KR20020034164A - 항종양성 항체, 단백질 및 그들의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 종양 세포에서는 발현되나 정상의 성체 조혈 세포에서는 발현되지 않는 40 kDa 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 항체의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
Description
E710.2.3 세포주는 원래 AKR/J 마우스의 흉선 종양으로부터 분리된 것으로 클로닝된 쥐과의 CD4- CD8- 흉선 T 림프구 세포주이다. E710.2.3 세포주는 단독으로 저밀도 배양하는 경우, 포볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 자극되지 않는 한은 자발적으로 증식하지 않는다. E710.2.3은 흉선 세포 또는 비장세포와의 접촉에 의해 증식하도록 자극될 수 있다. 그러나, E710.2.3은 PMA 또는 다른 세포 없이 고밀도로 배양되는 경우에는 자발적으로 증식할 수 있다. E710.2.3은 유전적 동계(syngenic)의 마우스로 주입되는 경우 림프계 기관 및 흉선 내에서 악성 종양으로 성장한다.
본 발명은 항체 및 그들이 특이적으로 결합하는 단백질 및 종양 세포에 특이적으로 결합하는 이러한 항체의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
도 1a - d는 DMF10.62.3에 의해 검출된 E710.2.3(도 1의 a), A20(도 1의 b), Jurkat(도 1의 c) 및 RF33.70(도 1의 d) 상에서의 40 kDa 단백질의 발현을 나타내는 4개의 유동 세포계측 그래프(flow cytometric graph).
도 2a - d는 DMF10.62.3에 의해 검출된 14일된 태아 흉선(도 2의 a), 전체 성체 비장(도 2의 b), 전체 성체 흉선(도 2의 c) 및 전체 성체 골수(도 2의 d) 상에서의 40 kDa 단백질의 발현을 나타내는 4개의 유동 세포계측 그래프.
도 3a - g는 DMF10.62.3에 의해 검출된 자극하지 않은 새로 수확된 T 및 B 세포(도 3의 a), 24시간 활성화된 T 세포(도 3의 b), 48시간 활성화된 T 세포(도 3의 c), 72시간 활성화된 T 세포(도 3의 d), 24시간 활성화된 비장 B 세포(도 3 의e), 48시간 활성화된 비장 B 세포(도 3f) 및 72시간 활성화된 비장 B 세포(도 3g) 상에서의 40 kDa 단백질의 발현을 나타내는 7개의 유동 세포계측 그래프.
도 4a - c는 단일 클론 항체 DMF10.62.3에 의한 E710.2.3 세포(도 4의 a), RMA-S 세포(도 4의 b) 또는 RF33.70 세포(도 4의 c)의 자발 증식의 억제를 나타내는 3개의 유동 세포계측 그래프.
도 5a - i는 1 ㎕/㎖의 DMF10.62.3으로 1시간 처리(도 5의 a), 1 ㎕/㎖의 DMF10.62.3으로 2시간 처리(도 5의 b), 1 ㎕/㎖의 DMF10.62.3으로 3시간 처리(도 5의 c), 햄스터 IgG로 3시간 처리(도 5의 d), 15 ㎕/㎖의 DMF10.62.3으로 1시간 처리(도 5의 e), 15 ㎕/㎖의 DMF10.62.3으로 2시간 처리(도 5의 f), 15 ㎕/㎖의 DMF10.62.3으로 3시간 처리(도 5의 g), 햄스터 IgG로 3시간 처리(도 5의 h) 및 항체 비처리(도 5의 i)된 E710.2.3 세포 내에서의 고사 유발을 나타내는 9개의 유동 세포계측 그래프.
본 발명은 다양한 유형의 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 40 kDa 단백질에 특이적으로 결합하나 정상의 성체 조혈 세포에는 결합하지 않는 단일 클론 항체의 발견을 기초로 한다. 새로운 단일 클론 항체는 증식을 차단하고 종양 세포의고사를 유도한다.
이러한 발견을 기초로 하여 본 발명은 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 특징으로 하며, 상기 단일 클론 항체는 (a) 태아 흉선 세포에 결합하고, (b) 세포 결합 시 그 세포의 세포 증식을 억제하며, (c) 성체 흉선 세포에는 결합하지 않는다. 단일 클론 항체는 또한 세포 결합 시 동형 응집을 유발할 수 있으며, 그들이 결합한 세포 내에서 고사를 유도하고, E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK 101 A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 및 Cos 군에서 하나 이상의 종양 세포주에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체는 예를 들면, 검출 가능한 라벨로 표지될 수 있다.
하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377에 의해 생산되는 단일 클론 항체 DMF10.62.3, 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-405에 의해 생산되는 단일 클론 항체 DMF10.167.4 및 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-404에 의해 생산되는 단일 클론 항체 DMF10.34.36도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-405 또는 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-404에 의해 생산되는 단일 클론 항체에 의해 결합된 단백질과 동일한 단백질에 결합하는 단일 클론 항체를 특징으로 한다. 상기 단일 클론 항체는 인체에 적용시킬 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-405 또는 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-404에 의해 생산되는 단일 클론 항체에 의해 결합된 40 kDa 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-405 및 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-404에 의해 생산되는 단일 클론 항체에 의해 결합된 단백질과 동일한 단백질에 결합하는 키메라 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 특징으로 하며, 이때 상기 키메라 항원은 경쇄 및 중쇄의 비인간 가변 부위 및 인간 불변 부위를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-405 및 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-404에 의해 생산되는 단일 클론 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 (i) 40 kDa의 분자량; (ⅱ) 태아 흉선 세포의 표면 상에서 발현; (ⅲ) 성체 흉선 세포의 표면 상에서 비발현; (ⅳ) 항체 결합 시 세포 증식을 차단하는 능력; 및 (ⅴ) 항체 결합 시 동형 응집 유발하는 능력으로 특정화되는 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 단일 클론 항체는 또한 (ⅵ) 항체 결합 시 세포 내에서 고사를 유발하는 능력 및 (ⅶ) E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101 A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 및 Cos로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 종양 세포주의 표면 상에서 발현되는 것을 특징으로 하는 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 단일 클론 항체의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 상기 항원-결합 단편은 예를 들면 검출 가능한 라벨로 표지될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 특징으로 한다. 예를 들면, 본 발명은 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-405 및 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-404를 특징으로 한다.
본 발명은 또한 (i) 40 kDa의 분자량; (ⅱ) 태아 흉선 세포의 표면 상에서 발현; (ⅲ) 성체 흉선 세포의 표면 상에서 비발현; (ⅳ) 항체 결합 시 세포 증식을 차단하는 능력; 및 (ⅴ) 항체 결합 시 동형 응집을 유발하는 능력으로 특정화되는 실질적으로 순수한 단백질을 특징으로 한다. 상기 단백질은 추가로 (ⅵ) E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101 A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 및 Cos로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 종양 세포주에서 발현; 및 (ⅶ) 본 명세서에 기재된 항체의 결합 시 세포 내에서 고사를 유발하는 능력에 의해 특정화된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-405 및 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-404에 의해 생산되는 단일 클론 항체에 결합하는 실질적으로 순수한 단백질을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 단일 클론 항체 및 약리학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제 조성물을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 대상 내에서 종양 세포를 검출하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 대상으로부터 채취한 세포 샘플과 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단일 클론 항체를 접촉시키는 단계 및 상기 항체와 상기 샘플의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 결합은 대상 내에 종양 세포가 존재함을 암시한다. 종양 세포의 예로는 흉선 림프종, T-세포 종양, B-세포 림프종, 흑색종, 골수육종 및 급성 T-세포 백혈병이 포함된다. 종양 세포는 환자 내에 존재할 수도 있다. 종양 검출에 사용되는 단일 클론 항체는 표지될 수 있다.
본 발명은 또한 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 종양 세포의 증식을 억제하기에 충분한 다량의 상기에 기재된 단일 클론 항체와 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 세포 내에서 고사를 유도하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 세포 내에서 고사를 유도하기에 충분한 다량의 상기에 기재된 하나 이상의 단일 클론 항체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포는 흉선 림프종, T-세포 종양, B-세포 림프종, 흑색종, 골수육종 및 급성 T-세포 백혈병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양 세포일 수 있다. 상기 세포는 생체내 또는 시험관내의 것일 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단일 클론 항체 및 사용 지침을 포함하는 종양 진단용 키트를 포함한다. 상기 키트는 흉선 림프종, T-세포 종양, B-세포 림프종, 흑색종, 골수육종 및 급성 T-세포 백혈병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양 세포를 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 종양 세포에 모이어티를 전달하기 위하여 모이어티에 접합될 수 있는, 상기에 기재된 하나 이상의 단일 클론 항체를 포함하는 종양 세포 표적화제(targeting agent)를 포함한다. 모이어티의 예로는 항종양제, 세포독소. 사이토카인 또는 리포터기(reporter group)가 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 포유류 내에서 종양 세포에 모이어티를 선택적으로 전달하는 방법이다. 상기 방법은 모이어티에 결합된 본 명세서에 기재된 표적화제를 포유류에 투여하는 단계 및 표적화제가 종양 세포에 도달하기에 충분한 시간을 할애하는 단계를 포함하며, 여기서 표적화제 내의 항체는 종양 세포에 결합하여 포유류 내의 종양 세포에 모이어티를 선택적으로 전달한다. 모이어티의 예로는 항종양제, 세포독소, 사이토카인 및 리포터기가 포함된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 40 kDa의 단백질을 분리하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 단일 클론 항체/단백질 복합체를 형성하기에 충분한 시간 및 조건 하에서, 본 명세서에 기재된 단일 클론 항체와 단백질 함유 샘플을 접촉시키는 단계; 만약 있다면 상기 샘플로부터 상기 복합체를 하나 이상 제거하는 단계; 및 상기 복합체로부터 상기 단백질을 제거하여 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
"분리된 핵산 서열"은 자연 발생 유기체의 게놈 내의 핵산 서열에 접하는 유전자가 실질적으로 존재하지 않는 핵산 서열을 의미한다. 따라서, 이 용어는 벡터, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원생동물 및 진핵동물의 게놈 핵산 서열로 혼입된 재조합 핵산 서열을 포함한다. 이것은 또한 cDNA, 게놈 단편, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성된 단편 또는 제한 단편과 같은 개별적인 분자도 포함한다.
