
tylko podłoże	KONTROLA (brak efektu)	+
4°C		-
para-formaldehyd		-

DMF10.62.3 powoduje również agregację homotypową niektórych spośród innych linii komórkowych (np. RMA-S, CTLL), które wyrażają białko wiążące DMF10.62.3. Jednak niewielka agregacja powyżej poziomu tła była widoczna także dla innych linii komórkowych wiążących DMF10.62.3 (np. Jurkat, LB27.4, A20, 143Btk-). Nie obserwowano agregacji RF33.70, do których DMF10.62.3 się nie wiąże.

Test na agregację może być wykorzystywany, aby pomóc określić, czy nowe przeciwciało zalicza się do nowych przeciwciał przeciwnowotworowych z prezentowanego wynalazku.

P r z y k ł a d 6: DMF10.62.3 immunoprecypituje białko 40 kDa nie połączone za pomocą GPI

Aby zbadać właściwości białka wiązanego przez DMF10.62.3, przeprowadzono znakowanie ³⁵S i immunoprecypitację w następujący sposób: 5x10⁶ komórek E710.2.3 głodzono przez godzinę w podłożu hodowlanym pozbawionym metioniny a następnie inkubowano przez 2 godziny z metioniną ³⁵S w stężeniu 0,5 mCi/ml. Znakowane komórki zlizowano w buforze do immunoprecypitacji, jaki opisano w Townsend et al. J. Immunol. (1990), 146:2235). Klarowane lizaty wstępnie oczyszczono za pomocą IgG chomika, immunoprecypitowano z DMF10.62.3 związanym z sefarozą-białkiem A, i analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE na 14% żelu poliakrylamidowym. W celu określenia masy cząsteczkowej białka wiążącego DMF10.62.3 znakowano komórki E710.2.3 przez 2 godziny metionina ³⁵S. Immunoprecypitaty ze znakowanych komórek analizowano za pomocą SDS-PAGE w warunkach redukujących.

Przeciwciało DMF10.62.3 w warunkach redukujących immunoprecypitowało z białkiem o masie ok. 40 kDa z komórek E710.2.3. Ruchliwość elektroforetyczna tego białka nie zmieniła się w warunkach nieredukujących. Ten prążek nie był widoczny w immunoprecypitatach z normalnym chomiczym IgG, ani w immunoprecypitatach z Y-3, przeciwciałem przeciwko MHC klasy I. Białko o masie 40 kDa zidentyfikowano także w lizatach znakowanych powierzchniowo komórek E710.2.3 i RMA-S. Kilka

PL 204 822 B1 komórkowych cząsteczek powierzchniowych takich jak Thy-1 i Ly-6 A/E jest zakotwiczonych w powierzchni komórki za pomocą glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI). Taki sposób połączenia z powierzchnią komórki jest wrażliwy na traktowanie PI-PLC. W celu sprawdzenia, czy białko rozpoznawane przez DMF10.62.3 jest połączone kotwicą GPI, komórki RMA-S, w których to białko ulega ekspresji, poddano działaniu PI-PLC. Nie wpłynęło to na znakowanie DMF10.62.3, ale zmniejszyło znakowanie Thy-1, cząsteczki połączonej za pomocą GPI, co sugeruje, że białko 40 kDa rozpoznawane przez DMF10.62.3 nie jest zakotwiczone na powierzchni komórki za pomocą GPI.

P r z y k ł a d 7: Wpływ przeciwciała DMF10.62.3 in vivo

Myszy AKR otrzymały dożylny lub wewnątrzotrzewnowy zastrzyk z 5x10⁶ syngenicznych komórek nowotworowych E710.2.3 oraz podano im roztwór soli lub wewnątrzotrzewnowy zastrzyk 0,5 mg przeciwciała kontrolnego lub DMF10.62.3 pierwszego dnia i dziesięć dni później. Przeżywalność zwierząt obserwowano przez 50 dni (Tabela 6).

T a b e l a 6.

traktowanie	przeżywalność	Średni czas śmierci
roztwór soli	0%	35 dni
przeciwciało kontrolne	0%	33 dni
DMF10.62.3	100%	brak śmierci

Oświadczenie depozytowe

American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA otrzymała linię komórkową hybrydomy produkującą przeciwciało monoklonalne DMF10.62.3 dnia 20 lipca 1999 r., a linie komórkowe hybrydomy produkujące przeciwciała monoklonalne DMF10.167.4 i DMF10.34.36 otrzymała dnia 22 lipca 1999 r. Hybrydomy zostały zdeponowane na warunkach zapewniających, że dostęp do nich będzie możliwy w trakcie trwania postępowania w sprawie zgłoszenia patentowego dla uprawnionych do tego, przez Komisarza ds. Patentów i Znaków Towarowych na podstawie 37 CFR 1.14 i 35 USC 122. Depozyty są dostępne, jak to jest wymagane przez zagraniczne prawa patentowe w krajach, gdzie składa się odpowiedniki lub pochodne niniejszego zgłoszenia patentowego. Jednak dostępność depozytu nie jest równoznaczna z licencją na wykonywanie przedmiotu tego wynalazku naruszające prawa patentowe gwarantowane przez postępowanie rządowe.