단백질에 "특이적으로 결합하는" 항체는 단백질에는 결합하나, 예를 들면 40 kDa 단백질과 같은 단백질을 자연적으로 포함하는 생물학적 샘플과 같은 샘플 내에서 다른 분자를 인식하거나 다른 분자에 결합하지 않는 것이다.
"보존적" 아미노산 치환이란 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 또 다른 아미노산 잔기로 교체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 부류는 당 기술 분야에 규정되어 있다. 이러한 부류로는 염기성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가지는 아미노산들이 있다. 한 아미노산 부류에 속하는 임의의 한 아미노산은 보존적 치환에서 그 부류의 다른 일원을 대체하는 데 사용될 수 있다. "폴리펩타이드, 펩타이드 및 단백질"이란 용어는 상호 교환적으로 아미노산 잔기의 사슬을 일컫는 데 사용된다.
항체의 "항원-결합 단편"은 완전 항체에 의해 결합된 항원 상의 에피토프, 예를 들면 40 kDa 단백질에 결합할 수 있는 항체의 부분이다.
"에피토프"는 항원의 특정 부위, 예를 들면 항체가 결합하고 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질이다.
"실질적으로 순수한" 40 kDa 단백질은 자연적으로 회합되는 단백질 및 자연-발생 유기 분자로부터 유리된 적어도 60 중량%의 40 kDa 단백질이다. 바람직하게는, 제제는 적어도 75 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 중량%, 가장 바람직하게는 적어도 99 중량%의 40 kDa 단백질이다. 실질적으로 순수한 40 kDa 단백질은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 항체 또는 단일 클론 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피 및/또는 물리적 정제에 의해 얻어질 수 있다.
"분리된" 항체는 자연적으로 회합되는 다른 자연-발생 유기 분자로부터 실질적으로 유리된 항체이다.
세포 증식을 차단하는 항체 또는 기타 분자는 세포 주기, 분리, 또는 이둘 모두를 억제하는 항체 또는 분자이다.
"동형 응집"이란 동일한 유형의 세포가 자극되어 서로에게 부착되는 생물학적 활성 과정을 의미한다.
"리포터 기"는 용이하게 검출될 수 있고 적합한 검출기 시스템 또는 방법에 의해 검출될 수 있는 발광, 형광, 효소 활성, 전자 밀도 또는 방사능과 같은 물리적 또는 화학적 특성을 가지는 분자 또는 화합물이다.
달리 규정하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술용어 및 과학용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자들이 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명을 실시 또는 테스트하는 데 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질은이하에 제시된다. 본 명세서에 기재된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌의 내용은 그 전문이 참고로 인용된다. 모순이 있을 경우, 정의를 포함하는 본 명세서는 통제될 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명은 종양 세포 상에서 발현되는 40 kDa 단백질을 인식하는 항체를 특징으로 한다. 상기 항체는 종양 세포의 증식을 억제하고 그들이 특이적으로 결합하는 종양 세포의 고사를 유도하는 데 사용될 수 있다. 단일 클론 항체는 진단 목적(예를 들면, 악성 세포의 존재를 판단하기 위하여)으로 사용되거나, 단독으로 또는 부착된 항종양성 제제의 전달을 통해 종양 세포를 치료하기 위하여 치료 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 그 밖의 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 청구범위를 통해 보다 명확해질 것이다.
본 발명은 40 kDa 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들면 단일 클론 항체를 특징으로 한다. 이 40 kDa 단백질은 흉선 림프종, T-세포 종양, B-세포 림프종, 흑색종, 골수육종 및 급성 T-세포 백혈병을 포함하는 다양한 유형의 종양 세포, 및 인간, 원숭이 및 마우스를 포함하는 다양한 상이한 종에서 발현되는 새로운 세포 표면 단백질이다. 항체는 정상의 성체 조혈 세포에 대해서는 반응성을 나타내지 않는다. 본 발명에 따르는 항체가 40 kDa 단백질을 발현시키는 세포에 결합되는 경우, 세포는 증식을 중단하고 고사가 진행된다. 40 kDa 단백질은 단일 클론 항체가 세포 상의 이 단백질에 결합하는 경우 세포가 고사된다는 관찰을 근거로 하는 새로운 사망 유도 단백질이다.
40 kDa 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 생산하는 3개의 하이브리도마 세포주가 수탁번호 PTA-377(DMF10.62.3), 수탁번호 PTA-405 (DMF10.167.4) 및 수탁번호 PTA-404(DMF10.34.36) 하에 ATCC에 기탁되었다.
본 명세서에 기재된 항체는 다양한 용도를 갖는다. 이들 항체는 포유류, 예를 들면 인간, 조직 내에서 악성 세포의 존재를 검출하는 시험관내 진단 분석에 사용될 수 있다. 항체는 또한 리포터기로 표지된 본 명세서에 기재된 분리된 항체를 대상에 투여함으로써 생체내에서 종양의 위치를 제한하는 데 사용될 수 있다. 항체는 치료 용도도 갖는다. 또한, 항체는 종양을 치료하거나 항종양성 제제를 전달하는 데 사용될 수 있다.
항체 제조방법
항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부위이다. 면역글로불린 분자의 단편의 예에는 40 kDa 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 단편, 예를 들면 F(ab) 및 F(ab')2부위가 포함된다. 단편들은 펩신과 같은 효소로 항체를 처리함으로써 제조할 수 있다. 단일 클론 항체 또는 단일 클론 항체 조성물이란 용어는 폴리펩타이드 또는 단백질의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 단지 한 종류의 항원 결합 자리만을 함유하는 항체 분자의 군을 의미한다.따라서, 단일 클론 항체 조성물은 통상적으로 그것이 특이적으로 결합하는 단백질에 대해 단일 결합 친화성을 나타낸다.
면역화
40 kDA 단백질에 대항하는 다중 클론 및 단일 클론 항체는 적합한 대상(예를 들면, 토끼, 염소, 마우스 또는 그 밖의 포유류)을 적합한 면역원을 함유하는 면역원 제제를 이용해 면역화함으로써 유도될 수 있다. 면연원은 새로운 40 kDa 단백질을 발현시키는 것으로 밝혀진 면역화된 세포주 E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK 101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 또는 Cos 유래의 세포들과 같은 세포를 포함한다. 대안적으로, 면역원은 정제 또는 분리된 40 kDa 단백질 자체일 수 있다. 예를 들면, ATCC No. PTA-377, PTA-405 또는 PTA-404로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단일 클론 항체는 상기 단백질을 생산하는 세포, 예를 들면 E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK 101 A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 또는 Cos로부터 친화성 크로마토그래피, 면역침전법 또는 당 기술 분야에 공지된 그 밖의 방법을 이용하여 상기 단백질을 분리하는 데 사용될 수 있다.
이어서, 대상 내에서 유발된 항체들을 이들 항체가 성체 흉선 세포에는 결합하지 않으면서 태아 흉선 세포에는 결합하는 지를 확인하기 위하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 항체는 본 명세서에 기재된 분석에서 추가로 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, 이들이 그들이 결합하는 세포의 세포 증식을 억제하는 지; 세포의 동형 응집을 유도하는 지; 그들이 결합하는 세포 내에서 세포 고사를 유도하는 지를 확인하기 위하여 이들 항체를 분석할 수 있다. 본 명세서에는 원하는 특성을 가지는 항체를 동정하는 적합한 방법이 기재되어 있다. 예를 들면, 세포 결합 시 세포 사망을 초래하는 항체의 능력은 R&D사(Minneapolis, MN) 또는 Pharmingen사(San Diego, CA)에 의해 시판되는 키트를 사용해 분석할 수 있다.
면역원(예를 들면, 정제 단백질, 종양 세포 발현 단백질 또는 재조합적으로 발현된 40 kDa 단백질)의 단위 용량 및 면역화 요법(regimen)은 면역화하고자 하는 대상, 그것의 면역 상태 및 대상의 체중에 따라 결정될 것이다. 대상 내에서 면역 반응을 향상시키기 위하여, 면역원은 Freund 완전 또는 불완전 아주번트와 같은 아주번트와 함께 투여될 수 있다. 상기에 기재된 바와 같은 면역원을 이용한 대상의 면역화는 다중 클론 항체 반응을 유도한다. 면역화 대상에서 항체 역가는 면역화 항원, 예를 들면 본 명세서에 기재된 40 kDa 단백질을 사용하여 ELISA와 같은 표준방법에 의해 시간에 따라 관찰할 수 있다.
40 kDA 단백질에 대항하는 항체를 유도하는 다른 방법은 면역글로불린 유전자를 발현시키는 형질전환 마우스를 이용하는 것을 포함한다(예를 들면, Wool 등의 PCT 출원공보 제WO 91/00906호; Kucherlapati 등의 PCT 출원공보 제WO 91/10741호; 또는 Lonberg 등의 PCT 출원공보 제WO92/03918호 참조). 대안적으로, 인간 단일 클론 항체는 인간 항체-생산 세포 또는 조직(예를 들면, 인간 골수 세포, 모세혈관 림프구(PBL), 인간 태아 림프절 조직, 또는 조혈 간세포)과 접목된 면역결핍 마우스에 항원을 주입하여 생산할 수 있다. 이러한 방법들은 SCID-hu 마우스(Duchosal 등의 PCT 출원공보 제WO 93/05796호; 미국특허 제5,411,749호; 또는 McCune 등의Science 241: 1632-1639(1988) 참조) 또는 Rag-1/Rag-2 결핍 마우스 내에서 항체를 유도하는 것을 포함한다. 인간 항체-면역결핍 마우스도 시판되고 있다. 예를 들면, Rag-2 결핍 마우스는 Taconic Farms사(Germantown, NY)로부터 시판되고 있다.
하이브리도마
단일 클론 항체는 면역원을 이용해 대상을 면역화하여 생산할 수 있다. 면역화 후 적당한 시간, 예를 들면 항체 역가가 충분히 높은 수준일 때, 표준 방법을 이용하여 항체 생산 세포를 면역화 동물로부터 수확하고 단일 클론 항체를 제조할 수 있다. 예를 들며, 항체 생산 세포는 표준 체세포 융합법에 의해 골수종 세포와 같은 영구 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 얻을 수 있다. 이러한 방법은 당 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 Kohler 및 Milstein에 의해 개발된 하이브리도마 기법(1975,Nature, 256: 495-497), 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbar 외, (1983)Immunology Today, 4: 72) 및 인간 단일 클론 항체를 제조하는 EBV-하이브리도마 기법(Cole 외, (1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)을 포함한다. 단일 클론 항체 하이브리도마를 제조하는 기술은 공지되어 있다.
단일 클론 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자를 발현시키고 40 kDA 단백질로 면역화된 형질전환 마우스 유래의 항체 생산 세포, 예를 들면 비장세포를 수확하여 제조할 수도 있다. 비장세포는 인간 골수종과의 융합 또는 Epstein-Barr 바이러스(EBV)에 의한 형질전환을 통해 면역화될 수 있다. 이들 하이브리도마는 종래에 제시된 B-세포 또는 EBV-하이브리도마 기법(예를 들면, Boyle 등의 유럽 특허 공보 제0,614,984호 참조)을 이용하여 제조할 수 있다.
40 kDa 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 예를 들면, 부동화된 40 kDa 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하는 스크리닝 또는 항체가 원하는 특성, 예를 들면 세포 증식을 억제하는 능력을 가지는 지를 결정하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 테스트를 통해 하이브리도마 배양주 상청액을 스크리닝하여 검출한다. 본 명세서에 기재된 스크리닝 분석에서 양성으로 테스트되는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 하이브리도마 세포가 단일 클론 항체를 배지로 분비하여 완전한 항체를 생산하도록 하기에 충분한 시간 및 조건 하의 영양 배지에서 배양될 수 있다. 하이브리도마 세포에 적합한 조직배양 방법 및 배지는 일반적으로 당 기술분야에 공지되어 있다(예를 들면, R. H. Kenneth,Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York(1980)). 그런 다음, 항체를 함유하는 조건화 하이브리도마 배양주 상청액을 수집할 수 있다.
재조합 조합성 항체 라이브러리
단일 클론 항체는 재조합 조합성 면역글로불린 라이브러리를 제작하고 40 kDa 단백질로 상기 라이브러리를 스크리닝함으로써 조작할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제작 및 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로 시판되고 있다(예를 들면, the PharmaciaRecombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 the StratageneSurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 간단히 설명하면, 40 kDa 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 파지를동정 및 분리하기 위해 항체 라이브러리를 스크리닝한다. 바람직한 구현예에서, 라이브러리의 1차 스크리닝에는 부동화된 40 kDa 단백질을 이용해 스크리닝하는 단계가 수반된다.
스크리닝 후, 디스플레이 파지를 분리하고, 선별된 항체를 코딩하는 핵산을 상기 디스플레이 파지(예를 들면, 파지 게놈)로부터 회수하여 공지된 재조합 DNA 방법을 이용해 다른 발현 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 핵산은 숙주 세포 내에서 재조작(예를 들면, 부가의 불변 부위와 같은 부가의 면역글로불린 도메인을 코딩하는 핵산에 결합) 및/또는 발현될 수 있다.
키메라 및 인간화 항체
키메라 및 인간화 항체와 같은 재조합 형태의 항체는 항체에 대한 인간 환자의 반응을 최소화하도록 제조될 수 있다. 비인간 대상 내에서 생성되거나 비인간 항체 유전자의 발현으로부터 유래된 항체가 치료 목적으로 인간에게 사용되는 경우, 이들 항체는 외래 물질로서 가변적인 정도로 인식되고, 환자 내에서 면역 반응이 발생될 수 있다. 이러한 면역 반응을 최소화 또는 제거하는 한 가지 방법이 키메라 항체 유도체, 즉 비인간 동물의 가변 부위 및 인간의 불변 부위를 조합한 항체 분자를 제조하는 것이다. 이러한 항체는 원래의 단일 클론 항체의 에피토프 결합 특이성을 보유하나, 인간에게 투여되는 경우 면역원성이 다소 떨어질 수 있어 환자에게 내성이기 쉽다.
키메라 단일 클론 항체는 당 기술 분야에 공지된 DNA 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 비인간 항체 분자의 불변 부위를 코딩하는 유전자를 인간의 불변 부위를 코딩하는 유전자로 치환한다(Robinson 등의 PCT 특허 공보 PCT/US86/02269; Akira 등의 유럽 특허 출원 제184,187호; 또는 Taniguchi M.의 유럽 특허 출원 제171,496호 참조). 키메라 항체는 또한 항원 결합에 관련되지 않은 가변 부위 부분을 인간의 가변 부위 유래의 등가의 부분으로 대체함으로써 "인간화"될 수 있다. "인간화된" 키메라 항체의 총괄적인 검토는 Morrison, S.L.에 의해 (1985)Science, 229: 1202-1207 및 Oi 등에 의해 (1986)BioTechniques, 4: 214에 제시되었다. 이러한 방법은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄로부터 면역글로불린 가변 부위 모두 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 분리, 조작 및 발현시키는 단계를 포함한다. 이어서, 인간화 키메라 항체 또는 이들의 단편을 코딩하는 cDNA를 적합한 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 대안적으로, 적합한 "인간화" 항체는 상보적 결정 부위(CDR) 치환법을 통해 제조할 수도 있다(미국 특허 제5,225,539호; Jones 등의 (1986)Nature 321: 552-525; Verhoeyan 등의 (1988)Science 239: 1534; 및 Beidler 등의 (1988)J. Immunol. 141: 4053-4060 참조).
에피토프 날인(imprinting)도 ATCC No. PTA-377, ATCC No. PTA-405 또는 ATCC No. PTA-404으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 40 kDa 단백질에 대해 특이적인 햄스터 항체의 결합 특이성을 보유하는 "인간" 항체 폴리펩타이드 다이머를 제조하는 데 사용될 수 있다. 간단히 설명하면, 항원에 특이적으로 결합하는 비인간 가변 부위(VH) 및 인간 불변 부위(CHI)를 코딩하는 유전자를E. coli내에서 발현시키고 인간 VλCλ 유전자의 파지 라이브러리로 감염시킨다. 이어서, 항체 단편을 나타내는 파지를 40 kDa 단백질의 결합에 대하여 스크리닝한다. 선별된인간 Vλ 유전자를 VλCλ 사슬의 발현을 위해 재클로닝하고 이들 사슬을 함유하는E. coli에 인간 VHCH1 유전자의 파지 라이브러리로 감염시키고, 그 라이브러리를 항원으로 코팅된 시험관을 이용하여 스크리닝한다. Hoogenboom 등의 PCT 출원공보 제WO 93/06213호 참조.
항체 단편
본 발명은 새로운 항종양성 항체 및 Fab, F(ab')2 및 Fv 단편과 같은 항체의 활성 결합 부위를 함유하는 그들의 임의의 단편을 포함한다. 이러한 단편은 종래에 확립된 방법(예를 들면, Rousseaux 등의 Methods Enzymol., 121: 663-69, Academic Press, (1986) 참조)을 이용하여 항체로부터 제조할 수 있다. 예를 들면, F(ab')2단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 제조할 수 있고, Fab 단편은 F(ab')2단편의 이황화 결합을 환원시킴으로써 제조할 수 있다.
항체의 활용
본 명세서에 기재된 항체들은 다양한 용도를 갖는다. 이들 항체는 인간 조직 내의 악성 세포의 존재를 결정하기 위한 진단 목적으로 시험관내 사용될 수 있다. 상기 방법에는 40 kDa 단백질의 존재에 대해 조직 샘플을 조사하는 단계가 수반된다. 예를 들면, 조직 샘플을 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, ATCC No. PTA-405 또는 ATCC No. PTA-404에 의해 생산되는 단일 클론 항체와 접촉시키고, 상기 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 능력을 측정한다. 결합은 종양 세포의 존재를 암시한다. 대안적으로, 이들 항체는 방출된 항원에 대해 혈액 샘플을스크리닝하는 데에도 사용할 수 있다.
이들 항체는 또한 검출 가능한 신호를 제공하는 리포터기로 표지된 본 발명의 분리된 항체를 대상에 투여하여 생체내에서 종양의 위치를 제한하는 데 사용할 수도 있다. 이어서, 결합된 항체는 외부 신티그래피(scintigraphy), 방사 단층촬영 또는 방사핵 스캐닝을 이용하여 검출한다. 상기 방법은 질병의 정도와 관련하여 환자의 암의 단계를 구분하고 치료에 대한 반응에 있어서의 변화를 관찰하는 데 사용될 수 있다.
항체는 또한 치료 용도를 갖는다. 새로운 항체는 종양 세포와의 특이적인 결합이 세포의 증식을 중지시키고 사망을 유도하기 때문에 종양 치료에 사용될 수 있다.
항체는 또한 예를 들면 항종양성 제제를 종양으로 전달하는 표적화제와 같은 치료제로서 사용될 수도 있다. 이러한 항종양성 제제는 화학치료용 약물, 독소, 면역학적 반응 조절제, 효소 및 방사성 동위원소를 포함한다.
검출 가능한 라벨
40 kDa 단백질과 반응하는 항체는 예를 들면 대상 내에서 종양의 존재를 검출하기 위하여 진단 목적으로 사용될 수 있다. 항체를 검출 가능한 라벨에 결합시키면 검출을 용이하게 수행할 수 있다. 검출 가능한 라벨의 예로는 다양한 효소, 보결단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, 전자 밀집 라벨, MRI용 라벨 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예로는 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 금속 인산염, β-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스테라아제가포함되며; 적합한 보결단의 예로는 스트렙트아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 포함되며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되며; 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되고; 생발광 물질의 예로는 루시페라아세, 루시페린 및 에쿼린이 포함되며; 적합한 방사성 물질의 예로는125I,131I,35S 또는3H가 포함된다.