Dalej, depozyty opisanych tu kultur będą przechowywane i udostępniane publicznie w zgodzie z postanowieniami Budapesztańskiego Traktatu o Przechowywaniu Mikroorganizmów, tzn. będą przechowywane w należyty sposób, żeby utrzymać je przy życiu i nie zanieczyszczone przez okres co najmniej 5 lat po ostatnim żądaniu dostarczenia próbki z depozytu, a przynajmniej przez okres co najmniej 30 lat od daty depozytu lub przez czas trwania jakiegokolwiek patentu, który może spowodować wydanie kultur plus pięć lat po ostatnim żądaniu dostarczenia próbki z depozytu. Deponent uznaje obowiązek zastąpienia depozytu, jeśli magazyn nie będzie w stanie wydać próbki na żądanie ze względu na stan depozytów. Wszystkie ograniczenia publicznej dostępności opisywanych tu depozytów kultur będą nieodwołalnie zniesione po udzieleniu patentu, który je opisuje.

Inne aspekty

Pomimo, iż wynalazek jest opisany w połączeniu ze szczegółowym opisem, należy rozumieć, że powyższy opis ma na celu ilustrację, a nie ograniczenie zakresu tego wynalazku, który jest zdefiniowany przez zakres dodanych zastrzeżeń. Inne aspekty, zalety i modyfikacje znajdują się w zakresie poniższych zastrzeżeń.

Claims (15)

1. Izolowane przeciwciało, znamienne tym, że jest wybrane spośród monoklonalnego przeciwciała produkowanego przez linię komórkową hybrydomy wybraną z grupy obejmującej ATCC nr PTA-377, PTA-405 lub PTA-404, gdzie przeciwciało stanowi odpowiednio DMF10.62.3, DMF10.167.4 lub DMF10.34.36;

chimerycznego przeciwciała zawierającego pochodzące od ludzi części stałe łańcuchów lekkich i ciężkich oraz części zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała wybranego spośród DMF10.62.3, DMF10.167.4 lub DMF10.34.36; i

PL 204 822 B1 humanizowanego przeciwciała posiadającego regiony określające komplementarność (CDR) przeciwciała wybranego spośród DMF10.62.3, DMF10.167.4 lub DMF10.34.36.

2. Izolowane przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest to przeciwciało monoklonalne DMF10.62.3 produkowane przez linię komórkową hybrydomy ATCC nr PTA-377.

3. Izolowane przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest to przeciwciało monoklonalne DMF10.167.4 produkowane przez linię komórkową hybrydomy ATCC nr PTA-405.

4. Izolowane przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest to przeciwciało monoklonalne DMF10.34.36 produkowane przez linię komórkową hybrydomy ATCC nr PTA-404.

5. Izolowane przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera część zmienną przeciwciała DMF10.167.4 oraz część stałą pochodzącą od przeciwciała ludzkiego.

6. Izolowane przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera regiony CDR przeciwciała DMF10.167.4.

7. Izolowane przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera wykrywalny znacznik.

8. Wiążący antygen fragment przeciwciała określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że wybrany jest z grupy obejmującej Fab, F(ab')2 oraz Fv.

9. Linia komórkowa hybrydomy produkująca przeciwciało określone w zastrz. 1.

10. Linia komórkowa hybrydomy według zastrz. 9, znamienna tym, że jest to linia komórkowa ATCC nr PTA-377, PTA-404 lub PTA-405.

11. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca izolowane przeciwciało określone w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

12. Zastosowanie izolowanego przeciwciała określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu wybranego z grupy obejmującej chłoniak grasicy, nowotwór z limfocytów T, chłoniak z limfocytów B, czerniak, kostniakomięsak oraz białaczkę limfoblastyczną z komórkami T, w którym przeciwciało hamuje rozrost komórki nowotworowej.

13. Zestaw diagnostyczny, znamienny tym, że zawiera (i) izolowane przeciwciało określone w zastrz. 1, (ii) koniugat specyficznego związku wiążącego przeciwciało i znacznika do wykrywania związanego przeciwciała, jak również instrukcje jego stosowania.

14. Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że służy do diagnozowania nowotworu wybranego jest z grupy obejmującej chłoniak grasicy, nowotwór z limfocytów T, chłoniak z limfocytów B, czerniak, kostniakomięsak oraz białaczkę limfoblastyczną z komórkami T.

15. Środek ukierunkowany na komórki nowotworowe, znamienny tym, że zawiera izolowane przeciwciało określone w zastrz. 1 połączone z cząsteczką wybraną z grupy obejmującej środki przeciwnowotworowe, cytotoksyny, cytokiny lub grupy reporterowe.