표적화제로서의 항체
본 명세서에 기재된 항체 및 항체 단편은 모이어티에 접합될 수 있으며, 이 항체는 40 kDa 단백질을 발현하는 종양 세포의 자리에 상기 모이어티를 안내하는 데 사용될 수 있다. 모이어티의 예로는 종양 세포를 죽이는 데 사용될 수 있는 독소, 방사성 핵종 또는 화학치료제 또는 40 kDa 단백질을 발현하는 종양의 위치 및 크기를 알아내는 데 사용될 수 있는 영상화제(imaging agent)가 포함된다. 모이어티를 인간 내의 종양으로 안내하는 데 사용되는 항체는 단일 클론 항체, 예를 들면 인간화 단일 클론 항체가 바람직하다.
항체는 혼성 단백질 분자를 코딩하는 융합된 유전자에 의해 코딩되는 모이어티 및 항체, 또는 개별적으로 생성된 항체 및 모이어티를 결합시키는 데 사용되는 비아미드 결합과 같은 비펩타이드 공유결합과 같은 접합 수단을 통해 예를 들면 독소와 같은 모이어티에 융합시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체는 면역 세포에 대해 특이적이고 종양을 죽이는 면역 세포를 자극하는 또 다른 항체에 융합될 수도있다.
독소
유용한 독소 분자는 세포 내에 존재하는 경우 상당한 세포독성을 나타내는 펩타이드 독소를 포함한다. 독소의 예로는 세포독소, 효소 활성을 교란시켜서 종양 세포를 죽이는 대사 교란제(억제제 또는 활성화제) 및 작동인자 부위의 한정된 반경 내의 모든 세포를 죽이는 방사성 분자가 포함된다. 대사 교란제는 예를 들면 세포의 대사과정을 변화시켜 그들의 기능을 일변시키는 효소 또는 세포독소와 같은 분자이다. 광의적으로, 독소라는 용어는 종양 세포의 사망을 초래하는 임의의 모든 작동인자를 내포한다.
많은 펩타이드 독소는 전신성(generalized) 진핵생물 수용체 결합 도메인을 가지며, 이런 경우에는 반드시 표적화된 단백질을 함유하지 않는 세포는 죽이지 않도록(예를 들면, 40 kDa 단백질은 함유하지 않으나 변형된 독소에 대한 수용체는 함유하는 세포를 죽이지 않도록) 독소를 변형시켜야 한다. 이러한 변형은 분자의 세포독성 기능을 보존하는 방식으로 이루어져야 한다. 잠재적으로 유용한 독소는 비제한적으로 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 리신(ricin), 0-Shiga 유사 독소(SLT-I, SLT-Ⅱ, SLT-ⅡV), LT 독소, C3 독소, Shiga 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소,Pseudomonas외독소, 알로린, 사포닌, 모데신 및 겔라닌을 포함한다. 그 밖의 독소로는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 리포톡신(LT)이 있다. 항종양 활성을 가지는 또 다른 독소로는 종양에 대항하는 상당한 효능을 가지는 항종양성 항생물질을 함유하는 다인-엔(diyne-ene)인 칼리케아미신 감마 1이 있다(Zein, N. 등의Science, 240: 1198-201(1988)).
일례로서, 디프테리아 독소를 본 명세서에 기재된 항체에 접합할 수 있다. 그 서열이 알려진 디프테리아 독소는 본 명세서에 참고로 인용된 Murhpy의 미국특허 제4,675,382호에 상세히 설명되어 있다.Corynebaterium dipnteriae에 의해 분비되는 천연 디프테리아 독소 분자는 전좌 도메인 및 전신성 세포 결합 도메인(아미노산 잔기 475번에서 535번)을 포함하는 효소-활성 단편 A(아미노산 Gly1-Arg193) 및 단편 B(아미노산 Ser194-Ser535)로서 분자의 아미노산 말단에서 시작하는 특정화된 여러 개의 기능성 도메인으로 이루어진다.
독소와 항체 결합
항체 및 독소 모이어티는 임의의 여러 방식으로 결합될 수 있다. 화합물이 융합된 유전자의 발현에 의해 생성되는 경우에는 펩타이드 결합이 세포독소와 항체간의 결합고리로서 제공된다. 대안적으로, 독소 및 항체를 개별적으로 제조한 후, 비펩타이드성 공유결합을 통해 결합시킬 수도 있다. 예를 들면, 공유결합은 이황화 결합의 형태를 취할 수 있다. 이 경우, 통상적인 방법을 통해 이 항체를 코딩하는 DNA가 여분의 시스테인 코돈을 함유하도록 조작할 수 있다.
이황화 결합의 경우, 독소 분자가 변형된 항체의 시스테인에 대해 반응성인 황화수소기를 가지도록 유도할 수도 있다. 펩타이드 독소의 경우, 이러한 결합은 시스테인 코돈을 독소를 코딩하는 DNA 서열로 삽입함으로써 달성할 수 있다. 대안적으로, 황화수소기는 단독으로 또는 시스테인 잔기의 일부로서 고체상 폴리펩타이드 기술을 이용하여 도입할 있다. 예를 들면, 황화수소기를 펩타이드로 도입하는 것은 Hiskey에 의해Peptides, 3: 137(1981)에 제시되어 있다.
Bacha 등의 미국특허 제4,468,382호에 제시된 펩타이드 호르몬의 유도 방법에 따라 유도를 수행할 수도 있다. 황화수소기의 단백질로의 도입은 Maasen 등의Eur. J. Biochem., 134: 32(1983)에 제시되어 있다. 요구되는 황화수소기가 존재하면, 세포독소 및 항체를 정제하고 두 황화기를 환원시킨 뒤, 세포독소 및 항체를 (약 1:5 내지 1:20의 비율로) 혼합하여, 실온에서 이황화 결합을 형성시켜 완성한다(일반적으로 20 내지 30분). 이어서, 혼합물을 인산염 완충 염수에 대해 투석하여 미반응 항체 및 독소 분자를 제거한다. Sephadex(R)크로마토그래피 또는 이와 유사한 방법을 이용하여 크기를 기준으로 원하는 독소-항체 접합체 화합물을 독소-독소 및 항체-항체 접합체로부터 분리한다.
면역 반응 조절인자
항종양 모이어티는 국부적인 수준으로 신체의 면역계를 활성화 또는 억제하는 면역계의 조절인자일 수도 있다. 예를 들면, 종양으로 전달되는 사이토카인, 예를 들면 IL-2와 같은 림포카인은 종양 부근에서 세포독성 T-림프구 또는 천연 킬러 세포의 증식을 초래한다.
방사성 분자
모이어티 또는 리포터기는 예를 들면, 소위 "붕소 중성자 포획 요법"(BNCT)에서 저에너지 중성자 빔에 노출된 경우 붕소와 같이, 특정 조건 하에서 방사성이 되는 방사성 뉴클레오타이드(radionucleotide)과 같은 방사성 분자 또는 전구체 분자와 같은 소위 증감제(sensitizer)일 수도 있다. Barth 등의Scientific American, 1990년 10월: 100-107(1990) 참조. 이러한 방사성 작동인자 부위를 가지는 화합물은 종양 세포의 증식 억제 및 영상화 목적으로 종양 세포를 표지하는 데 사용될 수 있다.
방사성 핵종들은 α, β 또는 γ 입자 중 하나를 방출할 수 있는 단원자 방사성 분자들이다. 알파 입자 방사체는 단거리 상에서 훨씬 높은 에너지 방사를 방출하기 때문에 β 또는 γ 입자 방사체보다 바람직하고, 따라서 정상 조직에 대해 유의한 투과 및 유해를 일으키지 않아 효과적이다. 방사성 핵종을 방사하는 적합한 α입자는211At,212Pb 및212Bi를 포함한다.
방사성 분자는 직접적으로 또는 이작용성 킬레이트를 통해 항체에 단단히 결합되어야 한다. 이 킬레이트는 방사성 분사의 생체내 용리 및 이로 인한 조기 방출을 초래하지 않아야 한다. Waldmann,Science,252:1657-62(1991) 참조.
BNCT를 본 발명에 적용하기 위하여, 붕소의 적합한 동위원소, 예를 들면 붕소 10을 화합물의 항종양 모이어티 또는 작동인자 부위로서 선택한다. 붕소는 종양 세포로 전달되고, 종양 세포 내에서 종양 세포와 항체의 특이적 결합에 의해 농축된다. 충분한 양의 붕소가 축적될 수 있을 정도의 시간 후에, 종양을 영상화하고 약 0.025 eV의 에너지를 가지는 저에너지 중성자 빔을 조사한다. 중성자를 조사하는 동안, 그 자체에 의해서는 종양을 둘러싼 건강한 조직 또는 종양 자체에는 거의 손상이 일어나지 않으며, (예를 들면, 종양 세포 표면 상의) 붕소 10은 중성자를 포획함으로써 불안정한 동워원소인 붕소 11을 형성한다. 붕소 11은 즉시 붕괴되어 리튬 7의 핵 및 활성의 α 입자, 약 2.79x106Ev를 생성한다. 이처럼 더 큰 원자량을 가지는 입자는 단지 약 1개의 세포 직경(10 미크론)의 경로 길이를 가지기 때문에 매우 치명적이나, 매우 국부적인 방사선이 형성된다.
종양 세포를 파괴하기 위해서는, α 입자에 의해 생성된 방사선이 중성자 및 수소와의 중성자 포획 반응에 의해 생성된 바탕 방사선을 초과하도록 하기 위하여 평방 센티미터당 1012내지 1013개 중성자의 열중성자의 흐름과 함께 약 10억개의 붕소 원자가 요구되는 것으로 추정되었다.
영상 모이어티
본 명세서에 기재된 항체들은 40 kDa 단백질과 특이적으로 결합하므로, 인간의 종양을 검출하는 데도 유용하다. 한가지 방법은 적합한 모이어티 또는 리포터기, 예를 들면 검출 가능한 신호를 생성하는 영상 반응제로 표지된 항체를 이용하는 종양 영상화 방법을 통해 생체내 종양을 검출하는 단계를 수반한다. 영상 반응제 및 이러한 반응제로 항체를 표지하는 방법은 공지되어 있다(예를 들면, Wensel 및 Meares, Radio Immunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York(1983); Colcher 외, Meth. Enzymol., 121: 802-16(1986) 참조). 표지된 항체는 방사핵 스캐닝과 같은 방법을 통해 검출할 수 있다(Bradwell 외, MonoclonalAntibiodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin 외(eds.), pp.65-85, Academic Press(1985) 참조).
투여
본 명세서에 기재된 항체는 종양을 영상화하거나 치료하기 위하여 동물 또는 인간과 같은 대상에 투여될 수 있다. 이들 항체는 단독으로 또는 혼합물 형태, 예를 들면 약리학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체(예를 들면, 생리 염수)의 존재 하에 투여될 수 있다. 부형제 또는 담체는 투여 형태 및 경로를 기준으로 선택된다. 적합한 약제 담체는 당 기술분야에 공지된 문헌인Remington's Pharmaceutical Science(E. W. Martin) 및 USP/NF(United States Pharmacopeia and National Formularly)에 기재되어 있다.
약제 조성물은 그것의 의도하는 투여 경로에 적합하게 제형화된다. 투여 경로의 예로는 예를 들면 정맥내, 피부내, 피하와 같은 비경구 투여, 경구 투여(예를 들면, 흡입), 경피 투여(피부용), 점막을 통한 투여 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피부내 또는 피하용으로 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음과 같은 성분을 포함할 수 있다: 주사용 물, 식염수, 응고 오일(fixed oil), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 폴리프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 탄력성(tonicity) 조절제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기를 이용해 조절할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 멀티 용량의 물약병(vial)에 넣을 수 있다.
본 발명의 조성물에 가장 효과적인 투여 형태 및 투여 요법은 질환의 경중 및 경과, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 따라 결정된다. 따라서, 조성물의 투여 용량은 개개의 환자에 따라 적정되어야 한다. 항체 조성물의 유효량은 약 1 ㎍ 내지 약 5000 mg, 바람직하게는 약 1 mg 내지 500 mg, 더욱 바람직하게는 약 100-200 mg의 범위이다.
진단 키트
본 발명은 또한 상기에 기재된 방법을 수행하는 진단 키트를 포함한다. 상기 진단 키트는 (a) 본 명세서에 기재된 단일 클론 항체 및 (b) 항체에 대한 특이 결합 파트너 및 결합된 항체 검출용 라벨의 접합체를 포함한다. 상기 키트는 또한 완충제 및 단백질 안정화제, 예를 들면 당당류 등와 같은 보조제를 포함한다. 진단 키트는 필요한 경우, 바탕 간섭(background interference)을 감소시키기 위한 제제, 대조용 반응제 및 테스트를 수행하기 위한 기구를 포함하는 신호-생성 시스템의 다른 성분을 추기로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 진단 키트는 본 발명의 단일 클론 항체 및 검출 가능한 신호를 생성시킬 수 있는 라벨 접합체를 포함한다. 상기에 언급된 바와 같은 보조제가 존재할 수도 있다. 진단 키트의 사용법에 대한 지침도 일반적으로 포함된다.
폴리펩타이드
본 명세서에 기재된 단일 클론 항체는 그들이 결합하는 40 kDa 단밸질을 분리하고 특정화하는 데 사용될 수 있다. 단일 클론 항체에 의해 인식되는 단백질은 흉선 림프종, T-세포 종양, B-세포 림프종, 흑색종, 골수육종 및 급성 T-세포 백혈병을 포함하는 다양한 종양 세포에서 발견되는 새로운 세포 표면 단백질이다. 이 단백질은 단일 클론 항체가 이 단백질에 결합하는 경우 단백질이 발현된 세포가 사망한다는 관찰 사실을 근거로 하는 사망 유도 분자이다.
본 발명의 단일 클론 항체에 의해 인식되는 단백질은 그 단백질을 발현하는 세포(예를 들면, E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK 101 A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 또는 Cos)로터 분리될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 단일 클론 항체는 단백질을 면역침전시키는 데 사용될 수 있다. 단백질의 서열을 결정하기 위하여, 단백질을 SDS-PAGE로 정제하고, Immobilon 막(Millipore Corp., Bedford, MA) 상에서 전기블로팅한 뒤, Coomassie Brilliant Blue로 막을 염색한다. 이어서, 염색된 단백질 밴드(Mr=40 kDa)를 후속의 아미노 말단 서열 분석을 위해 레이저 블레이드로 절제할 수 있다. 자동화된 Edman 분해와 같은 아미노 말단 서열 분석법이 당 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 미반응 단백질과 융합된 40 kDa 단백질을 포함하는 융합 단백질을 특징으로 한다. 미반응 단백질은 정제, 검출 및 가용화를 용이하게 하고 일부 다른 기능을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 융합 단백질은 합성에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들면 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)와 같은 적합한 커플링 반응제를 사용하여 미반응 단백질에 연결될 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질은 융합 단백질을 발현시키는 뉴클레오타이드 서열을 적합한 발현 벡터에 클로닝하여 재조합적으로 제조할 수도 있다. 이어서, 배지 또는 세포 용균물로부터 재조합 융합 폴리펩타이드를 정제할 수 있다.
40 kDa 단백질은 예를 들면 특정 종양에 대해 면역화하는 백신으로서 유용하다. 이러한 백신을 제조하는 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다(예를 들면, Estin 등의 Proc. Nat'l. Acad. Sci.(USA), 85: 1052(1988) 참조). 간단히 설명하면, 클로닝된 종양-회합 단백질의 발현을 위한 재조합 바이러스를 제작한다. 재조합 바이러스가 감염된 세포는 숙주의 조직 적합성 항원 및 면역원성 바이러스 단백질과 함께 세포 표면에서 상기 단백질을 발현시킬 것이다. 이는 종양 거부반응에서 중요한 역할을 담당하는 세포 면역성 유도를 조력한다.
본 발명은 또한 40 kDa 단백질에 결합하거나 40 kDa 단백질의 발현 또는 활성을 촉진 또는 억제하는 효과를 가지는 조절인자, 즉 테스트 화합물 또는 시료(예를 들면, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 작은 분자 또는 약제)를 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 40 kDa 단백질의 길항제는 세포 내 고사를 억제하는 데 유용하다. 이러한 길항제는 대상 내에서 혐오적인 고사를 억제하는 역할을 담당할 수 있다.
실시예
실시예 1 : 항종양성 항체의 제조
림프종의 성장 또는 생존 및/또는 정상 림프구의 기능과 관련 있을 수 있는 새로운 기능성 분자를 동정하기 위하여, E710.2.3이 감염된 햄스터로부터 다음과같이 하이브리도마를 제조하였다. 아메리카 햄스터에 107개의 E710.2.3을 복막내 주사하고, 융합 전에 7-10회 추가 자극하였다. Schreiber 등의 (1985)Immunol. 134: 1609에 기재된 바와 같이 융합 파트너 P3x63-AG8.653를 사용하여 융합을 수행하였다. 먼저, E710.2.3A에 결합하는 능력에 대해 면역형광법 및 유동 세포계측법(flow cytometry)을 이용하여 혼성체로부터 상청액을 스크리닝하였다. 본 명세서에서 DMF10.62.3으로 불려진 특정 항체는 E710.2.3의 표면을 밝게 염색시켰다.
면역형광 분석 결과, DMF10.62.3은 다수의 쥐과 세포주와는 반응하였으나(표 I), 다른 것들로부터 유래된 것들은 존재하지 않는 것으로 나타났다(표 Ⅱ). 양성 세포주는 일부의 T 세포주(예를 들면, RMA-S), 몇몇 B 세포 림프구(예를 들면, A20 및 WEHI-231) 및 대식세포 세포주(C2.3)를 포함하였다. DMF10.62.3도 기질 세포주(PBK101 A2), 흑색종(B16), 육종(MC57) 및 폴리오마-형질전환 섬유아세포(WOP-3027)를 포함하는 비조혈 기원의 몇몇 영구 세포에 특이적으로 결합하였다. 몇개의 다른 미성숙(예를 들면 G58.2) 및 성체 세포(예를 들면, EL4), 대식세포(예를 들면, A3.1), 덴드라이트 세포(DC2.4) 및 섬유아세포 세포주(LADp31)은 DMF10.62.3에 대해 음성이다. 흥미롭게도, mAb도 Jurkat, 293T 및 143Ftk를 포함하는 여러 종류의 인간 영구 세포주, 및 원숭이 SV40-형질전환 신장 세포주 Cos7과 반응하였다. DMF10.62.3은 B 림프아구 세포, 721 및 자궁경부 암종 세포 HeLa와 같은 특정 인간 세포주에는 결합하지 않았다. 대표적인 세포주의 염색 패턴을 도 1의 에 나타내었다: DMF10.62.3-양성 세포 E710.2.3(도 1의 a), A20(도 1의 b) 및 Jurkat(도 1의 c) 및 DMF10.62.3-음성 세포 RF33.70(도 1의 d).
<표 I>
| 세포주 | 설명 |
| E710.2.3 | 쥐과 흉선 림프종 |
| RMA-S | 쥐과 T 세포 종양 |
| CTLL | 쥐과 IL-2 의존성 T 세포주 |
| LB27.4 | 쥐과 B 세포 하이브리도마 |
| A20 | 쥐과 B 세포 림프종 |
| WEHI-231 | 쥐과 B 세포 림프종 |
| PBK101 A2 | 쥐과 흉선 기질 세포주 |
| C2.3 | 쥐과 영구화 골수 대식세포 |
| B16 | 쥐과 흑색종 |
| MC57 | 쥐과 메틸콜안트렌-유발성 종양 |
| WOP-3027 | 쥐과 폴리오마-형질전환 섬유아세포 |
| 293T | 인간 형질전환 1차 배의 신장 |
| 143Btk | 인간 골수육종 |
상기 데이터는 새로운 항체가 많은 영구 세포주에 특이적으로 결합하나 모든 영구 세포주에 결합하는 것은 아니며, 결합은 종 또는 세포 리니지에 의해 제한되지 않음을 보여주었다.
< 표 Ⅱ >
| 세포주 | 설명 |
| RF33.70 | 쥐과 T-T 혼성체 |
| DO11.10 | 쥐과 T-T 혼성체 |
| 13G7.3.2 | 쥐과 T-T 혼성체 |
| HT-2 | 쥐과 IL-2 의존성 T 세포주 |
| EL-4 | 쥐과 T 세포 림프종 |
| G58.2 | 쥐과 흉선 림프종 |
| NFC105 | 쥐과 흉선 림프종 |
| P815 | 쥐과 비만세포종 |
| P388D1 | 쥐과 단핵세포/대식세포 종양 |
| LADp31 | 마우스 L 세포주 |
| A3.1 | 쥐과 영구화 골수-유래의 대식세포 |
| DC2.4 | 쥐과 영구화 수지상 돌기 세포주 |
| 721 | 인간 B 세포주 |
| HeLa | 인간 상피 경부 암종 |
| E36 | 햄스터 폐 암종 |
| BHK-21 | 햄스터 신장 세포주 |
| CHO | 중국 햄스터 난소 |
실시예 2: DMF10.62.3에 의해 인식되는 분자의 발현
DMF10.62.3에 의해 인식되는 분자의 발현을 태아 흉선 세포 내에서 다음과 같이 조사하였다. C57B1/10 마우스의 조절된 임신을 통해 14일째의 태아기에 희생된 배를 얻었다. 태아 흉선을 Eppendorf 튜브 유리 플러저를 사용하여 PBS 내에 수확하였다. 단일 세포 현탁액을 얼음 상에서 항-Fc 감마 수용체 Ⅱ/Ⅲ(Phramingen)와 함께 배양하여 Fc 수용체를 차단하였다. 이어서, 세포를 DMF10.62.3 또는 햄스터 IgG 중 하나로 30분간 염색한 후, 알로피코이아닌(APC)-접합 항-Thy 1.2(Pharmingen)와 함께 FITC 접합 염소 항-햄스터로 염색시켰다. 일부 실험에서는 PE에 접합된 항-CD25 및 Cy-Chrome(Pharmingen)에 접합된 항-CD44도 포함되었다. 염색된 세포를 1% 파라포름알데하이드 내에서 하룻밤 동안 고정시킨 뒤, 유동 세포계측법을 이용해 분석하였다.
DMF10.62.3으로 염색된 14일된 태야 흉선 세포는 는 40 kDa 단백질에 대해 양성이었으며, 상기 단백질은 Thy 1.2 양성 세포 상에 존재하는 것으로 나타났다(도 2의 a). 흥미롭게도, 상기 단백질은 CD25+CD44+태아 흉선 세포뿐 아니라 CD44+CD25-태아 흉선 세포 상에도 존재하였다. 그러나, 성체 흉선(도 2의 c), 성체 비장(도 2의 b) 및 성체 골수 세포(도 2의 d)의 염색은 DMF10.62.3에 의해 인식되는 단백질이 이들 세포 중 어떤 것도 대조군 햄스터 IgG에서 나타난 수준 이상으로 존재하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 상기 단백질은 RAG-/-마우스 유래의 이들 군의 분석 또는 유동 세포계측에 의한 다수의 파라미터 분석에서 CD4-CD8-세포 상에 게이팅(gating) 후의 성체CD4-CD8-흉선 세포 상에서 검출할 수 없었다.
DMF10.62.3에 의해 인식되는 단백질이 정상의 활성화된 세포 상에 존재하는 지를 결정하기 위하여, 다음과 같이 비장 T 세포를 T 세포 미토겐 ConA로 활성화하고, DMF10.62.3에 의해 인식되는 단백질의 발현에 대하여 염색하였다. 비장, 흉선 및 골수 세포를 성체 (4-6개월된) Balb/c 또는 C57B1/6 마우스로부터 준비하였다. 트리스 암모늄 클로라이드 용균을 이용하여 비장 세포 현탁액으로부터 적혈구를 제거하였다. 비자극 세포는 즉시 염색되었다. 림프아구를 1 ㎍/㎖의 ConA 또는 10 ㎍/㎖의 LPS로 배지 내에서 자극하였다. 1-3일 동안 배양한 후, DMF10.62.3의 발현에 대하여 세포를 염색하였다. 비자극 세포(도 3의 a), 또는 활성화 후 ConA로 24시간(도 3의 a), 48시간(도 3의 c) 또는 72시간(도 3의 d) 동안 자극된 세포에서는 바탕값 이상의 유의한 염색이 나타나지 않았다(FAC 프로파일에는 변화 없음). 양성 대조군으로서, ConA로 자극된 세포를 CD25로 염색하였다. 기대한 바와 같이, ConA 처리는 비자극 세포에 비해 이들 세포에 상에서 CD25의 발현에 있어 현저한 증가를 가져왔다(CD25의 세포 결합은 FAC 프로파일을 변화시킴). 유사하게, 비장이 B 세포가 지질-다당류(LPS)로 활성화되는 경우, 24시간(도 3의 e), 48시간(도 3의 f) 및 72시간(도 3의 g) 후에도 DMF10.62.3에 의해 염색되지 않는 것으로 나타난 반면(FAC 프로파일에는 변화 없음), 이들 세포는 CD25를 발현시켰다(FAC 프로파일이 변함). DMF10.62.3에 의해 인식되는 단백질은 성체 골수 세포 상에 존재하지않는다(도 2의 d). 이러한 데이터는 DMF10.62.3에 의해 인식되는 단백질이 일부 태아 림프구 상에는 존재하나, 성체 동물 내에서 조혈 기원의 무활동 또는 활성화된 정상 세포 상에는 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 3: DMF10.62.3는 종양 세포의 증식을 억제한다.
E710.2.3 세포는 저밀도로 배양되고 PMA 부재 하에 유지되는 경우 매우 느리게 증식하거나 거의 증식하지 않는다. 그러나, 이들은 흉선 세포와 함께 배양되는 경우에는 증식한다. 먼저, 흉선 세포에 의해 유발된 증식을 차단하는 능력을 통해 DMF10.62.3을 동정하였다. 표 Ⅲ에 나타난 바와 같이, DMF10.62.3은 이 반응을 완전히 억제하였다(도 4의 a). 증식 분석을 다음과 같이 수행하였다. E710.2.3 세포를 PMA 없이 세척하고, 완전 RPMI 내에서 낮은 세포 밀도(<105/㎖)로 48시간 동안 배양하여 바탕 증식을 감소시켰다. 이어서, 5x103개의 세포를 25 ng/㎖의 PMA 또는 5x105개의 흉선 세포를 함유하는 평평한 바닥 미세적정 플레이트 내에서 항체의 존재 또는 부재 하에 72시간 동안 배양하였다. 세포의 자발적인 증식에 대한 항체의 작용을 조사하는 실험에서, (>105/㎖의 고밀도로 배양한) E710.2.3 또는 RMA-S 세포를 상이한 농도의 항체의 존재 또는 부재 하에서 72시간 동안 배양하였다.3H-티미딘(1 TCi/웰)을 마지막 5시간 동안 첨가하고, J-섬광 계측기(Wallac, Gaitheraburg, MD)를 이용하여 DNA로의 라벨 혼입을 측정하였다.
< 표 Ⅲ >
| 배지 | 흉선세포 | PMA | |
| 대조군(무 항체) | 8,699 | 33.802 | 54,271 |
| DMF10.62.3 | 938 | 750 | 450 |
| DMF10.132 | 6,646 | 27.156 | 25,216 |
기타 자극에 대한 E710.2.3의 반응을 억제하는 DMF10.62.3의 능력도 조사하였다. 표 Ⅲ에 나타난 바와 같이, 항체는 PMA에 의해 유발되는 E710.2.3의 증식도 차단하였다. 또한, E710.2.3은 고밀도로 배양되는 경우 자발적으로 증식하였고 DMF10.62.3은 이 반응을 억제하였다(도 4의 a). 증식은 3 ㎍/㎖에서 현저하게 억제되며, 완전한 억제는 12.5 ㎍/㎖에서 관찰된다. 반면, 햄스터 IgG는 이러한 어떠한 자극에 대한 E710.2.3의 반응에 대해 전혀 작용을 나타내지 않았다(도 4의 a). 마찬가지로, 원래의 융합으로부터 얻어진 많은 mAb는 E710.2.3에 결합하였으나, 그것의 증식(예를 들면, DMF10.62.3)을 억제하지는 않았다(표 Ⅲ). 따라서, DMF10.62.3은 증식을 유도하는 데 사용된 자극에 관계없이 E710.2.3의 증식을 특이적으로 억제하였다.
DMF10.62.3에 의해 인식되는 단백질은 많은 다른 세포주 상에 존재한다. 그러므로, 이것은 항체가 그들의 자발적인 증식에 대해 유사한 효과를 가지는지를 결정하는 데 유익하였다. DMF10.62.3은 RMA-S뿐 아니라 테스트된 다른 많은 세포주의 증식을 억제하였다(도 4의 b). 반면, 항체는 RF33.70의 자발적인 증식에 대해서는 전혀 작용하지 않았으며, 이는 DMF10.62.3 단백질의 존재에 대해 부정적인 것이다. (도 4의 c).
실시예 4: DMF10.62.3는 고사에 의해 세포 사망을 유도한다.
R&D사(Minneapolis, MN) 제공의 키트 및 Pharmingen(San Diego, CA)을 사용하여 고사를 분석하였다. 간단히 설명하면, 2x105개의 세포를 200 il 배지 내에서 다양한 농도의 항체와 함께 배양하였다. 배양 마지막에, 세포를 PBS로 2회 세척하고, PI 및 FITC 아넥신으로 15분간 처리한 뒤, 유동 크로마토그래피를 통해 분석하였다. Schattner 등((1995) J. Exp. Med. 182:1557)이 제시한 바와 같이 2% 아가로스 겔 상에서 아가로스 겔 전기영동을 통해 DNA 단편을 평가하였다.
항체 DMF10.62.3으로 처리된 세포 배지를 가시적으로 검사하여 온전한 세포의 수가 감소하였음을 인지하였다. 또한, 세포는 더 이상 치명적인 트립판 블루 염료를 차단하지 않았다. 이러한 관찰 결과 및 증식 억제는 항체가 세포에 대해 세포독성임을 시사한다. 따라서, DMF10.62.3이 세포 사망을 유도하는 메커니즘을 결정하기 위한 연구를 수행하였다.
세포는 고사 또는 괴사에 의해 죽을 수 있다. 고사를 진행하고 있는 세포에서 나타나는 초기 변화 중 하나가 원형질막 상의 포스파티딜세린을 외부로 도출하는 것이고, 이는 FITC-아넥신을 이용한 염색에 의해 검출될 수 있다. 이 과정의 초기에, 고사성 세포는 프로피듐 아이오다이드와 같은 치명적인 염료를 차단할 수 있으므로, FITC-아넥신 양성 및 PI-음성으로 동정될 수 있다. 고사 과정 말기에, 막의 완전성이 손실되고 FITC-아넥신 양성 세포는 PI-양성이 된다. 반면, 괴사가 진행되는 동안 세포는 막의 완전성을 손실하고, 동시에 FITC 아넥신 양성 및 PI-음성 단계 없이 PI-양성 및 FITC-아넥신 양성이 된다.
도 5의 a 내지 i의 FAC 프로파일에서, 좌측 하부 4분면의 세포는 살아있는 세포이고, 우측 하부 4분면의 세포는 고사 및/또는 괴사에 의해 죽은 세포이다(PI-양성 및 FITC-아넥신 양성). 각 4분면에 세포의 비율도 나타내었다. 현 연구에서, 대부분의 E710.2.3 세포는 배지(10.9 내지 15% 아넥신+, PI-) 내에서 자발적인 고사를 진행하였다. 그러나, 1 ㎍/㎖ 정도의 소량의 DMF10.62.3은 1시간 내에 고사에 있어 현저한 증가를 초래하였으며(28.9% 아넥신+, PI-; 도 5의 a), 이러한 고사는 시간에 따라 증가하였다(48.6% 아넥신+, PI-양성, 3시간까지)(도 5의 c). 고농도의 DMF10.62.3(15 ㎍/㎖)은 시간 내(37.1% 아넥신+, PI-양성, 1시간까지)에 더 많은 세포에서 고사를 더 빠르게 자극하였다(도 5e-g). 반면, 유사한 양의 햄스터 IgG 처리는 배지 단독에 대해서는 유의한 효과를 나타내지 않았다(도 5의 d, h, i). 고사는 아가로스 겔 전기영동에 의한 DNA 단편의 가시화에 의해서도 확인되었다.
DMF10.62.3에 의해 인식되는 단백질은 다른 세포에서도 발현되었고, 이 항체는 그들의 증식을 억제하였기 때문에, DMF10.62.3도 그들이 고사되는 것을 자극하였는 지를 추가로 조사하였다. DMF10.62.3은 RMA-S, CTLL, LB27.4 및 A20 및 인간 세포주 Jurkat 및 143BTK의 현격한 고사를 초래하였다(표 Ⅳ). 15 ㎍/㎖의 DMF10.62.3을 사용하여 고사를 유도하고, 고농도의 항체로 증가시켰다. 반면, DMF10.62.3은 RF33.70 내에서 고사를 유발하지 않았으므로, 단백질에 대해 음성이다. DMF10.62.3에 의해 유발되는 고사의 수준은 상이한 세포주에 따라 가변적이었고, 세포 발현 수준 및 그 단백질을 발현하는 군의 세포의 비율에 따라서 좌우되는 것으로 나타났다(표 Ⅳ). 예를 들면, 대부분의 E710.2.3 및 RMA 세포는 상기 단백질을 높은 수준으로 발현시켰으며, DMF10.62.3은 이들 세포주 모두에서 높은 수준의 고사를 유발하였다. 반면, A20 및 LB27.4 세포는 40 kDa 단백질을 낮은 수준으로 발현시켰으며, DMF10.62.3은 이들 세포 내에서 낮은 수준의 고사를 유발하였다(표 Ⅳ). E710.2.3 및 RMA-S 세포는 fas를 발현시키지 않으므로, DMF10.62.3에 의한 고사의 자극은 fas 비의존성인 것 같다(표 Ⅳ).
< 표 Ⅳ >
| 세포주 | 고사 세포(%) | |||||
| DMF10.62.3 | 햄스터 IgG | 비처리 | 형광강도DMF10.62.3/햄스터 IgG | DMF10.62.3에대해 양성으로염색된 세포(%) | 쥐과 fas표면 발현에대한 염색 | |
| 마우스 T 세포주 | ||||||
| E710.2.3 | 86.9 | 19.8 | 24.7 | 27.5 | 72.6 | - |
| RMA-S | 69.6 | 12.2 | 14.0 | 14.5 | 60.6 | - |
| CTLL | 36.4 | 14.8 | 16.7 | 8.88 | 51.5 | - |
| RF33.70 | 8.1 | 8.6 | 7.8 | 0.98 | 0.48 | - |
| 마우스 B 세포주 | ||||||
| LB27.4 | 16.8 | 7.1 | 10.8 | 1.48 | 7.0 | + |
| A20 | 16.2 | 13.8 | 12.2 | 3.3 | 24.8 | + |
| 인간 세포주 | ||||||
| Jurkat | 33.9 | 12.6 | 11.8 | 16.18 | 49.2 | ND |
| 143BTK | 29.7 | 21.1 | 20.5 | 3.8 | 29.5 | ND |
실시예 5: DMF10.62.3은 E710.2.3 및 기타 세포주에서 동형 응집을 초래한다.
동형 응집은 세포가 서로 부착하도록 자극하는 생물학적 활성 과정이다. 응집 분석은 다음과 같이 구성된다. 105개의 세포를 다양한 농도의 DMF10.62.3 또는 햄스터 IgG와 함께 또는 200 il 완전 RPMI 내에서 항체 없이 배양하였다. 억제 효과를 테스트하기 위하여, 105개의 세포를 억제제와 함께 30분 동안 예비 배양한 뒤, DMF10.62.3 mAb(10 ㎍/㎖)를 억제제의 연속 존재 하에서 6시간 동안 첨가하였다. 응집에 대한 파라포름알데하이드의 효과를 테스트하기 위하여, 세포를 1% 파라포름알데하이드 내에서 10분 동안 고정시키고, 세척한 뒤, DMF10.62.3을 6시간 동안 첨가하였다. 응집을 가시적으로 채점하였다. 열전기적으로 냉각된 전자 결합 소자(CCD) 카메라(Princeton Instruments, Trenton, NJ)를 사용하여 6시간 동안 현미경 사진을 찍었다. DMF10.62.3은 배지 내에서 E710.2.3의 동형 응집을 유발하는 것으로 확인되었다. 6시간 뒤에, 5 ㎍/㎖ 이상의 항체로 처리된 세포에서 현저한 응집이 관찰되었다. 반면, 햄스터 IgG 또는 배지로 처리한 배지에서는 응집이 관찰되지 않았다. 이러한 응집은 액틴 미세섬유(microfilament)를 붕괴시키는 사이토칼라신 B, 칼모둘린 의존성 과정을 억제하는 트리프루오로페라진, ATP 합성을 억제하는 Na 아지드 +2 데옥시글루코스, 및 Ca2+및 Mg2+를 킬레이팅하는 EDTA를 포함하는 다양한 제제를 처리함으로써 차단될 수 있다. 반면, 응집은 미세소관(microtubule) 형성을 억제하는 콜히친에 의해서는 영향을 받지 않았다. 응집은 또한 4℃ 배양 및 파라포름알데하이드 처리에 의해서도 억제되었다(표 Ⅴ). 이러한 결과는 응집이 활성 과정이며 단순한 교착이 아님을 시사한다.
< 표 Ⅴ >
| 부착에 사용된 화학물질 | 세포에 대한 작용 | 유전적 동계 |
| 사이토칼라신 B(20 ㎍/㎖) | 세포골격(액틴 미세섬유 완전성 파괴) | - |
| 콜히친(20 ㎍/㎖) | 미세소관 형성 억제 | + |
| 트리플루오페라진(20 μM) | 칼모듈린 의존성 과정 억제 | - |
| Na 아지드(0.1%) +2-데옥시글루코스(5 mM) | ATP 합성 억제 | - |
| EDTA(10 mM) | Ca2+및 Mg2+킬레이팅 | - |
| 배지 단독 | 대조군(작용 없음) | + |
| 4℃ | - | |
| 파라포름알데하이드 | - |
또한, DMF10.62.3은 DMF10.62.3 결합 단백질을 발현시키는 일부 다른 세포주(예를 들면, RMA-S, CTLL)의 동형 응집을 초래한다. 그러나, 몇몇 다른 DMF10.62.3 양성 세포주(예를 들며,Jurkat, LB27.4, A20, 143Btk-)에 대해서는 바탕값 이상의 응집이 거의 나타나지 않았다. DMF10.62.3이 결합하지 않는 RF33.70에서는 응집이 나타나지 않았다.
응집 분석은 새로운 항체가 본 발명의 새로운 항종양성 항체 중 하나인지를 결정하는 데 사용될 수 있다.
실시예 6: DMF10.62.3은 GPI과 결합되지 않은 40 kDa 단백질을 면역침전시킨다.
DMF10.62.3에 의해 결합된 단백질을 특정화하기 위하여,35S 표지 및 면역침점을 다음과 같이 수행하였다. 5x106개의 E710.2.3 세포를 메티오닌-비함유 배지 내에서 1시간 동안 단식시킨 뒤, 0.5 mCi/㎖의35S 메티오닌과 함께 2시간 동안 배양하였다. 표지된 세포를 Townsend 등((1990)J. Immunol. 146:2235)이 제시한 바와 같이 면역침전 완충용액 내에서 용균시켰다. 정화된 용균물을 햄스터 IgG로 예비 세척하고, 단백질-A-세파로스에 결합된 DMF10.62.3으로 면역침전시킨 뒤, 14% 겔 상에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 분석하였다. DMF10.62.3 결합 단백질의 분자량을 측정하기 위하여, E710.2.3 세포를35S 메티오닌으로 2시간 동안 표지하였다. 표지된 세포 유래의 면역 침전물을 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다.
mAb DMF10.62.3은 환원 조건 하에서 E710.2.3으로부터 대략 40 kDa의 단백질을 면역침전시켰다. 이 단백질의 전기영동 이동도는 비환원 조건 하에서도 변하지 않았다. 정상 햄스터 IgG를 함유하는 면역 침전물 또는 항-MHC 클래스 I 항체 Y-3을 함유하는 면역 침전물에서는 이 밴드가 나타나지 않았다. 40 kDa 항체는 표면 표지된 E710.2.3 및 RMA-S 세포의 용균물에서 동정하였다.
Thy-1 및 Ly-b A/E와 같은 몇몇 세포 표면 분자는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커(anchor)를 통해 세포 표면에 결합된다. 이 세포 표면 결합은 PI-PLC 처리에 민감하다. DMF10.62.3에 의해 인식되는 단백질이 GPI에 결합되었는지를 결정하기 위하여, 세포 표면에서 상기 단백질을 발현시키는 RMA-S 세포에 PI-PLC를 처리하였다. PI-PLC 처리는 DMF10.62.3 염색을 감소시키지 않았으나, GPI-결합 분자 Thy-1에 대한 염색은 감소시켰다. 이는 DMF10.62.3에 의해 인식되는 40 kDa 단백질이 GPI에 의해 세포 표면에 부착되지 않음을 시사한다.
실시예 7: DMF62.3 항체의 생체내 작용
AKR 마우스를 5x106개의 유전적 동계의 E710.2.3 종양 세포로 Ⅳ 또는 IP 감염시키고, 첫날 및 10일 후에 염수 또는 0.5 mg의 대조군 또는 DMF62.3 항체 주사액 IP을 수여하였다. 50일 동안 동물의 생존을 관찰하였다(표 Ⅵ).
< 표 Ⅵ >
| 처리 | 생존률(%) | 사망까지의 평균시간 |
| 1. 염수 | 0% | 35일 |
| 2. 대조군 항체 | 0% | 33일 |
| 3. DMF62.3 | 100% | (사망 없음) |
기탁물 설명
단일 클론 항체 DMF10.62.3을 생산하는 하이브리도마 세포주는 1999년 7월 20일에 버지니아주 매나서스 유니버시티 블러바드 10801 소재의 American Type Culture Collection(ATCC)에서 수탁되었으며, 단일 클론 항체 DMF10.167.4 및 DMF10.34.36을 생산하는 하이브리도마 세포주는 1999년 7월 22일에 버지니아주 매나서스 유니버시티 블러바드 10801 소재의 American Type Culture Collection(ATCC)에서 수탁되었다. 이들 하이브리도마는 미국 특허청 장관이 37 CFR 1.14 및 35 USC 122 하에 의거하여 공개하도록 허가한 자에게 본 특허출원이 계류되는 동안 이들 하이브리도마에 대한 입수가 가능함을 보증한다는 조건 하에 기탁되었다. 기탁물은 대상 출원의 대응출원 또는 이것의 분할출원이 출원되는 국가에서 외국 특허법에 의해 요구될 때에도 이용 가능하다. 그러나, 기탁물의 유효성은 정부 방침에 의해 승인된 특허권의 훼손에 있는 경우 대상 출원을 실시하는 인가에 대한 구성 요소는 아니다.
또한, 대상 배양주 기탁물은 미생물기탁에 대한 부다페스트 조양의 규정에 따라 보관되어 대중에게 이용될 것이다. 즉, 이들은 생존 상태 및 기탁물 샘플의 공급에 대한 가장 최후의 요청이 있은 후 적어도 5년의 기간동안 및 어떠한 경우에도 기탁일로부터 적어도 30(삼십)년의 기간 동안, 또는 배양주의 개시가 허여될 수 있는 어떠한 특허의 집행 가능한 기간 플러스 최후의 샘플 요청 후 5년 동안은 오염되지 않은 상태로 보존하는 데 필요한 모든 관리 감독 하에 저장된다. 기탁자는 수탁기관이 요청된 샘플을 공급할 수 없는 경우 기탁물을 대체하는 의무를 인정한다. 대상 배양주 기탁물의 공개에 대한 유효성에 대한 모든 사양은 그들을 개시하는 특허의 승인 시 취소 불가능하게 제거될 것이다.
기타 구현예
본 발명은 본 발명의 상세한 설명과 관련하여 설명되었으며, 상기 설명은 예시를 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 다른 양태, 장점 및 변형이 하기 특허청구범위의 범위 내에서 이루어진다.
Claims (36)
- (a) 태아 흉선 세포에 결합하고;(b) 세포 결합 시 그 세포의 세포 증식을 억제하며;(c) 성체 흉선 세포에 결합하지 않는단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서,상기 항체가 세포 결합 시 동형 응집(homotypic aggregation)을 유발하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서,상기 항체가 그것이 결합하는 세포 내에서 고사(apotosis)를 유발하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서,상기 항체가 E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK 101A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 및 Cos로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 종양 세포주에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제4항에 있어서,상기 항체가 E710.2.3 세포에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서,상기 단일 클론 항체가 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377에 의해 생산되는 DMF10.62.3인 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서,상기 단일 클론 항체가 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-405에 의해 생산되는 DMF10.167.4인 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서,상기 단일 클론 항체가 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-404에 의해 생산되는 DMF10.34.36인 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, PTA-404 또는 PTA-405에 의해 생산되는 단일 클론 항체에 의해 결합된 단백질에 결합하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제9항에 있어서,상기 항체가 인간화된 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제9항에 있어서,상기 항체가 경쇄 및 중쇄의 비인간 가변 부위 및 인간 불변 부위를 포함하는 키메라 단일 클론 항체인 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, PTA-404 또는 PTA-405에 의해 생산되는 단일 클론 항체에 의해 결합된 에피토프에 결합하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- (i) 40 kDa의 분자량;(ⅱ) 태아 흉선 세포의 표면 상에서 발현;(ⅲ) 성체 흉선 세포의 표면 상에서 비발현;(ⅳ) 항체 결합 시 세포 증식을 차단하는 능력; 및(ⅴ) 항체 결합 시 동형 응집을 유발하는 능력에 의해 특정화되는 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제13항에 있어서,상기 단백질이(ⅵ) 항체 결합 시 세포 내에서 고사를 유발하는 능력에 의해 추가로 특정화되는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제13항에 있어서,상기 단백질이(ⅶ) E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101 A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 및 Cos로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 종양 세포주의 표면 상에서 발현되는 특징에 의해 추가로 특정화되는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제1항의 단일 클론 항체의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서,검출 가능한 라벨을 추가로 포함하는 단일 클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
- 제1항의 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
- 제18항에 있어서,상기 하이브리도마 세포주가 세포주 ATCC No. PTA-377, ATCC No. PTA-404 또는 ATCC No. PTA-405인 하이브리도마 세포주.
- (i) 40 kDa의 분자량;(ⅱ) 태아 흉선 세포의 표면 상에서 발현;(ⅲ) 성체 흉선 세포의 표면 상에서 비발현;(ⅳ) 제1항에 따른 항체의 결합 시 세포 증식을 차단하는 능력; 및(ⅴ) 제1항에 따른 항체의 결합 시 동형 응집을 유발하는 능력에 의해 특정화되는 실질적으로 순수한 단백질.
- 제20항에 있어서,상기 단백질이(ⅵ) E710.2.3, RMA-S, CTLL, LB17.4, A20, WEHI-231, PBK101 A2, C2.3, B16, MC57, WOP-3027, 293T, 143Btk, Jurkat 및 Cos로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 종양 세포주의 표면 상에서 발현되는 특징에 의해 추가로 특정화되는 단백질.
- 제20항에 있어서,상기 단백질이(ⅶ) 제1항에 따른 항체의 결합 시 세포 내에서 고사를 유발하는 능력에 의해 추가로 특정화되는 단백질.
- 제20항에 있어서,하이브리도마 세포주 ATCC No. PTA-377, PTA-404 또는 PTA-405에 의해 생산되는 단일 클론 항체에 결합하는 단백질.
- 제1항의 단일 클론 항체 및 약리학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제 조성물.
- 대상 내에서 종양 세포를 검출하는 방법에 있어서,특이적인 결합이 이루어질 수 있는 충분한 조건 하에서 대상으로부터 채취한 세포 샘플과 제1항의 단일 클론 항체를 접촉시키는 단계; 및상기 샘플 내의 하나 이상의 세포에 대한 상기 항원의 특이적인 결합을 검출하는 단계―여기서 결합은 대상 내에 종양 세포가 존재함을 나타냄―를 포함하는 검출 방법.
- 제25항에 있어서,상기 종양 세포가 흉선 림프종, T-세포 종양, B-세포 림프종, 흑색종, 골수육종 및 급성 T-세포 백혈병 세포인 검출 방법.
- 제25항에 있어서,상기 종양 세포가 환자 내에 존재하는 검출 방법.
- 종양 세포의 증식을 억제하기에 충분한 다량의 제1항의 단일 클론 항체와 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 종양 세포의 증식 억제 방법.
- 세포 내에서 고사를 유발하기에 충분한 다량의 제1항의 단일 클론 항체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내에서 고사를 유발하는 방법.
- 제29항에 있어서,상기 세포가 흉선 림프종, T-세포 종양, B-세포 림프종, 흑색종, 골수육종 및 급성 T-세포 백혈병 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양 세포인 방법.
- 제29항에 있어서,상기 세포가 시험관내 또는 생체내에 존재하는 방법.
- 제1항의 단일 클론 항체 및 사용 지침을 포함하는 종양 진단용 키트.
- 제32항에 있어서,진단하고자 하는 종양이 흉선 림프종, T-세포 종양, B-세포 림프종, 흑색종, 골수육종 및 급성 T-세포 백혈병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양 진단용 키트.
- 모이어티와 접합된 제1항의 단일 클론 항체를 포함하는 종양 세포 표적화제(targeting agent).
- 포유류 내에서 종양 세포에 모이어티를 선택적으로 전달하는 방법에 있어서,제34항의 표적화제를 상기 포유류에 투여하는 단계; 및복합체가 상기 종양 세포에 도달하고 항체가 상기 종양 세포에 결합하도록 충분한 시간을 할애함으로써 포유류 내의 종양 세포에 상기 모이어티를 선택적으로 전달하는 단계를 포함하는 방법.
- 항체/단백질 복합체를 형성할 수 있는 충분한 시간 및 조건 하에서, 제1항의 단일 클론 항체와 단백질 함유 샘플을 접촉시키는 단계;만약 있다면 상기 샘플로부터 상기 복합체를 제거하는 단계; 및상기 복합체로부터 상기 단백질을 제거하여 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 단백질 분리 방법.
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